协同调控水稻对干旱及稻瘟病抗性的脱落酸受体OsPYL2基因及其应用

al.biosynthesis of abscisic acid in fungi: identification of a sesquiterpene cyclase as the key enzyme in botrytis cinerea.environ microbiol.2018, 20(7):2469-2482；takino j,kozaki t,sato y,et al.unveiling biosynthesis of the phytohormone abscisic acid infungi:unprecedented mechanism of core scaffold formation catalyzed by an unusual sesquiterpene synthase. j am chem soc.2018,140(39):12392-12395)。植物利用类胡萝卜素途径合成aba，被称为“间接途径”，研究表明间接途径是植物体内脱落酸最主要的合成途径(arc e,sechet j,rajjou l,et al.aba crosstalk withethylene and nitric oxide in seed dormancy and germination.front plant,2013,4(63):63)。20世纪60年代初，脱落酸(aba)首次被鉴定为一种生长抑制剂，它在棉花脱落果实和桑树叶片中积累，使植物在光周期性诱导下进入休眠(wasilewska a,vlad f,sirichandra c,et al.an update on abscisic acid signaling in plants andmore.molecular plant,2008,1(2):198-217)。脱落酸(aba)作为一种典型的植物激素，参与调控从种子萌发到种子发育的几个生理过程，以及应对各种生物及非生物胁迫的反应(jiang c j,shimono m,sugano s,etal.abscisic acid interacts antagonistically with salicylic acid signaling pathway in rice-magnaporthe griseainteraction.molecular plant-microbe interactions,2010,23(6):791-8；finkelstein r.abscisic acid synthesis andresponse.arabidopsis book,2013,11(e0166):e0166-e)。水分缺失引起的aba积累增加在植物的抗旱性中起着重要作用(iuchi s,kobayashi m,taji t,et al.regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,a key enzyme in abscisic acid biosynthesis in arabidopsis.plant journal forcell&molecular biology,2010,27(4):325-33；wang y,ying j,kuzma m,et al.molecular tailoring offarnesylation for plant drought tolerance and yield protection.plant journal,2005,43(3):413-24)。近年来，植物分子生物学的研究人员致力于揭示植物如何通过产生脱落酸(aba)调控基因表达，关闭气孔，进行渗透调节，从而促进植物的适应性生长以应对干旱胁迫(gong z,xiong l,shi h,et al.plant abiotic stress responseand nutrient use efficiency.science china life sciences,2020,63(5):635-674)。
4.20世纪80年代以来，研究人员在发现脱落酸受体方面做出了重大努力，最终于2009年发现了脱落酸受体的pyr/pyl/rcar家族(park sy,fung p,nishimura n,et al.abscisic acid inhibits type 2c proteinphosphatases via the pyr/pyl family of start proteins.science.2009,324(5930):1068-71；qibin ma x d,maq,dai x,et al.enhanced tolerance to chilling stress in osmyb3r-2transgenic rice is mediated by alterationin cell cycle and ectopic expression of stress genes.plant physiology,2009,150(1):244-56)。在拟南芥中， pyr/pyl/rcar家族由14个成员组成，属于脂溶性配体结合蛋白的sart结构域超家族。当aba未结合时，pyr1、pyl1和pyl2形成同型二聚体，而当与aba结合时，所有成员成为单体(miyazono k, miyakawa t,sawano y,et al.structural basis of abscisic acid signalling.nature.2009,462(7273):609-14； santiago j,dupeux f,round a,et al.the abscisic acid receptor pyr1 in complex with abscisic acid.nature, 2009,462(7273):665-8)。自从在拟南芥
中发现aba受体pyl家族以来，aba受体也在不同作物中被鉴定。生物信息学分析表明，水稻基因组编码10-13个pyl家族aba受体，其中ospyl1、ospyl2和ospyl 为二聚体(miao c,xiao l,hua k,et al.mutations in a subfamily of abscisic acid receptor genes promote ricegrowth and productivity.proc natl acad sci u s a.2018,115(23):6058-6063；tian x,wang z,li x,et al. characterization and functional analysis of pyrabactin resistance-like abscisic acid receptor family in rice. rice,2015,8(1):28)。
5.近些年来，研究人员们接连通过过表达或突变的方法来验证aba受体的功能。在拟南芥中，过表达 atpyl5的转基因拟南芥经干旱处理后蒸腾速率降低，水分流失减少，表明atpyl5的过表达提高了转基因植株对干旱胁迫的适应性，使其在严重干旱胁迫下存活(quan w,hu y,mu z,et al.overexpression ofatpyl5 under the control of guard cell specific promoter improves drought stress tolerance in arabidopsis.plantphysiology and biochemistry,2018,129:150-157)。在水稻中，ospyl10过表达的转基因植株在苗期低温胁迫下的存活率显著高于野生型植株，干旱胁迫条件下失水量减少，表明ospyl10的过表达通过上调aba 合成基因来促进aba的积累，提高了籼稻的耐旱性和抗寒性(verma rk,santosh kumar vv,yadav sk,et al. overexpression of aba receptor pyl10 gene confers drought and cold tolerance to indica rice.front plantsci.2019,10:1488)。另有研究发现，过度表达ospyl/rcar7的转基因水稻既不表现出aba敏感性，也不表现出渗透胁迫耐受性，但表现出耐旱性。过表达ospyl/rcar7的转基因植株表现出与野生型相似的表型，在正常生长条件下在稻田中生长时没有总产量损失，此结果也为不影响作物生长而提高抗旱性的新策略奠定了基础(bhatnagar n,kim r,han s,et al.ectopic expression of ospyl/rcar7,an aba receptorhaving low signaling activity,improves drought tolerance without growth defects in rice.int j mol sci. 2020,21(11):4163)。
6.脱落酸通过胞内受体pyls的细胞识别在植物中发挥作用。pyl与aba具有不同的结合特性，并选择性地与pp2c相互作用(peterson f c,burgie e s,park s y,et al.structural basis for selective activation ofaba receptors.nat struct mol biol.2010,17(9):1109-13；ma y,szostkiewicz i,korte a,et al.regulators ofpp2c phosphatase activity function as abscisic acid sensors.science.2009,324(5930):1064-8)。在没有aba与 pyl受体结合的情况下，pp2c与aba调节的snrk2家族激酶相互作用并抑制其活性；在aba存在下， pyl受体与aba结合，与pp2cs相互作用，抑制pp2cs的活性，从而解除pp2cs对snrk2活性的抑制 (weiner j j,peterson f c,volkman b f,et al.structural and functional insights into core aba signaling. current opinion in plant biology,2010,13(5):495-502)。活化的snrk2s磷酸化下游靶点，如脱落酸反应元件(abres)/脱落酸结合因子(abf)/bzip转录因子的abi5分支和其他促进aba诱导的生理反应的调节蛋白。snrk2激酶磷酸化其靶蛋白以调节气孔关闭和相关基因表达(fujii h,verslues p e,zhu j k. identification of two protein kinases required for abscisic acid regulation of seed germination,root growth,andgene expression in arabidopsis.plant cell.2007,19(2):485-94)。因此，pyls、pp2cs和
snrks构成了核心 aba信号模块，此模块在具有非生物胁迫耐受性的陆地植物中高度保守(qi h,ping y,li w,et al.themolecular basis of aba-independent inhibition of pp2cs by a subclass of pyl proteins.molecular cell.2011, 42(5):662-72；kim n,moon s j,min m k,et al.functional characterization and reconstitution of aba signalingcomponents using transient gene expression in rice protoplasts.front plant sci.2015,6:614)。除了传统的aba 相关核心信号调节通路外，pyr/pyl/rcar还可与信号通路中其他蛋白直接相互作用，调控aba信号通路或参与植物的生长发育及胁迫应答。有酵母双杂交试验显示，pyl6与ja应答的关键转录因子myc2 存在相互作用，并且这种相互作用会在aba存在时加强，两者之间的相互作用也连接了aba和ja(茉莉酸)信号途径，而ja信号途径是在植物抗病反应信号网络中的重要组成部分。(aleman f,yazaki j,lee m, et al.an aba-increased interaction of the pyl6 aba receptor with myc2 transcription factor:a putative linkof aba and ja signaling.sci rep.2016,6:28941)。因此，以上结果也为ospyl2协同调控水稻对干旱及稻瘟病抗性的研究奠定了基础。
7.迄今为止，尚未见到ospyl2基因在超量表达协同调控水稻对干旱及稻瘟病抗性中的应用。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一个协同调控水稻对干旱及稻瘟病抗性的脱落酸受体基因ospyl2。该基因是基于拟南芥同源序列比对以及水稻干旱胁迫基因表达差异分析，从水稻基因组中克隆得到。ospyl2基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.本发明的另一个目的提供了一个脱落酸受体基因ospyl2在参与水稻干旱及稻瘟病胁迫抗性中的应用。通过遗传转化，使seq id no：1所示的序列或与其功能等同的同源基因在水稻植株中超量表达或敲除突变表达。本发明基因编码的蛋白质序列如seq id no：2所示，以该蛋白来达到调控水稻对干旱及稻瘟病胁迫抗性的目的，从而应用于水稻抗旱及抗病品系的培育，同时可作为抗旱及抗病水稻的标记基因。
10.本发明通过对水稻pyl基因家族进行干旱胁迫诱导表达模式分析，筛选得到一个显著诱导上调表达的基因ospyl2。利用农杆菌介导的遗传转化方法在水稻中超量表达或敲除该基因，发现超量表达该基因的转基因材料对干旱及稻瘟病的抗性增强，而突变材料则对干旱及稻瘟病更敏感。由此表明，ospyl2基因是水稻对干旱及稻瘟病抗性响应的正调控因子。此外，本发明还涉及含有该基因或者其同源基因片段的载体以及涉及该基因或其功能类似物增强植物对干旱和稻瘟病抗性在农业育种中的应用。
11.本发明的技术方案如下所述：
12.申请人克隆得到一种调控水稻抗旱的脱落酸受体基因ospyl2，其核苷酸序列如seq id no:1所示。
13.上述调控水稻抗旱的脱落酸受体基因ospyl2编码的蛋白质序列如seq id no:2所示。
14.本发明涉及的ospyl2基因在调控水稻抗旱及抗稻瘟病中的应用。
15.更详细的技术方案如下所述：
16.申请人前期的研究是利用rt-qpcr方法分析水稻pyl基因家族受干旱诱导的表达模式，根据基因诱导表达情况，最终确定研究目的基因为ospyl2(见图1中的a图)。
17.从粳稻品种“日本晴”中提取叶片rna，利用反转录酶superscriptⅲ(购自invitrogen公司,美国)，将其反转录合成cdna。反应条件：65℃5min，50℃60min，70℃10min。利用水稻基因组信息，合成扩增引物：正向引物pyl2-full-f:(5'agaggtcgatcagaaatcaatggag 3')和反向引物 pyl2-full-r:(5'aagaagtgacaaataacacgaca3')扩增出ospyl2基因的cdna全长(624bp)。 pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec，72℃50sec，28个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的pcr产物连入pgem-t载体(购自promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因orf，其序列为seq id no:1所示的核苷酸序列，编码207个氨基酸序列(seq id no:2所示序列)。对氨基酸序列进行同源比对分析发现，ospyl2与来源于二穗短柄草的bdpyl2基因同源度最高，其次是来源于高粱(sorghum bicolor)的sbpyl2基因(见图1中的b图)。
18.本发明分别构建了该基因的超量表达载体pu1301-pyl2-flag(简称：oe-pyl2)(载体结构见图2中的a图)和prgeb32-crispr/cas9-pyl2(简称：cri-pyl2)基因敲除载体(载体构建策略见图2中的b图)，申请人利用农杆菌介导的遗传转化方法将这两个载体分别转化到粳稻品种“日本晴”中，得到该基因的超表达的阳性株系和敲除阳性株系，检测其表达量并选取表达量符合的2个t1代超表达株系(编号为 oe-pyl2-24、oe-pyl2-26，表达量见图3中的a图)及2个双靶点敲除转化株系(在双靶位点上下游设计检测引物，扩增出相应的片段并进行测序，筛选靶标位点发生基因编辑，造成大片段缺失或者翻译提前终止的材料进行后续试验，最终选择编号为cri-pyl2-9和cri-pyl2-22的两个提前终止的株系,序列改造见图 3中的b图)，作为后续试验的材料。
19.本发明对ospyl2转基因材料(超量表达株系和双靶点敲除突变株系)(双靶点敲除载体构造方法有别于一般公司所用的双启动子启动双靶点方式，而是借鉴于华中农业大学谢卡斌教授研究团队的多个 trna串联靶点方式(文献参见：和玉兵，水稻crispr/cas9体系构建及ospida基因功能研究.华中农业大学图书馆.2017)；crispr/cas9突变株系的培育方法和选择标准是公知的方法，是转基因的方法之一，该突变体并非偶然得到，而是利用crispr/cas9技术(体系，载体质粒)创造的，crispr/cas9是目前进行基因编辑的常用技术方法，实际上也是通过转基因获得的生物材料途径之一)进行干旱抗性鉴定，发现与对照材料相比，ospyl2超量表达材料对干旱胁迫抗性明显提高，pyl2突变体对干旱更加敏感(图4)。在干旱胁迫10d后，脱落酸通路相关响应基因osabf5、osrd22、osareb8、osareb2、osdreb1b、 osdreb1f的表达水平在ospyl2超量表达材料中显著高与于对照材料(图5)。由此可见，ospyl2正调控水稻对干旱胁迫的抗性。之后进行稻瘟病接种鉴定，发现与对照材料相比，ospyl2超量表达材料对稻瘟病抗性明显提高，pyl2突变体更感稻瘟病菌(图6)。由此可初步推测，ospyl2正调控水稻对稻瘟病的抗性。
20.本发明的优点：
21.(1)本发明通过对水稻pyl基因家族受干旱诱导表达模式进行分析，从中筛选并鉴定得到ospyl2 基因，同时发现ospyl2是水稻抗旱及抗病的正调控调控因子。通过遗传转化，超量表达该基因获得抗旱及抗病的水稻新品系，也可以作为水稻抗性材料筛选的标志基因。
22.(2)目前对水稻中pyl基因的研究报道还很少，也很少有文献支撑水稻pyl基因能够参与到协同调控抗旱及抗病中，本发明克隆的ospyl2基因丰富了水稻中对这类功能基因的研究。
23.(3)超量表达ospyl2的水稻对干旱及稻瘟病胁迫抗性显著增强，而pyl2突变体则对干旱和稻瘟病更敏感。这表明ospyl2基因参与了水稻对干旱及稻瘟病的抗性响应，并扮演着重要的角色。通过提高 ospyl2基因的表达量能够调节水稻体内抗性因子的积累，从而提高水稻对干旱及稻瘟病的抗性。
24.(4)选育抗旱和抗稻瘟病的水稻材料一直为水稻育种家所重视，由于目前生产上干旱及稻瘟病造成的水稻产量损失巨大，选育抗旱和抗病的品种显得尤为重要，应用ospyl2基因将有助于培育抗旱及抗病兼顾的水稻新品种。
附图说明
25.图1：ospyl2诱导表达模式以及进化树分析图。附图标记说明：图1中的a图为ospyl2在野生型 (即非转基因)“日本晴”水稻进行干旱胁迫后，与对照相比，受到明显的诱导表达。图1中的b图为ospyl2 进化树分析。选取其他有代表性植物进行进化树分析和生物信息学分析，结果表明ospyl2序列与二穗短柄草(brachypodium distachyon)bdpyl2序列同源性最高，其次是高粱(sorghum bicolor)sbpyl2序列。
26.图2：ospyl2超表达载体和双靶点敲除重组载体构建。附图标记说明：图2中的a图是 pu1301-pyl2-flag超量表达载体结构示意图。图2中的b图是prgeb32-crispr/cas9-pyl2基因敲除载体后的载体结构示意图。
27.图3：转基因后代的检测结果。附图标记说明：图3中的a图是ospyl2超量表达材料(t1代)表达量的检测结果和播种筛选结果。在结果中选择符合3：1分离比的oe-pyl2-24(上调2194.274273倍) 和oe-pyl2-26(上调855.0824713倍)两个中高表达水平株系进行后续研究。图3中的b图和c图是pyl2 突变体基因编辑类型检测。选择cri-pyl2-9和cri-pyl2-22两个翻译提前终止的突变体株系进行后续的研究。
28.图4：对照材料与转基因材料干旱抗性的鉴定。附图标记说明：图4中的a图为处理前野生型(即非转基因)水稻材料和转基因水稻材料的植株形态。图4中的b图为对照材料和转基因材料干旱胁迫10d 后的表型观察。结果表明，与对照材料相比，ospyl2超量表达为更抗旱，而pyl2突变体则对干旱更加敏感。
29.图5：对照材料与转基因材料干旱胁迫处理10d后脱落酸通路相关基因表达量分析。附图标记说明：图5干旱胁迫10d后，脱落酸通路相关响应基因osabf5、osareb8、osareb2、osdreb1b、osdreb1f、 osrd22等在野生型(即非转基因)材料以及转基因材料中表达水平的检测结果。图5中的a图-f图的结果表明，相对于野生型，脱落酸通路相关响应基因osabf5、osareb8、osareb2、osdreb1b、osdreb1f、 osrd22等基因的表达水平在ospyl2超表达植株中被显著上调，而在敲除材料中显著下调表达。
30.图6：对照材料与转基因材料对稻瘟病菌的抗性鉴定。附图标记说明：图6中的a图为接种前野生型水稻(即非转基因)材料和转基因水稻材料的整株形态。图6中的b图为对照材料和转基因材料接种稻瘟病菌5d后的叶片取样的表型观察。结果表明，与对照材料相比，ospyl2超量表达更抗稻瘟病，而 pyl2突变体则为更感稻瘟病。
具体实施方式
31.对序列表的序列的说明
32.seqidno：1是本发明克隆的ospyl2基因的核苷酸序列。
33.seqidno：2是ospyl2基因编码的蛋白质序列。
34.实施例1：ospyl2基因的分离与克隆
35.(1)水稻rna提取与反转录
36.从野生型粳稻品种“日本晴”(一个公开应用和报道的水稻材料)新鲜叶片中提取总rna，采用植物rna提取试剂盒(minibestplantrnaextractionkit)提取总rna，使用方法参照takaraprimescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser说明书。将获得的rna样品首先进行消除基因组dna反应，去除dna反应液体系：2.0μl5
×
gdnaeraserbuffer，1.0μlgdnaeraser,1.0μgrna,6.0μlrnasefreeddh2o，混匀后，在42℃干浴锅中反应2min；取出消化后的混合液进行反转录反应。反应体系：1.0μlprimescriptrtenzymemixi，4.0μlrtprimermix，4.0μl5
×
primescriptbuffer2，1.0μlrnase-freeddh2o，10.0μl消化后混合液。反转录反应条件：37℃，15min；85℃，5sec，4℃保存。
37.(2)ospyl2基因受干旱胁迫诱导表达模式分析
38.为了探究ospyl2基因是否参与了水稻的抗旱过程，本发明采用rt-qpcr的方法检测野生型水稻在进行干旱胁迫后ospyl2基因转录水平上的相对表达量变化，结果表明ospyl2基因显著受到干旱胁迫诱导上调表达。野生型“日本晴”水稻属于粳型常规水稻，待其生长至4叶期时，进行干旱胁迫试验。胁迫试验后取处理株系的叶片抽提总rna，经反转录成cdna作为模板。设计ospyl2特异引物正向引物qospyl2-f(5’agcaccgcctccgcaact3’)和反向引物qospyl2-r(5’tcggtgaacatcctggtgtcct3’)，利用水稻内源肌动蛋白actin(基因登录号ak101613)作为内参基因，设计正向引物actin-f(5’gagaccttcaacacccctgcta-3’)和反向引物actin-r(5’atcaccagagtccaacacattacct3’)。采用实时定量rt-qpcr分析试剂盒(geeenpcrmastermix，参照试剂盒使用说明书操作)，在bio-radcfxconnect(bio-rad公司制造)荧光定量pcr仪上进行反应。结果显示，ospyl2显著受到干旱诱导上调表达，暗示ospyl2可能参与水稻对干旱的抗性响应。(3)ospyl2基因序列的获得
39.利用正向引物pyl2-full-f:(5'agaggtcgatcagaaatcaatggag3')和反向引物pyl2-full-r:(5'aagaagtgacaaataacacgaca3')，用粳稻“日本晴”的cdna作模板克隆得到ospyl2的全长序列。pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec，72℃50sec，28个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的pcr产物连入pgem-t载体(购自promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，将阳性菌株保存在-80℃。获得所需的ospyl2基因的开放阅读框(orf)，其核苷酸序列如seqidno：1所示。通过blastx(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定ospyl2基因的开放阅读框(orf)所对应的207个氨基酸，由此推测ospyl2基因编码的蛋白质序列如序列表seqidno：2所示。
40.实施例2：ospyl2基因超量表达以及双靶点敲除载体的构建
41.(1)ospyl2基因超量表达载体的构建
42.为了验证opyl2的基因功能，申请人构建了超量表达载体来转化“日本晴”胚性愈伤组织。以实施例1中得到的ospyl2阳性克隆的质粒为模板，设计超表达引物，使用primerpremier5软件设计ospyl2基因带超量表达载体载体接头的正反引物(ospyl2-flag-f:g
aacgatagccggtaccatggaggcgcacgtggagag；ospyl2-flag-r: ctttgtaatcggatccgtcgcgccgccgcgaagcag)，进行pcr扩增。利用同源重组酶将带接头的 ospyl2目的基因和双酶切后线性化的pu1301-3
×
flag载体进行infusion连接，得到重组载体 (pu1301-pyl2-flag)，具体的反应体系为：1.0μl双酶切后线性化pu1301-3
×
flag载体，1.0μl 5
×
ce
ꢀⅱ
buffer，0.5μlexnaseⅱ同源重组酶，0.8μl带载体接头ospyl2的pcr产物，用无菌ddh2o补足体积至5.0μl。37℃反应0.5h后，用大肠杆菌dh5α进行热激转化，具体转化步骤为：将-80℃保藏的大肠杆菌dh5α感受态细胞冰浴溶化，向5μl连接反应中加入50μl感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置15-30min；冰浴结束后，42℃水浴90sec，然后迅速置于冰上3min；加入400μl lb液体培养基，于37℃，200rpm，复苏培养45min；复苏完成后，5000rpm，离心2min，弃上清300μl，用剩余上清重悬菌体；将菌液均匀涂在lb的固体培养基(添加50mg/l卡那霉素)上，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆，选择2-3个阳性克隆测序，保存没有任何突变的菌株及相应质粒，将重组质粒命名为pu1301-pyl2-flag。将测序正确的重组质粒pu1301-pyl2-flag通过冻融法转入根癌农杆菌eha105感受态，挑取单菌落于yep液体培养基 (yep液体培养基为常用培养基，本实施例中添加了30mg/l的抗生素利福平和50mg/l的卡那霉素)，在 28℃振荡培养36-48h，pcr检测后，将阳性菌株加适量甘油于-80℃保存备用。
43.(2)ospyl2基因双靶点敲除载体的构建
44.本实施例参照双靶点敲除载体的构建方法(文献见：华中农业大学谢卡斌教授研究团队开创的trna 串联法)的基础上加以调整。使用primerpremier5软件设计构建载体所需引物，以ptgr质粒做模板，进行三组pcr扩增，得到三个短片段pcr产物。合成接头引物pyl2-grna1-u3f (5’gcagcttcggcaacccgcaggttttagagctagaa 3’)，pyl2-grna1-u3r(5
’ꢀ
ctgcgggttgccgaagctgctgcaccagccgggaa3’)，pyl2-grna2-u3f(5
’ꢀ
cgtcgtcggcggccagcaccgttttagagctagaa3’)，pyl2-grna2-u3r(5
’ꢀ
ggtgctggccgccgacgacgtgcaccagccgggaa 3’)，以及grna连入表达载体prgeb32所需的接头引物s5ad5-f(5’cagatgatccgtggcaacaaag3’)和s5ad5-r(5’tttctagctctaaaacaaaa3’)； l5ad5-f(5’cagatgatccgtggcaacaaagcaccagtggtctag3’)和l5ad5-r(5
’ꢀ
tttctagctctaaaacaaaaaaaaaagcaccgactcg3’)。以pgtr质粒为模板，用l5ad5-f/ pyl2-grna1-u3r、pyl2-grna1-u3f/pyl2-grna2-u3r、pyl2-grna2-u3f/l5ad5-r三对引物进行 pcr扩增。pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec，72℃30sec，26个循环；72℃延伸7min。将得到的3个rcr产稀释20-50倍后，等体积混匀。取1μl上述混合物为模板，用 s5ad5-f/s5ad5-r引物对进行扩增。pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec， 72℃45sec，26个循环；72℃延伸7min。将所得的产物(即串联两个grna的dna片段)进行纯化回收，并测定浓度；将crispr/cas9表达载体prgeb32用bsai进行酶切，将酶切产物进行纯化回收，得到线性化的prgeb32载体。利用infusion重组的方法，将纯化的pcr产物连入到线性化的prgeb32载体中。具体反应条件：pcr产物100ng,线性化的prgeb32载体50-80ng，infusion酶(takara)1μl， 10
×
infusion buffer 1μl，加ddh2o至10μl，50℃反应30min。将上述反应产物热激转化大肠杆菌dh5α，挑单克隆进行阳性检测并测序，保存阳性菌株和质粒，并将阳性质粒转化根癌农杆菌eha105感受态。挑取单菌落于yep液体培养基(yep液体培养基为常用培养基，本实施例中添加了30mg/l的利福平和50 mg/l的卡那霉素),28℃振荡培养36-48h，pcr检测后，阳性菌株加适量甘油于-80℃保存备用。本实施例中涉及的载体pgtr和prgeb32为华中农业大学谢
卡斌教授惠赠(文献参见：和玉兵，水稻crispr/cas9 体系构建及ospida基因功能研究.华中农业大学图书馆.2017)。
45.实施例3：水稻的遗传转化
46.(1)诱导愈伤组织：提前准备无菌的愈伤组织诱导培养基(相关培养基配制见后描述)，100ml的三角瓶中倒入40-50ml的诱导培养基。将水稻种子(品种为“日本晴”)剥掉颖壳，在超净工作台中进行无菌操作，先用75％乙醇溶液浸泡种子1min，再用0.1％hgcl2溶液浸泡种子15-20min，最后用无菌水洗涤5-10次。每瓶培养基接种8-12粒种子，于28℃暗培养，40-50天诱导愈伤组织的产生；
47.(2)继代培养：提前2-3天配制继代培养基，继代培养基配方采用新鲜的愈伤组织诱导培养基。按常规方法对培养基进行灭菌，使培养基适度干燥(湿度太大的培养基不利于愈伤组织的生长)。从诱导的愈伤组织中，挑选外观淡黄色，颗粒状，干燥，活力强的愈伤组织转入继代培养基中，28℃暗培养20d；
48.(3)预培养：提前用500ml三角瓶分装无菌预培养培养基，试验前每250ml培养基中加入300μl 100 mm乙酰丁香酮，5ml 40％葡萄糖，混匀后，每瓶装8-10皿培养基；从继代的愈伤组织中，挑取外观为淡黄色，颗粒状，干燥，且活力强的愈伤组织转入预培养培养基的培养皿中，每个皿接种60-80块左右，绿豆大小的愈伤组织，愈伤组织较大可用无菌镊子夹碎，于8℃暗培养3d；
49.(4)侵染与共培养：试验前2d，将含有目的基因(如ospyl2)的农杆菌菌株在含有抗生素(30mg/l 利福平和50mg/l卡那霉素)的平皿上划线，活化。准备悬浮培养基(100ml/菌株)，共培养基(250ml/ 菌株)，大平皿，小平皿(里面垫有吸水纸和滤纸，使用前灭菌并烘干)，准备250ml无菌三角瓶若干。将划线培养的农杆菌刮入1/2n6悬浮培养基中(n6培养基是常用的植物组织培养用的培养基，加入100 μl as 2ml 50％葡萄糖)，于28℃，200rpm，培养30min。摇菌同时将预培养的愈伤组织收集到250ml 无菌三角瓶中。将农杆菌菌液倒入愈伤组织中，浸泡30min。倒去菌液，先将装有愈伤组织的三角瓶倒置于无菌小皿上，吸干菌液，再把愈伤组织铺在无菌大皿的滤纸上，上面盖一张滤纸，用灭菌镊子轻压愈伤组织，吸干表面菌液，自然干燥3-4h。将充分干燥的愈伤组织用灭菌的勺子均匀的铺到共培养基上(铺上之后最好不要再挪动，以减少培养基与愈伤组织表面的接触，防止农杆菌的过度生长)，于19℃暗培养3 d。
50.(5)水洗与第一次筛选(简称s1)：准备无菌水，大皿，小皿(含有吸水纸和滤纸)，250ml三角瓶若干，配制筛选培养基；将共培养后的愈伤组织转移至水洗杯中，倒入灭菌蒸馏水至完浸没愈伤组织，盖上盖子振荡20-30sec，倒掉灭菌蒸馏水。如此重复2-3次。加入灭菌蒸馏水至完全浸没愈伤组织，盖上盖子摇晃混匀，振荡20-30sec，静置5min，倒掉灭菌蒸馏水。加入灭菌蒸馏水至完全浸没愈伤组织，盖上盖子摇晃混匀，振荡20-30sec，静置10min。最后倒掉灭菌蒸馏水，加入含500mg/l羧苄青霉素的灭菌蒸馏水，200rpm摇晃30min。倒掉蒸馏水，自然干燥愈伤。将处理后愈伤组织转移至筛选培养基中，28℃暗培养20d；
51.(6)第二次筛选(简称s2)：制备筛选培养基，每250ml培养基中加入300μl羧苄青霉素，250μl潮霉素，5ml 50％葡萄糖，倒皿后应在超净工作台上开盖用无菌风吹1.5-2h，筛选培养基表面不宜太湿，否则筛选时不利于农杆菌的抑制和抗性愈伤组织的生长；从s1筛选培养基上挑选干燥的、没有农杆菌污染的愈伤，摆放在s2培养基上(每皿接种25到30块愈伤
组织)，28℃暗培养20d；
52.(7)愈伤组织的分化：提前3-4d准备分化培养基。挑选淡黄色，致密，干燥的抗性愈伤组织小块，接种到分化培养基中，于28℃光照(光照强度3000lux)培养40d，在培养后期会分化出幼苗。
53.(8)生根培养：提前2-3d准备生根培养基。准备灭菌空皿4-5个；将分化出的苗子从分化培养基中拔出，一块愈伤只取一棵，用剪刀剪去过长的叶子和根，接入生根管内，每根管内接入1-2株幼苗；在光培养室 (光照强度3000lux)培养15-20d，等根生长充分后，炼苗4-7d，然后移栽到温室。
54.本发明的实施例中涉及的水稻遗传转化的专用培养基配方及其配制方法：
55.培养用母液的配方：
56.(1)msmax储备液(10x)
[0057][0058]
(2)msmin储备液(100x)
[0059][0060][0061]
备注：na2moo4必须单独溶解，再与其它组分混合，之后将储备液加蒸馏水定容至1000ml，室温下保存、备用。
[0062]
(3)n6max储备液(10x)
[0063]
[0064]
(4)n6min储备液(100x)
[0065][0066]
用蒸馏水定容至1000ml，室温下保存。
[0067]
(5)fe
2 -edta储备液(100x)
[0068]
往一个试剂瓶中加入300ml蒸馏水和feso4·
7h2o 2.78g；
[0069]
往另一试剂瓶中加入300ml蒸馏水，并加热到70℃，然后加入na2edta
·
2h2o 3.73g，溶解好后，将两个试剂瓶中的溶液混合，在70℃保温2小时，然后加蒸馏水定容至到1000ml，4℃避光保存。
[0070]
(6)维生素(vitamin)储备液(100x)
[0071][0072]
(7)aamax储备液(10x)
[0073][0074][0075]
(8)aamin储备液(100x)
[0076][0077]
将na2moo4单独溶解，然后与其它组分混合并加蒸馏水定容到1000ml，室温下避光
保存。
[0078]
(9)6-苄基氨基嘌呤(6-ba)储备液(1mg/ml)
[0079]
取6-ba100mg，加入1.0ml1mkoh振摇至6-ba溶解，然后加蒸馏水定容到100ml，室温下保存。
[0080]
(10)激动素(kt)储备液(1mg/ml)
[0081]
取kt100mg；加入1.0ml1mkoh振摇至kt溶解，然后加蒸馏水定容至100ml，室温下保存。
[0082]
(11)2,4-d储备液(1mg/ml)
[0083]
取2,4-d100mg，加入1.0ml1mkoh振摇5min，然后加10ml蒸馏水并振摇至2,4-d溶解，用蒸馏水定容至100ml，室温下保存。
[0084]
(12)100μmas储备液
[0085]
as0.196g；
[0086]
dmso10ml；
[0087]
用1.5ml离心管分装，4℃保存。
[0088]
(13)吲哚乙酸(iaa)储备液(1mg/ml)
[0089]
取iaa100mg，加入1.0ml1nkoh振摇至iaa溶解，然后用dh2o定容至100ml，室温避光保存。
[0090]
(14)萘乙酸(naa)储备液(1mg/ml)
[0091]
取naa100mg，加入1.0ml1mkoh振摇至naa溶解，再用蒸馏水定容至100ml，室温避光保存。
[0092]
培养基配方：
[0093]
(1)诱导培养基
[0094][0095]
(2).继代培养基
[0096]
(3)预培养培养基
[0097][0098]
(4)共培养培养基
[0099][0100]
(5)悬浮培养基
[0101][0102]
(6)筛选培养基
[0103]
[0104][0105]
(7)分化培养基
[0106][0107]
(8)生根培养基
[0108]
[0109][0110]
实施例4：转基因材料的抗旱性鉴定
[0111]
(1)转基因水稻材料的培养：挑选颗粒饱满，形态一致的t1代超表达株系、敲除株系与野生型“日本晴”三个株系的种子，用手剥去颖壳，保证颗粒完整性。将种子置于灭菌小锥形瓶，用75％乙醇浸泡水稻种子 1min后，倒去75％乙醇，然后用0.15％hgcl2溶液浸泡15～20min，将hgcl2溶液倒入到升汞回收瓶，最后用灭菌ddh2o清洗种子7～8次后，将种子在滤纸上吸干水分后，均匀地铺平在提前3d准备好的ms 培养基上，放入恒温光照培养箱。培养条件设置为28℃，光照强度300μmol
·
m-2
·
s-1
，14h光照/10h 黑暗，相对湿度70％。当水稻幼苗第一片真叶平展时，将幼苗转移到水稻营养液中，培养至三叶期，其他条件不变。
[0112]
(2)转基因材料苗期抗旱性的鉴定：准备若干装满蛭石的营养钵，确保蛭石不会漏出而又不会影响营养钵的吸水和排水。将t1代超表达株系、敲除株系与野生型“日本晴”三个株系的种子同期用ms培养基发芽，待胚根和胚芽长出后，将其用镊子取出。将胚根和胚芽差不多大小的种子移栽到装有纯蛭石的营养钵中，将营养钵放置在盆中，用水稻营养液培养，浇营养液时将营养液倒入水盆让蛭石自然吸取，在温室培养到4叶期时，断水处理7～10d，观察表型。
[0113]
实施例5：对转基因材料稻瘟病菌的接种鉴定
[0114]
(1)西红柿燕麦培养基(编号om)的配制：将水煮至沸腾，称取40g燕麦片，加入至沸水中煮30min，过滤取汁；鲜榨西红柿汁150ml，加入到燕麦汁中，加水定容至1l，添加1.6％琼脂(agar)；常规高温高压灭菌。用于稻瘟菌产孢的培养基，需在在1l培养基中加入0.6g caco3。
[0115]
(2)稻瘟病菌菌株的纯化与保存：在超净工作台里用移液器将稻瘟病菌的分生孢子液涂在1.6％水琼脂板上，置于28℃培养箱，温育12h后，在解剖镜下用挑针挑取萌发的单个分生孢子，点接在om平板上，置于28℃培养箱。温育2-3d后，将单个分生孢子萌发形成的菌丝转移到新的om平板上，这些单孢纯化的菌株可用于后续试验。将待保存菌株的菌丝块点接到已铺有灭菌滤纸片的om平板上，置于28℃培养箱中。待菌落长满培养皿后，取出滤纸片，置入灭菌的硫酸纸袋中。将硫酸纸袋置于干燥器中放置一周，转移到密封的容器中，-20℃保存。
[0116]
(3)产孢试验：将野生型稻瘟病菌株p131(该菌株由华中农业大学学植物科学技术学院的黄俊斌教授研究团队研究筛选并惠赠，为本领域常规菌株)点接在om平板上，置于28℃光照培养箱倒置培养。生长 5d后，用涂菌环将菌丝充分打断，均匀地涂布到新的om平板上，置于28℃光照培养箱倒置培养。36h 后用棉签轻轻将肉眼可见新生的气生菌丝洗下，盖上双层纱布，置于28℃光照培养。48h后，用30ml 蒸馏水彻底将ota平板上的分生孢子洗至50ml的离心管中。
[0117]
(4)孢子液接种：用30ml 0.025％吐温溶液将分生孢子从上述培养了5d的om板上洗下，然后经由三层擦镜纸制成的漏斗过滤至50ml离心管中，调节分生孢子浓度至2
×
105个/ml。吸取5-10μl调好浓度的孢子悬浮液，用喷壶均匀喷洒到水稻叶片表面。用封口袋密封接种盒以保温保湿，用黑布遮光培养。 36h后揭去黑布，见光培养(光照强度)，继续保湿培养48h后揭去封口袋，一般接种后5d开始发病。