一株烟草内生娄彻链霉菌及在烟草病害防控中的应用的制作方法

1.本发明属于农业微生物领域，具体涉及一株烟草内生娄彻链霉菌及在烟草病害防控中 的应用。


背景技术：

2.烟草是我国重要的经济作物，但是长期以来由于连作，导致土传病害发生严重，其中， 烟草黑胫病和线虫病是2种重要病害。
3.烟草黑胫病是由烟草疫霉菌(phytophthora nicotianae)引起的根茎类病害，在我国各大 烟区都有发生，每年造成的损失达数亿元，是制约我国烟草优质安全生产的重要因素。烟草 黑胫病的防治措施包括农业防治、抗病品种、化学防治和生物防治
[
等，但抗病品种培育难， 地域性强；化学农药长期大量使用易造成农药残留、环境污染和抗药性等问题。随着绿色 防控理念的提出，环境友好的高效拮抗菌成为防治烟草黑胫病的一项重要措施。
[0004]
近年来，烟草根结线虫(root-knot nematode)病在全国各烟区呈逐年加重的趋势，尤其在 河南、云南、山东、陕西、广西、四川等烟草主产区危害十分严重。烟草根结线虫病是由植 物根结线虫(meloidogyne spp.)引起的，主要危害烟草的根部，严重影响烟草的健康发育。 同时，根结线虫侵染对烟草造成的机械伤口极易诱发多种烟草根茎类病害，如烟草黑胫病、 镰刀菌根腐病、根黑腐病、青枯病等，形成的复合侵染病害导致烟株长势衰弱，抵抗力差， 进而加重烟草多种病害的发生与流行。根结线虫侵染可以诱发和加重烟草其他土传病害的发 生，所以研制出对烟草根结线虫和土传病害具有双重功能的生防制剂具有重要意义。
[0005]
针对上述问题本发明分离出一株新的内生娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117，对烟 草黑胫病和根结线虫均具有良好的防效，同时在烟草根系具有较好的定殖能力。目前已有 关于抑菌作用的内生娄彻链霉菌的报道，例如，zz-9菌株(《娄彻氏链霉菌zz-9菌株发 酵液对小麦幼苗的促生作用》)发酵液对南方根结线虫具有一定的杀虫活性，对尖孢镰刀 菌fusarim oxysporum抑菌率为53.27％。从烟草田分离的l-25菌株(《土传烟草青枯病的 生物防控及其机理研究》)对烟草青枯病病原菌劳尔氏菌ralstonia solanacearum和尖孢镰 刀菌具有良好抑菌活性，yc117菌株对劳尔氏菌无抑菌活性。从烟草根围分离的株 ln204、ln221和ln247 3个菌株(《洛阳烟区烟株根围抗烟草疫霉放线菌的筛选与鉴定 》)对烟草黑胫病病原菌抑菌活性达到100％，yc117对烟草黑胫病病原菌抑菌活性为73.67％。 另外，土传病害的防控不仅与菌株抑菌活性和根系定殖能力有关，也和生防菌剂对根际微生 物群落结构的调控作用及诱导植物本身抗病性等有关，所以同一种类型生防菌的不同菌株在 调控根际微生物群落结构能力和诱导植物本身抗病性等方面也可能存在差异。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种分离的链霉菌，所述链霉菌为娄彻链霉菌yc117，其保藏号 为cctcc no:m20211629。所述链霉菌可用于烟草黑胫病、赤星病、炭疽病和线虫病 等烟草病害的防治。
[0007]
本发明的另一个目的在于提供娄彻链霉菌yc117的在制备植物病原菌抑制剂或是线虫 杀虫剂中的应用，特别是用于制备防治烟草病害药物。
[0008]
为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现：
[0009]
一种分离的链霉菌，从烟草根内分离，经鉴定为娄彻链霉菌streptomyces rochei，已于 2021年12月15日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：娄彻氏链霉菌 streptomyces rochei yc117；保藏编号为cctcc no:m20211629；地点：中国武汉武汉大 学。
[0010]
菌株在isp2培养基上生长良好，气生菌丝颜色白色到灰白色，基内菌丝颜色黄色，可 溶性色素黄色，孢子丝直或柔曲，孢子椭圆形，菌落中央凸起，边缘呈白色放射状(图1)。
[0011]
娄彻链霉菌yc117在制备植物病原菌抑制剂中的应用，所述的植物病原菌为：烟草疫 霉(phytophthora nicotianae)、瓜果腐霉(pythium aphanidermatum)、烟草炭疽菌 (colletotrichum nicotianae)、链格孢菌(alternaria alternata)、核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、和/或灰葡萄胞(botrytis cinerea)。
[0012]
本发明的保护内容还包括，娄彻链霉菌yc117在制备线虫杀虫剂中的应用。
[0013]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0014]
(1)本发明提供了一种淡紫褐链霉菌，该菌株首次被报道可用于同时防治烟草黑 胫病，赤星病、炭疽病和线虫病的防治。与现有杀菌剂和杀虫剂无交互抗药性。
[0015]
(2)与目前使用化学合成农药防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、 不污染环境和不易产生抗药性等优点。
附图说明
[0016]
图1娄彻链霉菌yc117菌株孢子、菌丝和菌落形态示意图。
[0017]
图2娄彻链霉菌yc117固体发酵菌剂示意图。
[0018]
图3娄彻链霉菌yc117抑菌谱。
[0019]
图4娄彻链霉菌yc117菌剂防治烟草黑胫病效果示意图。
[0020]
图5娄彻链霉菌yc117菌剂防治烟草线虫病效果示意图。
具体实施方式
[0021]
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明 的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规 技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0022]
实施例1：
[0023]
娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117的获得及鉴定
[0024]
一株分离的链霉菌，从恩施宣恩县烟草根系内分离得到，经16s rdna结合生理生化鉴 定后属于娄彻链霉菌streptomyces rochei(表1，表2)，已于2021年12月15日送至中
国 典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：streptomyces rochei yc117；保藏编号为cctccno:m20211629；地点：中国，武汉，武汉大学。
[0025]
在本发明中，娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117或被简称为yc117。
[0026]
形态特征：气生菌丝颜色白色到灰白色，基内菌丝颜色黄色，可溶性色素黄色，孢子 丝直或柔曲，孢子椭圆形，菌落中央凸起，边缘呈白色放射状。
[0027]
表1菌株yc117 16s rrna基因测序blast结果
[0028]
[0029][0030]
表2菌株yc117生理生化特性-碳源利用
[0031]
[0032][0033]
：阳性反应；-：阴性反应；w:弱阳性反应
[0034]
实施例2：
[0035]
娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117的发酵：
[0036]
娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117种子液的制备：包括将斜面保存菌种在isp-2平 板活化，挑取接种至100毫升种子培养基中，在28℃，160转/分的摇床上培养4天；即得 种子液。
[0037]
种子培养基配方为：1l培养基中包括20g葡萄糖，8g大豆蛋白胨，0.30g磷酸二氢钾， 0.5g碳酸钙，豆油20μl，其余为水。
[0038]
娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117的固态发酵方法：
[0039]
液体发酵液制备：将娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117种子液按5％量接种于发 酵培养基，温度为30℃，发酵罐的搅拌速度500rpm/min，发酵培养基的装量为罐体容积的 60％，发酵4天。
[0040]
所述的发酵培养基的配方包括：葡萄糖3％、大豆蛋白胨3％、酵母粉0.3％、碳酸钙0.5％、 氯化钠0.5％；ph值7，其余为水。
[0041]
将珍珠岩高温灭菌，将发酵液和珍珠岩均匀混合，混合比例为4ml：1g混合，混合后 平铺于塑料盒中，珍珠岩高度为5cm，发酵温度为30℃，发酵时间为14d；100℃烘干后打 碎备用；所述的珍珠岩的粒径为：3mm-5mm。
[0042]
经珍珠岩基质发酵后，娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117的孢子数为2.5
×
10
10
个孢 子/g(图2)，经分离划线培养，无杂菌，发酵均匀，完全，用于以下实施例；
[0043]
实施例3：
[0044]
娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117的抑菌谱
[0045]
烟草黑胫病病原菌分离自烟草黑胫病植株，瓜果腐霉(pythium aphanidermatum)分离 自黄瓜猝倒病株，2种病原菌10℃保存于v8斜面。
[0046]
烟草炭疽菌(colletotrichum nicotianae)和链格孢菌(alternaria alternata)分离自烟草 炭疽病和赤星病病叶，尖孢镰刀菌(fusarim oxysporum)分离自烟草病株、核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)分离自生产病株、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)分离自水稻纹枯病叶片、 灰葡萄胞(botrytis cinerea)分离自草莓病果。劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)分离自烟 草青枯病株，-20℃保存于甘油管中。将斜面真菌菌株转入pda平板进行活化，30℃培养6d 备用。将yc117菌碟置于pda平板两端，24h后用4mm打孔器接入上述病原菌菌碟，以接 培养基菌碟作为空白对照，病原菌和yc117菌碟距离为25mm。待对照长满平板后统计各处 理和对照菌落直径，并计算抑菌率。
[0047]
抑菌率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]
×
100％
[0048]
劳尔氏菌从甘油管划线得到单菌落后转入nb液体培养基摇床180r/min 37℃震荡培 养48h后备用。将na培养基融化后约45℃后倒入平板，随后加入劳尔氏菌菌液，na和 菌液比例为50:1，并充分混匀。随后用灭菌牛津杯对带菌平板进行打孔，并在孔中加入200 μl yc117发酵液，放入37℃培养48h观察是否产生抑菌圈。结果显示，娄彻链霉菌 streptomyces rochei yc117对劳尔氏菌无抑菌活性。
[0049]
通过离体抑菌试验表明，yc117对烟草疫霉、烟草炭疽菌和链格孢菌等病原菌具有 良好的抑菌活性(表3，图3)。
[0050]
表3 yc117对病原菌抑菌活性
[0051]
[0052][0053]
实施例4：娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117防治烟草黑胫病
[0054]
将烟草种子直播于32孔穴盘，温室常规培养，15d后移栽于育苗钵中，30d后用于盆栽 试验。将烟草疫霉从斜面活化到pda平板，随后在v8平板扩繁，28℃光照培养12d后刷 取孢子，放入4℃冰箱半小时取出，用血球计数板将孢子调整至105孢子/ml。yc1175菌剂 稀释100倍灌根(1克兑100l水)，灌根量20ml/株，24h后接种烟草疫霉孢子，3ml/棵。 处理设3次重复，每个重复15棵苗，清水作为对照，15d后统计对照和处理病情指数，并 计算发病率。
[0055]
烟草黑胫病病情指数分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准(yc/t39-1996)
[0056]
病情指数＝∑(各级植株数
×
级别)/(调查总株数
×
最高代表级别)
×
100。
[0057]
防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100％
[0058]
盆栽生测结果显示yc1175菌剂稀释100倍对烟草黑胫病防效为100％(图4)。
[0059]
实施例5：娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117防治烟草线虫病
[0060]
试验位于湖北省恩施州宣恩县，烟草移栽定植10d后灌根yc117菌剂200倍，每隔10d 灌根一次，200ml/棵，对照灌清水，每个处理3次重复，每个重复40m2，试验共灌根3次， 采收前统计各处理根结指数并计算防效。
[0061]
烟草病害发生情况按gb/23222—2008烟草病虫害分级及调查方法进行调查。
[0062]
根结指数＝∑(各级植株数
×
级别)/(调查总株数
×
最高代表级别)
×
100。
[0063]
防治效果＝(对照根结指数-处理根结指数)/对照根结指数
×
100％
[0064]
试验结果表明，yc117菌剂对烟草根结线虫具有良好的防控效果，防效达62.98％(表 4，图5)
[0065]
表4 yc117菌剂对烟草根结线虫田间防效
[0066]
处理根结指数防效(％)yc11726.7862.98对照72.34-[0067]
实施例6：娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117在烟草根系定殖作用
[0068]
将yc117菌剂用清水配制成0.1亿cfu/ml悬浮液，对照药剂为2亿cfu/g娄彻链霉菌 粉剂(t-203菌株，商品名：)，将其用清水配制成0.1亿cfu/ml悬浮液。将育苗 钵生长40d烟草灌2种娄彻链霉菌菌悬液，20ml/棵，每个处理3次重复，每个重复10株。 15d后从每个重复盆钵中随机挖出5株，剪下根系，用自来水冲洗干净，再用吸水纸吸干 根表水分。剪下须根，在天平上称取1.00g须根样品，将其扎成小捆浸入75％(v/v)的 酒精1-2s，除去根表气泡，然后将其在浓度为1g
·
l-1
的升汞溶液中浸泡2min，取出用无 菌水冲洗5次。放入加有一小勺灭菌石英砂和10ml无菌水的无菌研钵充分研磨，使根内 定殖的链霉菌释放出来。经适当稀释后涂于高氏1号平板上28℃培养，高氏1号培养基倒 皿前加入灭菌k2cr2o7使培养基中k2cr2o7的终质量浓度为80mg/l)。通过与同步培养平 板上的相应链霉菌菌株进行形态比较鉴定后计数，计算出每克根上定殖的链霉菌活菌数(定 殖密度)。
[0069]
试验结果表明，yc117菌株在烟草根系具有良好的定殖能力，15d后在烟草根系定殖密 度为2.3
×
105cfu/g，而t-203菌株在烟草无定殖能力。
[0070]
实施例7：施用娄彻链霉菌streptomyces rochei yc117对烟草水杨酸含量的影响
[0071]
在健康烟叶6叶期，yc117菌剂稀释100倍灌根，20ml/株，对照灌清水，每个处理3 次重复，每个重复5株苗，48h后按照水杨酸含量测试盒(saa-4-q水杨酸含量测试盒)说 明书提取水杨酸，采用高效液相色谱仪在240nm波长下检测水杨酸含量，用已知浓度标准 品制备标准曲线，根据峰面积与浓度的线性关系y＝30.056x 0.915(r2＝0.999 9)计算水杨 酸含量。水杨酸目前被认为是植物产生系统获得抗性的主要信号分子，由水杨酸介导的系统 获得抗性已在拟南芥、烟草、黄瓜等模式植物的转基因植株和突变体植株一系列科学试验中 得到了证实。喷施yc117 48h后，烟叶体内水杨酸含量为7.41μg/g，对照为4.91μg/g，说 明yc117对烟草具有诱导抗性作用。