一种植物内生菌及其发酵产物的制作方法

1.本发明涉及微生物分离及培养领域。
2.

背景技术：

3.植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段，生活于健康植物各种组织内的微生物。在植物体内广泛存在，并在长期的进化过程中与植物形成了互利共生、相互依存的关系。具有促进植物体的生长，赋予植物抗逆性、抗菌、抗病毒、抗病虫害的作用，还能够产生同植物相同或者相似的活性物质。近年来的研究表明, 内生菌能够 参与植物次生代谢及其成分的转化合成, 还能独立 产生丰富的次生代谢产物, 是天然产物的重要来源, 也是宝贵的菌种资源库。
4.蓝玉簪龙胆(gentiana veitchiorum)是常用藏药龙胆花的植物来源之一，具有利胆、抗炎、健胃、降压等作用；龙胆对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和变形杆菌均有不同程度的抑制作用；不仅是中国特有植物，也是西藏地区独特的具有观赏和药用价值的植物龙胆属含有多种化学活性成分，尤其富含环烯醚萜苷类成分-龙胆苦苷。
5.

技术实现要素：

6.本发明首次在蓝玉簪龙胆花中分离到一株具有良好的生物活性枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述植物内生菌为jbb-mbb-gv79，保藏编号为cctcc no:m20191121。
7.2. 一种如权力要求1所述植物内生菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、采集选取健康无植物病虫害的蓝玉簪龙胆花，迅速将样品装入灭菌容器中；b、在无菌环境中，去除植物表面附着的微生物如菌丝、孢子，及其上附着的土壤颗粒，并用乙醇及次氯酸钠消毒；c、切片法分离法以及匀浆法处理植物并将其植入lb分离培养基，选取平板上的植物内生菌，进行分离纯化。
8.3. 如权利要求2所述一种植物内生菌的制备方法，其特征在于，所述lb培养基配方为，酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl 10g，蒸馏水 1000ml，121℃灭菌20min。
9.4、一种如权利要求1所述的植物内生菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在培养所述植物内生菌后，离心取上清液。
10.5、如权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、挑取平板上单一菌落接种于5ml液体培养基中，28℃，190r培养24h后，制备得到种子液；b、以1%的接种量接种到50ml培养基中，28℃，190r培养4d；c、菌株发酵液4000rpm离心取上清液。
11.6、一种通过如权利要求2-4任一项所述制备方法制备的植物内生菌发酵物。
12.7、一种如权利要求6所述的植物内生菌发酵物在制备抗衰老、抑菌和/或美白的产品中的应用；优选地，所述产品为护肤品、化妆品或清洁剂。
13.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
14.本发明所用试剂和原料均市售可得。
15.本发明的积极进步效果在于：本发明首次在蓝玉簪龙胆花中分离到一株具有良好的生物活性枯草芽孢杆菌，其发酵液具有抑制痤疮丙酸杆菌及清除dpph自由基的能力。在化妆品原料研究中具有很好的应用潜力及开发研究前景。
16.生物材料保藏信息本发明的枯草芽孢杆菌株命名为jbb-mbb-gv79。菌落形态小，呈圆形表面褶皱。菌落为乳白色，不透明。同时该菌的its序列比对结果鉴定确定其为一株枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）。该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m20191121。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072。 保藏日期为2019年12月27日。
17.附图说明
18.图1为分离得到的枯草芽孢杆菌株的菌落形态。
具体实施方式
19.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
20.实施例1 菌株的分离、筛选及鉴定1、菌株的分离、筛选及鉴定使用灭菌工具采集选取健康无植物病虫害的蓝玉簪龙胆花，迅速将样品装入灭菌容器中。样品运回实验室后，立即在无菌操作台上进行处理。去除植物表面附着的微生物如菌丝、孢子，及其上附着的土壤颗粒。选取适合浓度的乙醇及次氯酸钠植物材料的表面消毒。植株消毒后，选取切片法分离法以及匀浆法处理龙胆花并将其植入lb分离培养基，与对照相对应，进行培养。选取平板上的植物内生菌，进行分离纯化。
21.lb培养基配方为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl 10g，蒸馏水 1000ml，121℃灭菌20min。
22.经分离得到一株枯草芽孢杆菌株命名为jbb-mbb-gv79。菌落形态小，呈圆形表面褶皱。菌落为乳白色，不透明。同时该菌的its序列比对结果鉴定确定其为一株枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）。该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m20191121。
23.2、菌株发酵液制备挑取平板上单一菌落接种于5ml液体培养基中，28℃，190r培养24h后，制备得到种子液。以1%的接种量接种到50ml培养基中，28℃，190r培养4d。菌株发酵液4000rpm离心取上
清液，冻干称重并保存。
24.对菌株jbb-mbb-gv79（简称t-79）进行发酵液制备及其成分分析，其结果如表1。
25.表1发酵液基本成分分析3、菌株发酵液成分测定1）多酚含量的测定标准品没食子酸和待测样品用水溶解。取0.1 ml没食子酸标准液和待测样品溶液，加入0.5 ml 10% folin-ciocalteu试剂, 混合，室温放置5min后加入0.4 ml 7.5%naco3溶液，混合后室温放置60 min，测定765nm 的od值。由标准液各管od
520
对没食子含量作标准曲线，根据标准曲线计算样品中多酚含量。
26.2）总糖含量的测定标准品葡萄糖和待测样品用水溶解。取葡萄糖标准液或者待测样品溶液0.2 ml，加5 %苯酚0.4 ml，振荡后加浓硫酸2.0 ml，振荡，在室温放置30 min，以空白管为对照测定490nm处的od值。由标准液各浓度od
490
对葡萄糖含量作标准曲线，根据标准曲线计算样品中总糖含量。
27.4、清除自由基1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（dpph）是一种稳定的氮中心有机自由基。dpph法于1958年被提出，广泛用于地量测定生物试样、分类物质和食品的抗衰老能力。此法是根据dpph自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的抗衰老能力。
28.取发酵液溶液0.lml 加入试管中，再加入0.1ml dpph乙醇溶液，混匀，室温下避光在黑暗处反应 30min，在 525nm 处测定od值，按照下面公式计算清除率：清除率 i(％) ＝ [1-(t-t0)/(c-c0)]
×
100％，式中 ： t0：0.1ml 样品液加 0.1ml 95％乙醇的吸光度；t：0.1ml 样品液加0.1 ml dpph 溶液的吸光度；c0：0.1ml 水加 0.1ml 95％乙醇的吸光度；c：0.1ml 水加0.1 ml dpph 溶液的吸光度。
[0029]
dpph自由基清除率参见表2表2 发酵液dpph自由基清除率5 弹性蛋白酶活性抑制实验弹性蛋白酶(elastase)是一种分解不溶蛋白为特征的蛋白水解酶，会使皮肤真皮中支撑皮肤结构的弹性蛋白被过度的降解，从而使皮肤产生皱纹、松弛无弹性等衰老症状。蛋白酶抑制剂，可以有效地抑制弹性蛋白酶的活性，从而起到增强皮肤弹性，减少皱纹及色
素沉着，延缓皮肤衰老等作用。
[0030]
取发酵产物样品溶液,通过以下方法测定酪氨酸酶抑制作用。设立样品管和样品溶剂对照管，空白对照和空白溶剂对照。在样品管和样品溶剂对照管中各加入10μl不同浓度的样品溶液，空白对照和空白溶剂对照管以10μl0.1mtris-hcl缓冲溶液（ph8.0）缓冲液代替。130μl含有1.015mm反应底物succ-ala-ala-ala-p-硝基酰替苯胺的0.1mtris-hcl缓冲溶液（ph8.0），混合均匀，在25℃下温育5分钟。在样品管和空白对照管中加入加入15μl弹性蛋白酶溶液（0.5u/ml），样品溶剂对照和空白溶剂对照管以10μl0.1mtris-hcl缓冲溶液（ph8.0）代替，振摇所有试管，在25℃下温育30min。即刻在410nm处测定吸光度。按照下面公式计算抑制率。
[0031]
抑制率i（%）=［1－（t－t0）/（c-c0）］
×
100%式中：t0：样品溶剂对照；t：样品对照；c：空白对照；c0：空白溶剂对照。
[0032]
弹性蛋白酶抑制率参见表3.表3发酵产物弹性蛋白酶抑制率6、发酵液抑制痤疮丙酸杆菌实验痤疮丙酸杆菌（p.acnes）接种至培养基平板活化。挑取平板上p.acnes接种至10ml液体培养基中，37℃厌氧培养2d制成其od
600
=1菌体悬液备用。取1ml发酵液，无菌滤膜除菌，滤液备用。在培养基中分别加入无菌水、盐酸四环素及发酵液样品。分别接入1%已活化的等量菌悬液，密封，37℃下厌氧培养48h后，取1ml菌悬液4000rpm离心去除培养基，1ml无菌水重悬，测定其od
600
。抑制率=（1-t
样品
/c
对照
）*100%。
[0033]
发酵液样品配置浓度为50mg/ml，10mg/ml，1mg/ml。
[0034]
其中c
0-阳性对照：40ul四环素 360ul无菌水 3600ul硫乙醇酸盐培养基；c-空白对照：400ul无菌水 3600ul硫乙醇酸盐培养基；t-样品：400ul发酵液样品 3600ul硫乙醇酸盐培养基。
[0035]
参见表4及表5，该芽孢杆菌发酵液抑制痤疮丙酸杆菌的实验结果显示，该发酵液在终浓度5mg/ml时对痤疮丙酸杆菌有明显的抑制作用，抑制率为37.76%，在稀释到终浓度为0.1mg/ml。其抑制率仍然还有6.66%。
[0036]
表4抑制痤疮丙酸杆菌活性发酵液抑制枯草芽孢杆菌活性表5抑制枯草芽孢杆菌活性样品测试浓度（mg/ml）抑制率t-79发酵产物525.86%实施例2含发酵提取物的化妆水
取实施例1的芽孢杆菌发酵产物滤液，用于制备具有抑制痤疮丙酸杆菌及清除dpph自由基作用的化妆水，按照本领域常规的化妆水的制备方法，化妆水所含的组分如表6所示：表6虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。