治疗弗里德里希共济失调的材料和方法

治疗弗里德里希共济失调的材料和方法
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2.本技术根据35usc
§
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技术领域
5.本公开一般涉及用tat-fxn融合多肽和/或该多肽的制剂治疗弗里德里希共济失调。


背景技术：

6.弗里德里希共济失调(friedreich’s ataxia，frda)是进行性神经退行性运动病症，典型发病年龄为10至15岁。它是遗传性病症，表示人类最常见的遗传性共济失调之一。frda也非常罕见；仅在美国，仅有约4,000-5,000例确诊病例。患有frda的患者展示出多种症状。初始的症状包括姿势不稳和经常跌倒，两者都与进行性行走困难有关。该疾病的标志性表现包括进行性肢体共济失调和构音困难。随着疾病的进展，患者会经历进行性神经和心脏功能障碍。frda患者经历心肌病是很常见的，这可能导致心力衰竭和/或心律失常。肥厚性心肌病与frda患者30至50岁时的早期死亡有关。其他临床表现包括脊柱侧弯、疲劳、糖尿病、视力损伤和听力损失。
7.目前还没有治愈frda的方法。现有的治疗本质上是对症的，重点是治疗由基因缺陷引起的心脏问题或糖尿病。之前已经描述了转录fraxtaxin蛋白(tat-fxn)融合多肽的反式激活因子[参见vyas,et al.,hum.mol.genet.,v21 n6,1230-1247(2012)]能够在体内递送功能性线粒体蛋白以挽救frda疾病表型，从而充当可能的蛋白质替代疗法。然而，vyas等人公开的融合多肽的治疗效果受限于其在生理ph下的差的溶解度。
[0008]
因此，迫切需要开发治疗frda的新疗法。
[0009]
发明概述
[0010]
本公开提供了tat-fxn融合多肽、包含tat-fxn融合多肽的组合物以及使用tat-fxn融合多肽治疗frda的方法。特别地，本公开提供了以前从未描述过的新的tat-fxn融合多肽，其克服了vyas等人(同上)先前描述的tat-fxn融合多肽中存在的缺陷，以及包含新tat-fxn融合多肽的有利组合物。
[0011]
所公开的tat-fxn融合多肽的特征在于出乎意料地具有比vyas等人的多肽显著更高的溶解度(例如，在水溶液中的溶解度)。例如，可以制备包含浓度大于50mg/ml的公开的tat-fxn融合多肽的组合物(例如，水性组合物)。相比之下，vyas等人的多肽在开始从溶液中沉淀出来之前不能超过约2mg/ml。因此，本公开提供的tat-fxn融合多肽允许制备包含浓
度为2mg/ml或大于2mg/ml的多肽的药物组合物。此类药物组合物提供的显著优点是允许施用比以前可能的情况(例如，通过皮下注射)高得多的剂量的所公开的tat-fxn融合多肽。
[0012]
因此，本公开提供了融合多肽，其包含：第一肽，其具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；第二肽，其具有与seq id no：4的氨基酸序列至少约90％的序列同一性的氨基酸序列；以及1、2或3个氨基酸的接头，其位于第一和第二肽之间。
[0013]
在一些实施方案中，第一肽具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一肽具有seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列。
[0014]
在一些实施方案中，第二肽具有与seq id no：4的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二肽具有seq id no：4的氨基酸序列。
[0015]
在一些实施方案中，接头是2-氨基酸接头。在一些实施方案中，2-氨基酸接头是gly-gly。
[0016]
在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第一肽，接着是接头，接着是第二肽。在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第二肽，接着是接头，接着是第一肽。
[0017]
在一些实施方案中，融合多肽包含与seq id no：1的氨基酸序列有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
[0018]
在一些实施方案中，融合多肽包含与seq id no：1的氨基酸序列有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽包含seq id no：1的氨基酸序列。
[0019]
在一些实施方案中，融合多肽由以下组成：第一肽，其具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；第二肽，其具有与seq id no：4的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；以及1、2或3个氨基酸的接头，其位于第一和第二肽之间。
[0020]
在一些实施方案中，第一肽具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一肽具有seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列。
[0021]
在一些实施方案中，第二肽具有与seq id no：4的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二肽具有seq id no：4的氨基酸序列。
[0022]
在一些实施方案中，接头是2-氨基酸接头。在一些实施方案中，2-氨基酸接头是gly-gly。
[0023]
在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第一肽，接着是接头，接着是第二肽。在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第二肽，接着是接头，接着是第一肽。
[0024]
本公开提供了融合多肽，其由以下组成：第一肽，其具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；第二肽，其具有与seq id no：4的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；以及1、2或3个氨基酸的接头，其位于第一和第二肽之间。
[0025]
在一些实施方案中，第一肽具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少
约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一肽具有seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列。
[0026]
在一些实施方案中，第二肽具有与seq id no：4的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二肽具有seq id no：4的氨基酸序列。
[0027]
在一些实施方案中，接头是2-氨基酸接头。在一些实施方案中，2-氨基酸接头是gly-gly。
[0028]
在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第一肽，接着是接头，接着是第二肽。在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第二肽，接着是接头，接着是第一肽。
[0029]
本公开提供了融合多肽，其包含：第一肽，其具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；第二肽，其具有与seq id no：3的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；第三肽，其具有与seq id no：5的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；以及1、2或3个氨基酸的接头，其位于第一和第二肽之间。
[0030]
在一些实施方案中，第一肽具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一肽具有seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列。
[0031]
在一些实施方案中，第二肽具有与seq id no：3的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二肽具有seq id no：3的氨基酸序列。
[0032]
在一些实施方案中，第三肽具有与seq id no：5的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第三肽具有seq id no：5的氨基酸序列。
[0033]
在一些实施方案中，接头是2-氨基酸接头。在一些实施方案中，2-氨基酸接头是gly-gly。
[0034]
在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第一肽，接着是接头，接着是第二肽，接着是第三肽。在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第二肽，接着是第三肽，接着是接头，接着是第一肽。
[0035]
在一些实施方案中，融合多肽由以下组成：第一肽，其具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；第二肽，其具有与seq id no：3的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；第三肽，其具有与seq id no：5的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；以及1、2或3个氨基酸的接头，其位于第一和第二肽之间。
[0036]
在一些实施方案中，第一肽具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一肽具有seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列。
[0037]
在一些实施方案中，第二肽具有与seq id no：3的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二肽具有seq id no：3的氨基酸序列。
[0038]
在一些实施方案中，第三肽具有与seq id no：5的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第三肽具有seq id no：5的氨基酸序列.
[0039]
在一些实施方案中，接头是2-氨基酸接头。在一些实施方案中，2-氨基酸接头是
no：7的氨基酸序列。
[0054]
在一些实施方案中，第二肽具有与seq id no：3的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二肽具有seq id no：3的氨基酸序列。
[0055]
在一些实施方案中，第三肽具有与seq id no：5的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第三肽具有seq id no：5的氨基酸序列。
[0056]
在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第一肽，接着是第二肽，接着是第三肽。在一些实施方案中，融合多肽的序列，从n端开始是：第二肽，接着是第三肽，接着是第一肽。
[0057]
本公开还提供了编码融合多肽的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，核酸序列是seq id no：6。
[0058]
本公开提供了表达盒，其包含本公开的核酸序列和可操作地连接到所述核酸序列的启动子。
[0059]
本公开提供了包含公开的表达盒的表达载体。
[0060]
本公开提供了包含公开的表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。
[0061]
本公开提供了药物组合物，其包含本公开的融合多肽和药学上可接受的载体。
[0062]
本公开提供了药物组合物，其包含融合多肽和药学上可接受的载体，其中融合多肽存在于药物组合物中的浓度大于约4mg/ml；并且其中融合多肽包含：第一肽，其具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；第二肽，其具有与seq id no：4的氨基酸序列至少约90％的序列同一性的氨基酸序列。
[0063]
在一些实施方案中，第一肽具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一肽具有seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列。
[0064]
在一些实施方案中，第二肽具有与seq id no：4的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二肽具有seq id no：4的氨基酸序列。
[0065]
本公开提供了包含融合多肽和药学上可接受的载体的药物组合物，其中融合多肽存在于药物组合物中的浓度大于约4mg/ml，并且其中融合多肽包含：第一肽，其具有与seq id no:2或seq id no:7的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；第二肽，其具有与seq id no：3的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列；和第三肽，其具有与seq id no：5的氨基酸序列至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
[0066]
在一些实施方案中，第一肽具有与seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一肽具有seq id no：2或seq id no：7的氨基酸序列。
[0067]
在一些实施方案中，第二肽具有与seq id no：3的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二肽具有seq id no：3的氨基酸序列。
[0068]
在一些实施方案中，第三肽具有与seq id no：5的氨基酸序列至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第三肽具有seq id no：5的氨基酸序列。
[0069]
在一些实施方案中，融合多肽进一步包含1、2或3个氨基酸的接头，其位于第一和第二肽之间。在一些实施方案中，接头是2-氨基酸接头。在一些实施方案中，该2-氨基酸接
40mg kg-1
、每天约40mg kg-1-45mg kg-1
、每天约45mg kg-1-50mg kg-1
、每天约50mg kg-1-55mg kg-1
和每天约55mg kg-1-60mg kg-1
；
[0083]
(iii)大于或等于2mg/注射；
[0084]
(iv)选自约2.5mg/注射-约10mg/注射、约5mg/注射-约50mg/注射、约20mg/注射-约75mg/注射、约25mg/注射-约100mg/注射、约100mg/注射
–
约150mg/注射；或
[0085]
(v)选自约2.5mg/注射-约5mg/注射、约4mg/注射-约10mg/注射、约5mg/注射-约25mg/注射、约15mg/注射-约30mg/注射、约20mg/注射-约50mg/注射、约25mg/注射-约60mg/注射、约35mg/注射-约75mg/注射、约50mg/注射-约80mg/注射、约90mg/注射-约120mg/注射、约100mg/注射-约150mg/注射。
[0086]
在一些实施方案中，融合多肽或药物组合物通过皮下注射施用。
[0087]
本公开还提供了公开的融合多肽，其用于制造用于治疗有需要的受试者的弗里德里希共济失调(frda)、frda相关的肥厚性心肌病、frda相关疾病或其组合的药物，其中该药物进一步包含药学上可接受的媒介物和药学上可接受的赋形剂，其中该frda相关疾病选自由以下组成的病况组：本体感觉丧失、反射丧失、行走能力丧失、用眼睛保持凝视的能力丧失、吞咽受损、进行性听力丧失、进行性视力丧失、进行性语言丧失、甘油三酯升高、低hdl胆固醇、升高的ldl胆固醇、脊柱侧弯及其组合。
[0088]
在一些实施方案中，融合多肽以以下量包括在药物组合物中：
[0089]
(i)约10-100mg/ml、约10-50mg/ml、约10mg/ml或约50mg/ml；
[0090]
(ii)大于或等于2mg/ml；
[0091]
(iii)约2.5mg/ml-约10mg/ml、约5mg/ml-约50mg/ml、约20mg/ml-约75mg/ml、或约25mg/ml-约100mg/ml；或
[0092]
(iv)约2.5mg/ml-约5mg/ml、约4mg/ml-约10mg/ml、约5mg/ml-约25mg/ml、约15mg/ml-约30mg/ml、约20mg/ml-约50mg/ml、约25mg/ml-约60mg/ml、约35mg/ml-约75mg/ml、约50mg/ml-约80mg/ml或约90mg/ml-约100mg/ml
[0093]
在一些实施方案中，药学上可接受的媒介物选自由以下项组成的组：水、盐水溶液、乙酸钠、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、油乳液和前述的组合。在一些实施方案中，药学上可接受的媒介物是乙酸钠。
[0094]
在一些实施方案中，药学上可接受的媒介物以约50mm的浓度包括在药物组合物中。
[0095]
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是丙二醇。
[0096]
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂以组合物总体积的约1％的量包括在药物组合物中。
[0097]
在一些实施方案中，组合物的ph为约5至约7。在一些实施方案中，组合物的ph为约5。
[0098]
在一些实施方案中，药物是可注射的。在一些实施方案中，该药物适用于皮下注射。
[0099]
提供了具有seq id no：1的氨基酸序列的tat-fxn融合多肽。所公开的融合多肽的tat部分可以具有seq id no:2的氨基酸序列，融合多肽的fxn部分具有seq id no:4的氨基酸序列，以及位于融合多肽的tat部分和fxn部分之间的接头为gly-gly。
[0100]
提供了药物组合物，其包含tat-fxn融合多肽(该多肽可以具有seq id no:1的氨基酸序列)、药学上可接受的媒介物和药学上可接受的赋形剂，其中，在一些实施方案中，融合多肽的tat部分具有seq id no:2的氨基酸序列，融合多肽的fxn部分具有seq id no:4的氨基酸序列，并且位于融合多肽的tat部分和fxn部分之间的接头可以是gly-gly。
[0101]
tat-fxn融合多肽可以以选自以下的量存在于药物组合物中：约10-100mg/ml、约10-50mg/ml、约10mg/ml和约50mg/ml。tat-fxn融合多肽可以以约50mg/ml的量存在于药物组合物中。
[0102]
在药物组合物媒介物中的药学上可接受的那些可以变化。药学上可接受的媒介物可以是水、盐水溶液、乙酸钠、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、油乳液以及它们的组合。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是乙酸钠。在任何和/或所有前述实施方案中，药学上可接受的媒介物的浓度为50mm。
[0103]
药学上可接受的赋形剂可以是，例如丙二醇并且其可以以组合物总体积的1％的量存在于药物组合物中。
[0104]
药物组合物的ph可以变化。在一些实施方案中，组合物的ph为约5-7。在特定实施方案中，组合物的ph可以为约5。在另一个制剂中，ph为约7或生理ph。
[0105]
提供了多肽，其包含具有与seq id no:2至少90％序列同一性的第一肽，具有与seq id no:4至少90％序列同一性的第二肽，以及在第一肽和第二肽之间的2-氨基酸接头。
[0106]
第一肽的序列同一性可以变化。在一些实施方案中，第一肽具有与seq id no：2至少95％的同一性。在其他实施方案中，第一肽具有seq id no：2的氨基酸序列。
[0107]
第二肽的序列同一性也可以变化。在一些实施方案中，第二肽具有与seq id no：4至少95％的同一性。在其他实施方案中，第二肽具有seq id no：4的氨基酸序列。
[0108]
在各种实施方案中，2-氨基酸接头是gly-gly。
[0109]
在任一个前述实施方案中，多肽具有与seq id no：1至少90％的序列同一性。在一些前述实施方案中，多肽具有与seq id no：1至少95％的序列同一性。在一些前述实施方案中，多肽具有seq id no：1的氨基酸序列。
[0110]
多肽，其包含具有seq id no：2的氨基酸序列的第一肽、具有seq id no：3的氨基酸序列的第二肽、具有seq id no：5的氨基酸序列的第三肽；以及提供了第一和第二多肽之间的2-氨基酸接头。
[0111]
在一些实施方案中，多肽序列，从n端开始如下：第一肽(seq id no：2)，接着是2-氨基酸接头，接着是第二肽(seq id no:3)，接着是第三肽(seq id no:5)。
[0112]
在一些上述实施方案中，2-氨基酸接头是gly-gly。
[0113]
在一些上述实施方案中，多肽具有seq id no：1的氨基酸序列。
[0114]
提供了治疗弗里德里希共济失调的方法，其包括向有所需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含具有seq id no：1的氨基酸序列的tat-fxn融合多肽、药学上可接受的媒介物和药学上可接受的赋形剂，其中，在一些实施方案中，融合多肽的tat部分具有seq id no：2的氨基酸序列，融合多肽的fxn部分具有seq id no：4的氨基酸序列，并且位于融合多肽的tat部分和fxn部分之间的接头是gly-gly。
[0115]
tat-fxn融合多肽可以以每天约5mg kg-1-60mg kg-1
的量施用。tat-fxn融合多肽可以以选自以下项的量施用：每天约10mg kg-1-50mg kg-1
、每天约20mg kg-1-40mg kg-1
、每
天约30mg kg-1-40mg kg-1
、每天约40mg kg-1-50mg kg-1
、每天约50mg kg-1-60mg kg-1
、每天约5mg kg-1-10mg kg-1
、每天约10mg kg-1-15mg kg-1
、每天约15mg kg-1-20mg kg-1
、每天约20mg kg-1-‑
25mg kg-1
、每天约25mg kg-1-30mg kg-1
、每天约30mg kg-1-35mg kg-1
、每天约35mg kg-1-40mg kg-1
、每天约40mg kg-1-45mg kg-1
、每天约45mg kg-1-50mg kg-1
、每天约50mg kg-1-55mg kg-1
和每天约55mg kg-1-60mg kg-1
。
[0116]
在任何前述实施方案中，药物组合物可以通过皮下注射施用。
[0117]
提供了治疗frda相关的肥厚性心肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含具有seq id no：1的氨基酸序列的tat-fxn融合多肽、药学上可接受的媒介物和药学上可接受的赋形剂，其中，在一些实施方案中，融合多肽的tat部分具有seq id no：2的氨基酸序列，融合多肽的fxn部分具有seq id no：4的氨基酸序列，并且位于融合多肽的tat部分和fxn部分之间的接头是gly-gly。
[0118]
在一些实施方案中，tat-fxn融合多肽可以以每天约5mg kg-1-60mg kg-1
的量施用。在其他实施方案中，tat-fxn融合多肽可以以选自以下项的量施用：每天约10mg kg-1-50mg kg-1
、每天约20mg kg-1-40mg kg-1
、每天约30mg kg-1-40mg kg-1
、每天约40mg kg-1-50mg kg-1
、每天约50mg kg-1-60mg kg-1
、每天约5mg kg-1-10mg kg-1
、每天约10mg kg-1-15mg kg-1
、每天约15mg kg-1-20mg kg-1
、每天约20mg kg-1-‑
25mg kg-1
、每天约25mg kg-1-30mg kg-1
、每天约30mg kg-1-35mg kg-1
、每天约35mg kg-1-40mg kg-1
、每天约40mg kg-1-45mg kg-1
、每天约45mg kg-1-50mg kg-1
、每天约50mg kg-1-55mg kg-1
和每天约55mg kg-1-60mg kg-1
。
[0119]
在任何前述实施方案中，药物组合物可以通过皮下注射施用。
[0120]
提供了治疗frda相关疾病的方法，其中该frda相关疾病选自神经病症、吞咽受损、糖尿病、视力丧失、听力丧失、言语丧失、代谢综合征、脊柱侧弯及其组合。在这第六方面，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含具有seq id no：1的氨基酸序列的tat-fxn融合多肽、药学上可接受的媒介物和药学上可接受的赋形剂，其中，在一些实施方案中，融合多肽的tat部分具有seq id no:2的氨基酸序列，融合多肽的fxn部分具有seq id no:4的氨基酸序列，并且位于融合多肽的tat部分和fxn部分之间的接头是gly-gly。
[0121]
在一些实施方案中，tat-fxn融合多肽以每天约5mg kg-1-60mg kg-1
的量施用。在其他实施方案中，tat-fxn融合多肽可以以选自以下项的量施用：每天约10mg kg-1-50mg kg-1
、每天约20mg kg-1-40mg kg-1
、每天约30mg kg-1-40mg kg-1
、每天约40mg kg-1-50mg kg-1
、每天约50mg kg-1-60mg kg-1
、每天约5mg kg-1-10mg kg-1
、每天约10mg kg-1-15mg kg-1
、每天约15mg kg-1-20mg kg-1
、每天约20mg kg-1-‑
25mg kg-1
、每天约25mg kg-1-30mg kg-1
、每天约30mg kg-1-35mg kg-1
、每天约35mg kg-1-40mg kg-1
、每天约40mg kg-1-45mg kg-1
、每天约45mg kg-1-50mg kg-1
、每天约50mg kg-1-55mg kg-1
和每天约55mg kg-1-60mg kg-1
。
[0122]
在任何前述实施方案中，药物组合物可以通过皮下注射施用。
[0123]
序列表
[0124]
seq id no：1，tat-fxn融合多肽的氨基酸序列(224aa)：
[0125][0126]
seq id no:2，hiv-1转录细胞穿透肽反式激活因子(tat-cpp)的完整氨基酸序列，其在用于起始的氨基端添加了甲硫氨酸(12aa)：mygrkkrrqrrr
[0127]
seq id no:3，人frataxin线粒体靶向序列(hfxn-mts)的氨基酸序列(80aa)：mwtlgr ravagllasp spaqaqtltr vprpaelapl cgrrglrtdi datctprras snqrglnqiw nvkkqsvylm nlrk
[0128]
seq id no：4，完整的人frataxin(hfxn)蛋白的氨基酸序列(210aa)：
[0129][0130]
seq id no:5，成熟人frataxin蛋白的氨基酸序列(130aa)：
[0131]
sgtlgh pgsldettye rlaeetldsl aeffedladk pytfedydvs
[0132]
fgsgvltvkl ggdlgtyvin kqtpnkqiwl sspssgpkry
[0133]
dwtgknwvys hdgvslhell aaeltkalkt kldlsslays gkda
[0134]
seq id no：6，编码seq id no：1的tat-fxn融合多肽的核酸序列(cdna)；对在大肠杆菌中的表达进行了优化(684个碱基)：
[0135][0136]
seq id no：7：hiv-1转录细胞穿透肽反式激活因子(tat-cpp)的完整氨基酸序列(11aa)：ygrkkrrqrrr。
附图说明
[0137]
图1展现了从生命的第15天到第170天用由本公开提供的tat-fxn融合多肽(seq id no:1)(10mg/kg，sc，每周3x)或媒介物(1μl/g，sc每周3x)处理的mck-crefxnko小鼠的kaplan-meier存活曲线。这些小鼠是frda致死性肥厚性心肌病的模型。
[0138]
图2a阐明了从生命的第15天到第170天用由本公开提供的tat-fxn融合多肽(seq id no:1)(10mg/kg，sc，每周3x)或媒介物(1μl/g，sc每周3x)处理的雄性mck-crefxnko小鼠的体重增加。dol＝生命天数。
[0139]
图2b阐明了从生命的第15天到第170天用由本公开提供的tat-fxn融合多肽(seq id no:1)(10mg/kg，sc，每周3x)或媒介物(1μl/g，sc每周3x)处理的雌性mck-crefxnko小鼠的体重增加。dol＝生命天数。
[0140]
图3阐明了由本公开提供的tat-fxn融合多肽(seq id no：1)处理的野生型(wt)小鼠、小清蛋白(parvalbumin)缺陷型(pvko)小鼠和小清蛋白缺陷型小鼠之间的平均共济失调系数和平均步态宽度(mean stance width)，其将frataxin蛋白递送到线粒体(pvko tat-fxn)。这些小鼠是frda进行性神经共济失调的模型。条形图中显示的每组小鼠的数量。数据展现为 /-sem(p值：*《0.05、**《0.01、***《0.0001)。本发明提供的tat-fxn融合多肽不含有已知的糖基化或其他翻译后修饰。
[0141]
图4阐明了用由本公开提供的tat-fxn融合多肽处理的小鼠相对于图3的未处理的pvko小鼠的长达180天的寿命。数据展现为 /-sem。用tat-fxn融合多肽(seq id no:1)处理的pvko雄性和雌性小鼠的寿命显著长于媒介物处理的pvko小鼠。
[0142]
图5描绘了由本发明提供的tat-fxn融合多肽(seq id no：1)的氨基酸序列。gly-gly接头肽有下划线。
[0143]
图6a阐明了使用4-12％bis-tris凝胶、还原的、在标准条件下运行的纯化优化研究的结果。使用四种不同的层析纯化技术产生了十四种tat-fxn融合多肽(seq id no：1)的制备物。方框显示tat-fxn融合多肽。iex＝离子交换层析树脂；快速流动树脂；mmc＝capto-mmc层析介质；高性能树脂。
[0144]
图6b描绘了经由capto-mmc层析介质分离的tat-fxn融合多肽(seq id no：1)的纯度分析结果。
[0145]
图7a阐明了tat-fxn融合多肽(seq id no:1)组织穿透进入小鼠心脏，如实施例3中所述。
[0146]
图7b描述了tat-fxn融合多肽(seq id no:1)在小鼠脑、脊柱和背根神经节(drg)中的组织水平，如实施例3中所述。
[0147]
图7c描绘了对照pvko小鼠中人fxn的组织水平，其仅给予了媒介物(不是tat-fxn融合多肽)。这些小鼠是图7b中所示的测试小鼠的阴性对照。
[0148]
图8a描绘了在大鼠皮下注射或静脉内注射后tat-fxn融合多肽(seq id no:1)的心脏水平，如实施例4中所述。
[0149]
图8b描绘了在大鼠皮下注射或静脉内注射后tat-fxn融合多肽(seq id no:1)的脑水平，如实施例4中所述。
[0150]
图9a描绘了在静脉内注射tat-fxn融合多肽(seq id no:1)后的血液化学，如实施例4中所述。
[0151]
图9b阐明了在静脉内注射tat-fxn融合多肽(seq id no:1)后的大鼠血液学数据，如实施例4中所述。
[0152]
图10描绘了在大鼠中长期注射后tat-fxn融合多肽(seq id no:1)的组织水平，如实施例5中所述。
[0153]
图11a是显示vyas等人的多肽和公开的tat-fxn融合多肽(seq id no:1)的活性量作为肽浓度函数的图，如通过荧光测量的并如实施例6中所述。
[0154]
图11b是显示vyas等人的多肽或公开的tat-fxn融合多肽(seq id no:1)的聚集/沉淀量作为肽浓度函数的图，如通过od
630
测量的并如实施例6中所述。
[0155]
图12a是在15％人血浆中温育不同时间的tat-fxn融合多肽(seq id no：1)的蛋白质印迹(western blot)图像。
[0156]
图12b是vyas等人的多肽在15％人血浆中温育不同时间的蛋白质印迹图像。
[0157]
图12c是指示tat-fxn融合多肽和vyas等人的多肽在pbs中稀释的15％人血浆中温育不同时间后的降解百分比的条形图。
[0158]
图13a，小图a是在96孔板的一个孔中的，用0μm tat-fxn融合多肽(seq id no:1)处理两天并用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红(texas red)染色的许旺细胞(schwann cell)的图像。小图b是在96孔板的一个孔中的，用0μm vyas等人的多肽处理两天并用核染剂hoechst33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色的许旺细胞的图像。小图c是在96孔板的一个孔中的，用12.5μm tat-fxn融合多肽处理两天并用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色的许旺细胞的图像。小图d是在96孔板的一个孔中的，用12.5μm vyas等人的多肽处理两天并用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色的许旺细胞的图像。小图e是在96孔板的一个孔中的，用12.5μm tat-fxn融合多肽处理两天并用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色，并用60x油物镜成像的许旺细胞的图像。小图f是在96孔板的一个孔中的，用12.5μm vyas等人的多肽处理两天并用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色，并用60x油物镜成像的许旺细胞的图像。
[0159]
图13b是条形图，其指示在用0μm或12.5μm tat-fxn融合多肽(seq id no:1)或vyas等人的多肽处理的许旺细胞中，对应于frataxin的德克萨斯红染剂的量与hoechst 33342核染剂的量的比。
[0160]
图14a是条形图，其表示tat-fxn融合多肽(seq id no：1)和vyas等人的多肽聚集/沉淀量，该量如在0mm或150mm nacl存在下，在10μm多肽浓度下，通过od
630
测量。
[0161]
图14b是条形图，其表示tat-fxn融合多肽(seq id no：1)和vyas等人的多肽聚集/沉淀量，该量如在2.5μm、5μm和10μm的浓度下，在没有nacl的情况下，通过od
630
测量。
[0162]
图14c是条形图，其指示在0.078μm、0.156μm、0.313μm、0.625μm和1.25μm的多肽浓度下，tat-fxn融合多肽(seq id no：1)和vyas等人的多肽的两个不同批次(批次1和批次2)的百分比活性，相对于第2批tat-fxn融合多肽的比活性标准化。
[0163]
发明详述
[0164]
为了促进对新技术原理的理解，现在将引用优选的组合物、制造方法和其使用方法，并且将使用特定语言来描述它们。然而，应当理解，本发明并不意在限制新技术的范围，本领域技术人员通常会想到对新技术原理进行此类改变、修改和进一步应用，且涉及的新
技术在本公开和权利要求书的范围内。
[0165]
定义
[0166]
除非在上下文中另外指明使用术语，否则术语将具有如本文所用的以下含义。
[0167]
术语“约”是指正负10％的值范围，例如，约1.0涵盖0.9至1.1的值。
[0168]“药学上可接受的”是指经政府监管机构如美国食品和药物管理局(u.s.fda)或欧洲ema批准或可批准的，或列入美国药典或其他公认的药典的用于哺乳动物和/或动物，尤其是人的。
[0169]
如本文所用，“受试者”是指哺乳动物，例如猴、大鼠、小鼠或人。在一个特定实施方案中，受试者是人。
[0170]
任何疾病的“处理”或“治疗”是指逆转、减轻、阻止或改善疾病或疾病的至少一种临床症状或抑制疾病的进展或疾病的至少一种临床症状，在这种情况下是弗里德里希共济失调。“处理”或“治疗”还指在身体上(例如，可识别症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)或两者上抑制疾病，并且抑制对受试者可识别或不可识别的至少一个身体参数。
[0171]“治疗有效量”是指当给予受试者以治疗疾病或疾病的至少一种临床症状时，活性药物成分的量足以影响疾病或其症状的此类治疗。“治疗有效量”可以根据例如活性药物成分、疾病和/或疾病的症状、疾病的严重程度和/或疾病或病症的症状、年龄、体重和/或或待治疗受试者的健康状况，以及开药医生的判断而变化。
[0172]
例如，所公开的tat-fxn融合多肽的“治疗有效量”是治疗frda所必需或足够的量，所述frda包括例如frda相关的疾病、病症或病况。例如，所公开的tat-fxn融合多肽的“治疗有效量”是改良、改善与frda相关的至少一种症状或指标或实现与frda相关的至少一种症状或指标的严重程度降低或延迟frda的进展所必需或足够的量，包括例如frda相关的疾病、病症或病况。在一些实施方案中，所公开的tat-fxn融合多肽的术语“治疗有效量”还可以是在被施用tat-fxn融合多肽的受试者的至少一个组织中引起hfxn量增加必需或足够的量。
[0173]“治疗有效剂量”是指对受试者的疾病或病症提供有效治疗的剂量。治疗有效剂量可因活性药物成分和受试者而异，并且可取决于如受试者的状况、受试者的遗传特征和递送途径等因素。
[0174]
弗里德里希共济失调和fxn
[0175]
尽管罕见，弗里德里希共济失调(frda)是人最常见的遗传性共济失调，在美国估计有4,000-5,000例。frda被认为是由于线粒体蛋白frataxin(fxn)，特别是人frataxin(hfxn)缺乏所致。fxn蛋白是在全身细胞中发现的必需且系统发育保守的蛋白质。最高水平的fxn发现于心脏、脊髓、肝、胰腺和骨骼肌中。fxn在细胞核中编码，在细胞质中表达并导入线粒体，在线粒体中加工成它的成熟形式。在人中，210个氨基酸的全长hfxn(23.1kda)在氨基端含有典型的线粒体靶向序列(mts)，当该序列被导入线粒体基质时，它被线粒体加工肽酶(mpp)进行两步切割。所得蛋白质是130个氨基酸、14.2kda的成熟hfxn蛋白。尚未鉴定其他线粒体内翻译后修饰。
[0176]
尚未定义fxn的确切功能。发表的文献和研究表明fxn可以在线粒体铁稳态，特别是在铁硫(fe-s)簇蛋白的从头生物合成(通过将铁呈递给fe-s簇组装酶支架蛋白)和血红素合成中发挥几种作用。在没有fxn的情况下，游离铁可以在线粒体中积累，含诱fe-s簇的
蛋白质失去活性。重要且关键的fe-s簇依赖性酶系统包括电子传递链的复合物i、ii和iii，以及krebs循环的乌头酸酶。
[0177]
frda通常表现为进行性多系统疾病，通常始于儿童中期。患者患有多种症状，其包括进行性神经和心脏功能障碍。其中的关键是背根神经节和小脑齿状核的原发性神经变性，其导致进行性肢体共济失调和构音困难的标志性临床发现。肥厚性心肌病也很常见，并且与frda受试者30至50岁时的早期死亡有关。其他临床发现可以包括脊柱侧弯、疲劳、糖尿病、视力损伤和听力损失。
[0178]
与frda相关的遗传是常染色体隐性遗传，其主要由hfxn基因的两个等位基因的第一个内含子中遗传的gaa三联体扩增引起。这种三联体扩增导致frda基因的转录抑制，导致患者仅产生少量的hfxn。杂合子(携带者)通常具有的hfxn水平为正常值的～50％，但表型正常。
[0179]
目前，没有fda批准的直接解决或改良与frda发生的fxn缺陷的治疗。
[0180]
tat-fxn融合多肽
[0181]
在一些实施方案中，本公开提供了tat-fxn融合多肽，即包含与人frataxin有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽(fxn，seq id no:4或seq id no:5)，该多肽融合至与tat-cpp(细胞渗透肽，seq id no：2或seq id no：7)有至少约90％序列同一性的氨基酸序列，如本文公开的。
[0182]
frataxin(例如，完整的人frataxin蛋白，seq id no：4)是在大多数真核生物中表达并靶向线粒体基质的必需且高度保守的蛋白质。它似乎在线粒体铁稳态，特别是在铁硫(fe-s)簇蛋白(通过将铁呈递给iscu支架蛋白)和血红素的从头生物合成中起作用。铁硫簇是线粒体中多种蛋白质复合物不可缺少的和必需的组分，该铁硫簇包括电子传递链的复合物i、ii和iii，以及krebs循环的乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶。铁硫簇也广泛用于细胞的整个细胞质和细胞核中。在它不存在的情况下，游离铁在线粒体中积累，含有fe-s的蛋白质失去活性，并且由于电子传递链损害和广泛的线粒体蛋白质乙酰化损失能量产生。
[0183]
在一些实施方案中，本文公开的tat-fxn融合多肽可包含与完整的人frataxin蛋白氨基酸序列(seq id no：4)有至少约90％序列同一性，例如约95％、约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的tat-fxn融合多肽可包含与成熟的人frataxin蛋白氨基酸序列(seq id no：5)有至少约90％序列同一性，例如约95％、约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
[0184]
在一些实施方案中，本文公开的tat-fxn融合多肽可在完整的人frataxin蛋白氨基酸序列(seq id no：4)中或在成熟的人frataxin蛋白氨基酸序列(seq id no：5)中包含至少一个点突变。可包含在frataxin中的点突变的实例描述于例如美国专利号9,217,019中，其全部内容通过引用并入本文。在一个特定实施方案中，tat-fxn融合多肽可包含在seq id no：4的氨基酸位置147或seq id no：5的位置67处的突变。例如，seq id no：4的氨基酸位置147或seq id no：5的氨基酸位置67处的赖氨酸(k)残基可以被不同的氨基酸残基，如组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基取代。在一个实施方案中，seq id no：4的氨基酸位置147或seq id no：5的氨基酸位置67处的赖氨酸(k)残基可以被精氨酸(r)残基取代。
[0185]
tat-cpp(细胞渗透肽，seq id no：2或seq id no：7)是短的阳离子肽，其来源于具有细胞渗透特性的hiv的较大的tat蛋白。tat已被用于将多种货物(如蛋白质)转导到动物的细胞和组织中。细胞渗透肽可以将多种分子(如蛋白质、肽或寡核苷酸)转运到细胞中，否则这些细胞无法吸收大分子量的化合物。细胞渗透肽对多种细胞器(如线粒体、溶酶体和细胞核)的货物递送已经完成，且它们能够将货物穿过胎盘递送。tat已被用于替代疾病动物模型(如嘌呤核苷磷酸化酶)和人线粒体疾病的动物模型(如硫辛酰胺脱氢酶缺乏症和弗里德里希共济失调)中缺失的细胞溶质酶。
[0186]
不希望受任何理论束缚，目前认为seq id no：2或seq id no：7的tat-cpp肽用于将tat-fxn融合多肽跨细胞膜递送到线粒体中。然后线粒体可以经由蛋白水解加工适当地加工tat-fxn融合多肽，以去除转运肽序列tat-cpp(seq id no：2或seq id no：7)和mts(seq id no：3)，释放成熟的fxn(hfxn蛋白的c端130个氨基酸；seq id no:5)和其他可能的活性降解物到线粒体中。
[0187]
在一些实施方案中，本文公开的tat-fxn融合多肽可以是具有seq id no：1的氨基酸序列的肽。因此，tat-fxn融合多肽可以是224个氨基酸的重组融合多肽，其包含短的阳离子细胞穿透肽tat-cpp(seq id no:2)，该细胞穿透肽通过二肽(gly-gly)接头融合至完整的人frataxin蛋白(hfxn)(seq id no:4)的氨基端，该完整的人frataxin蛋白包括hfxn的天然线粒体靶向序列(mts)(seq id no:3)。换言之，所公开的tat-fxn融合多肽可以是224个氨基酸的重组融合多肽，其包含短的阳离子细胞穿透肽tat-cpp(seq id no:2)，该细胞穿透肽通过二肽(gly-gly)接头融合至hfxn的天然线粒体靶向序列(mts)(seq id no:3)的氨基端，所述天然线粒体靶向序列融合到成熟人frataxin蛋白(hfxn)(seq id no:5)的氨基端。
[0188]
本公开提供的tat-fxn融合多肽，例如包含seq id no：1或由seq id no：1组成的融合多肽，展示了相对于先前由vyas等人公开的tat-fxn肽的几个技术改进。首先，本发明提供的tat-fxn融合多肽的大小比vyas等人所公开的更小。例如，seq id no:1的tat-fxn融合多肽的分子量为约24.92kda，而vyas等人的分子量为约29.28kda。这种分子量的降低使得tat-fxn融合多肽更容易合成和更容易溶解。
[0189]
第二，本发明提供的tat-fxn融合多肽没有不必要的序列。例如，seq id no：1的tat-fxn融合多肽比vyas等人的多肽短大约40个氨基酸。tat-fxn融合多肽的较短长度部分由于tat-fxn融合多肽中存在的短的2-氨基酸gly-gly接头。与vyas等人的多肽长度相比，tat-fxn融合多肽的更短的长度显著降低了tat-fxn融合多肽的抗原潜力，以帮助确保受试者在重复注射时不会对tat-fxn融合多肽产生体液免疫应答。体液免疫应答的产生会降低tat-fxn融合多肽的治疗效果。vyas等人公开的现有技术的多肽，由于其较大的大小，该多肽与产生此类免疫应答的风险增加有关；vyas等人的作者他们自己承认这一事实(见vyas等人，同上，第1242页)。抗原性风险的增加至少部分是由于vyas等人的接头的长度。
[0190]
相反，本发明提供的tat-fxn融合多肽在一些实施方案中仅含有1、2或3个氨基酸的接头，例如2-氨基酸gly-gly接头。该接头明确选择为最小化(如果不是消除)tat-fxn融合多肽在长时间引入受试者后触发体液免疫应答的风险。
[0191]
尽管选择的gly-gly接头预期将抗原性最小化(即，降低体液免疫应答的风险)，但应认识到，在一些实施方案中，可以使用其他短的、非抗原性接头代替gly-gly来连接tat和
fxn肽。此类替代接头在本领域中是已知的并且通常富含小氨基酸或极性氨基酸，如甘氨酸和丝氨酸，以提供良好的柔韧性和溶解性。尽管其他也是已知的(例如，gly-ser-ala-gly-ser-ala-ala-gly-ser-gly-glu-phe(seq id no：10))，替代接头的实例包括甘氨酸重复接头((gly)n；例如，(gly)8(seq id no:8))和主要由甘氨酸和丝氨酸的延伸组成的“gs”接头(例如，(gly-gly-gly-gly-ser)n(seq id no:9))。gly-gly的替代接头应保持短(例如，20个或更少的氨基酸，例如1、2或3个氨基酸)。本公开还考虑了使抗原性最小化、导致良好的融合多肽溶解度并且可从所需表达系统表达的替代接头。
[0192]
在一些实施方案中，本公开提供的tat-fxn融合多肽还可以省略接头。例如，tat-fxn融合多肽可以由以下组成：具有与seq id no:2或seq id no:7至少约90％序列同一性，例如至少约95％或约100％序列同一性的氨基酸序列的第一肽和具有与seq id no：4至少约90％序列同一性，例如至少约95％或约100％序列同一性的氨基酸序列的第二肽。在另一个实施方案中，tat-fxn融合多肽可以由以下组成：具有与seq id no：2或seq id no:7至少约90％序列同一性，例如至少约95％或约100％序列同一性的氨基酸序列的第一肽；具有与seq id no：3至少约90％的序列同一性，例如至少约95％或约100％的序列同一性的第二肽；和具有与seq id no：5至少约90％的序列同一性，例如至少约95％或约100％的序列同一性的第三肽。
[0193]
第三，在一些实施方案中，本公开提供的tat-fxn融合多肽，例如seq id no:1的tat-fxn融合多肽，其包含与人fxn蛋白具有100％序列同一性的fxn多肽，而vyas等人的多肽没有。例如，vyas等人的多肽与人fxn相比在其氨基酸序列中含有点突变。有与人frataxin的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列的本公开的tat-fxn融合多肽预期与线粒体加工肽酶的最佳序列识别和加工相关，并且与降低的tat-fxn融合多肽的抗原性相关。
[0194]
第四，vyas等人的多肽包含组氨酸(his)标签(6x his(seq id no:11))，而本文所述的tat-fxn融合多肽省略了his标签。vyas等人的多肽中存在的his标签是纯化标签，其便于学术目的。然而，his标签是抗原性的，这增加了vyas等人的多肽在重复注射到受试者体内时，该多肽会引发不希望的体液免疫应答的机会。
[0195]
第五，如上所述，tat-fxn融合多肽与vyas等人的多肽相比具有显著提高的溶解度。表1列出了本公开的tat-fxn融合多肽(seq id no:1)与vyas等人的多肽的几个物理参数的直接比较。
[0196]
表1
[0197]
参数vyas等人的tat-fxntat-fxn氨基酸数264224分子量29,277.90da24,922.26理论pi9.579.72(-)带电的aa的总数2923( )带电的aa的总数3934估计半衰期30小时30小时不稳定指数47.9353.51脂肪族指数68.0376.25亲水性(gravy指数)-0.754-0.610
[0198]
肽的gravy(亲水性的总平均值)值计算为所有氨基酸的亲水性值的总和除以序列中的残基数。数越大，肽越疏水。
[0199]
脂肪族指数是脂肪族侧链(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)占据的相对体积。它可以被认为是增加球状蛋白热稳定性的积极因素。
[0200]
本公开的tat-fxn融合多肽改善的溶解度由tat-fxn融合多肽的较大的脂肪族指数和其较小的亲水性指数证明。由于这些指标，本发明人现在可以在溶液中，例如在药物组合物中，实现》50mg/ml的tat-fxn融合多肽浓度。相比之下，vyas等人的多肽在溶液中的浓度在开始从溶液中沉淀出来之前不能超过约2mg/ml。可以理解，改善和维持的溶解度允许更精确的给药，并且可以显著减少实现所需效果所需的治疗剂量的体积。
[0201]
第六，与vyas等人的多肽相比，本公开的tat-fxn融合多肽可溶于较高ph的缓冲液中，特别是在生理ph下，使其与人皮下注射相容。
[0202]
第七，与纯化vyas等人的多肽采用的纯化策略相比，可以使用改善的纯化策略纯化tat-fxn融合多肽。vyas等人的多肽采用的纯化策略依赖于vyas等人的多肽的氨基端的6x his标签(seq id no:11)，由于有额外蛋白质的vyas等人的多肽将被拉下，引入杂质，这显著复杂化了纯化。这些不希望的杂质的存在需要多个额外的纯化步骤和/或层析分析步骤来产生纯化的肽。相反，本公开的tat-fxn融合多肽不含有或不依赖于his标签；因此，初始的纯化努力将产生更清洁的产品，需要较少的下游纯化以产生纯化的产品。如实施例2所示，单步纯化对于tat-fxn融合多肽的初始纯化绰绰有余，单步纯化的纯化水平为约90％或更高。
[0203]
核酸
[0204]
还提供了编码本文公开的tat-fxn融合多肽的核酸分子。还公开了在所选表达系统中对于表达进行优化的核酸序列。表达系统可以是大肠杆菌，优化的核酸序列(即，cdna)可以包含例如seq id no：6的核酸序列。seq id no：6的核酸序列对大肠杆菌中的表达是密码子优化的。
[0205]
编码tat-fxn融合多肽的核酸序列可以被包括在表达盒中，该表达盒用于所选的表达系统中。表达盒通常包括在盒的5'末端的，在tat-fxn融合多肽编码核酸序列上游的启动子。编码序列5'末端的非翻译dna可以包括有多个启动子和/或增强子元件的启动子区域，所述启动子和/或增强子元件可操作地连接到核酸序列以提供转录起始。
[0206]
编码tat-fxn融合多肽的核酸序列，例如本文公开的表达盒，可以包括在所选表达系统中可表达的表达载体中。在这点上，提供了重组表达载体，其包含编码本公开的tat-fxn融合多肽的核酸序列的。术语“重组表达载体”是指允许宿主细胞表达tat-fxn融合多肽的遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体。重组表达载体包含合适的载体主干，其用于转化或转染所选表达系统的宿主细胞。适用于各种表达系统的载体主干是已知的且包括质粒和病毒。可以使用本领域中描述的重组dna技术制备重组表达载体。
[0207]
重组表达载体可以包括与编码tat-fxn融合多肽的核酸序列可操作地连接的天然或非天然启动子。
[0208]
重组表达载体可以包括调节序列，如转录和翻译起始密码子和终止密码子，该调节序列适当地对于将要引入载体的宿主细胞(例如大肠杆菌)的类型是特定的。重组表达载体还可以包括限制性位点以促进克隆。
[0209]
重组表达载体可以包括一种或多种标记基因，其允许选择转化或转染的宿主细胞。标记基因包括杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，营养缺陷型宿主中的互补以提供原养，等。
[0210]
还提供了宿主细胞，其包括本文所述的表达盒或表达载体。术语“宿主细胞”是指可以含有和表达本文所述的表达盒或表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如酵母、植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即在悬浮物中生长的细胞。合适的宿主细胞包括例如大肠杆菌细胞。
[0211]
还提供了宿主细胞群。宿主细胞群可以是细胞克隆群，其中该群的所有细胞都是包括重组表达载体的单个宿主细胞的克隆。
[0212]
tat-fxn融合多肽可以从宿主细胞或宿主细胞群中分离和/或纯化。
[0213]
治疗用途
[0214]
tat-fxn融合多肽可以施用于受试者以治疗与fxn缺乏相关的任何病况。tat-fxn融合多肽是嵌合蛋白，其包含与hiv-1tat-cpp(细胞渗透肽)连接的fxn蛋白的功能形式。不希望受任何理论束缚，tat-fxn融合多肽的一种可能的作用机制是将成熟的fxn和其他可能的活性降解物递送至受试者的线粒体。对线粒体的递送可以经由tat肽递发生。一旦在线粒体中，融合多肽的蛋白水解加工将导致成熟fxn的释放。在fxn缺陷的受试者中，直接向线粒体提供成熟的fxn可以补充(如果不能完全替代)fxn中的缺陷。
[0215]
弗里德里希共济失调
[0216]
施用本公开提供的至少一个治疗有效剂量的tat-fxn融合多肽可以在临床上有效治疗弗里德里希共济失调(frda)。
[0217]
目前预计使用tat-fxn融合多肽的蛋白质替代疗法将纠正frda中的代谢缺陷并恢复患者足够的细胞功能。还预计使用tat-fxn融合多肽的治疗将使frda从进行性和致命的疾病转变为慢性病，就像胰岛素已将糖尿病转变为具有正常生活活动的慢性病一样，该疾病通过频繁注射融合多肽来管理。在已确诊疾病的老年frda患者中，施用tat-fxn融合多肽预计将阻止疾病进展。在出现frda症状之前被诊断出的儿童中，施用tat-fxn融合多肽预计将导致组织功能和健康几乎完全的保存。
[0218]
frda的基因缺陷于1996年被识别，该领域的共识是线粒体中缺乏fxn蛋白是生化缺陷。多名研究人员已经表明，在缺陷患者成纤维细胞中，甚至在具有fxn丧失的酵母中替代fxn将挽救表型。因此，该领域的共识是，frda的治疗必须包括增加受影响组织线粒体中fxn蛋白的水平。虽然fxn的精确功能还有待定义，但显然fxn参与了铁硫簇的组装。在它不存在的情况下，含有铁硫簇(电子传递链的复合物i、ii和iii，以及krebs循环的乌头酸酶)的线粒体蛋白的活性严重缺陷。结果，那些高度依赖线粒体产生能量的组织，如心脏和脑，受到严重影响，且超过约60％的患者死于心力衰竭。与其他线粒体疾病一样，多个器官系统也会受到影响，如眼睛、听力和胰腺。因此，临床相关的靶组织包括心脏和脑可以进行常见的临床测试追踪，如超声心动图和神经学测定，如弗里德里希共济失调评定量表(fars)。
[0219]
因此，所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物的施用可以作为蛋白质替代疗法在被诊断患有frda(包括，例如frda相关疾病、病症或病况)的fxn缺陷受试者中有效治疗frda(包括，例如frda相关疾病、病症或病况)。
[0220]
如本文所用，术语“frda”涵盖与frataxin缺乏相关的任何疾病、病症或病况。如本文所用，术语“frda相关疾病、病症或病况”涵盖继发于frda和/或由frda引起的疾病、病症或病况，即，当存在于受试者中时，它伴随frda并且不存在于在没患frda的受试者中。frda相关疾病、病症或病况的非限制性实例包括frda相关肺炎、frda相关肥厚性心肌病和frda相关糖尿病。frda相关疾病、病症或病况的其他非限制性实例包括但不限于以以下表征的frda相关疾病、病症或病况：
[0221]
(1)神经系统缺陷，包括但不限于以下一项或多项：本体感觉丧失、反射丧失、行走能力丧失、用眼睛保持凝视的能力丧失；
[0222]
(2)吞咽受损和/或吞咽能力的进行性丧失；进行性听力丧失；
[0223]
(3)由于缺乏fxn导致的视网膜变性导致的进行性视力丧失；
[0224]
(4)进行性语言丧失；
[0225]
(5)代谢综合征，其包括但不限于甘油三酯升高、低高密度脂蛋白(hdl)胆固醇和升高的低密度脂蛋白(ldl)胆固醇；
[0226]
(6)需要手术矫正的脊柱侧弯；和/或其组合。
[0227]
在一些实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可以治疗frda，frda包括例如frda相关的疾病、病症或病况。如本文所用，“治疗frda”涵盖改进、改善frda或实现frda严重程度的降低，frda包括例如frda相关的疾病、病症或病况。例如，“治疗frda”涵盖改进、改善至少一种与frda相关的症状或指标或实现至少一种与frda相关的症状或指标的减少。如本文所用，“治疗frda”还涵盖延迟frda的进展，frda包括例如frda相关的疾病、病症或病况，例如在受试者中延迟至少一种与frda相关的症状或指标的出现或防止受试者中至少一种与frda相关的症状或指标严重程度的增加。
[0228]
在一些实施方案中，术语“治疗frda”还涵盖实现患有frda(包括例如frda相关疾病、病症或病况)的受试者(例如人)的存活率(例如存活时间)增加。例如，frda的治疗可导致患有frda(包括例如frda相关疾病、病症或病况)的受试者(例如人)的预期寿命增加。在一些实施方案中，在本公开的上下文中治疗frda可导致受试者的预期寿命与一个或多个患有类似疾病且未经治疗的对照个体的平均预期寿命相比增加大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约100％、大于约110％、大于约120％、大于约130％、大于约140％、大于约150％、大于约160％、大于约170％、大于约180％、大于约190％或大于约200％或更多。
[0229]
在一些实施方案中，在本公开的上下文中，frda(包括例如frda相关疾病、病症或病况)的治疗可导致受试者的预期寿命与一个或多个患有类似疾病且未经治疗的对照个体的平均预期寿命相比增加大于约6个月、大于约8个月、大于约10个月、大于约12个月、大于约2年、大于约4年、大于约6年、大于约8年或大于约10年或更长。在一些实施方案中，frda(包括例如frda相关疾病、病症或病况)的治疗在本公开的上下文中可以导致患有frda(包括例如frda相关疾病、病症或病况)的受试者(例如人)的长期存活。如本文所用，术语“长期存活”是指存活时间或预期寿命长于约40年、45年、50年、55年、60年或更长。
[0230]
本领域普通技术人员已知的临床评估可用于评估frda(包括例如frda相关的疾病、病症或病况)以确定frda的严重程度和/或确定向患者施用公开的tat-fxn融合多肽和/
或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物的效果。frda的临床评估(包括frda严重程度的评估)的方法的实例在例如paap等人的“standardized assessment of hereditary ataxia patients in clinical studies”,mov disord clin pract.2016,3(3):230-240和patel等人的“progression of friedreich ataxia:quantitative characterization over 5years”,ann clin transl neurol 2016,3(9):684-694中描述，每篇文献的全部内容通过引用并入本文。
[0231]
定时25英尺步行(timed 25-foot walk，t25-fw)是定量移动性和腿部功能性能测试，其用于测量完成25英尺步行所需的时间。在一些实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可以导致frda的严重程度降低，如例如通过完成25英尺的步行所需时间所测量的。例如，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致完成25英尺步行所需的时间与在施用公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前受试者完成25英尺步行所需的时间相比减少或与基线值相比减少，例如，完成25英尺步行所需的时间减少至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。基线值可以是在施用本公开所公开的tat-fxn融合多肽之前测量的完成25-英尺步行所需的时间。
[0232]
在其他实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可以延迟受试者中frda的进展，如例如通过完成25英尺步行所需的时间所测量的。例如，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致如与基线值(即在施用公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的完成25英尺步行所需的时间)相比完成25英尺步行所需的基本相似的时间或完成25英尺步行所需的时间缺乏大幅增加(例如，完成25英尺步行所需的时间增加少于20％、少于10％或少于5％)。
[0233]
修饰的弗里德里希共济失调评定量表(modified friedreich’s ataxia rating scale，mfars)是用于评估frda的严重程度的，基于检查的评定量表，如burk等人,“monitoring progression in friedreich ataxia(frda)the use of clinical scales”,j of neurochemistry 2013,126(suppl.1):118-124和rummey等人,“psychometric properties of the friedreich’s ataxia rating scale”,neurol genet 2019,5:e371中所描述的，每篇文献的全部内容通过引用并入本文。
[0234]
在一些实施方案中，mfars评分可以包含以下子评分中的至少一个：a)基于功能失能评定量表(functional disability rating scale)(fars-fds；0-6级；通常由神经科医生进行的评估)的评分；b)基于日常生活活动量表(fars-adl，0-36级；由患者或护理人员进行的评估)的评分；以及c)基于神经评分量表(fars-neuro)0-125级；由神经科医生进行的评估)的评分。在一些实施方案中，fars_adl评分是评估受试者完成adl(例如，说话、切食物、穿衣和个人卫生)的能力的fars等级量表，评分范围从0到36分。被访者可以是受试者；受试者和家庭的组合；或无法完成测试的受试者的家庭成员、配偶或护理人员。
[0235]
在一些实施方案中，基于神经评定量表的评分可以包括神经评定量表的修改评分，其涉及直接的受试者参与和靶向受frda影响的特定区域，如延髓、上肢、下肢和直立稳定性(mfars-neuro,0-99级)。mfars-neuro从fars问卷的神经评定量表中排除了子量表d(外周神经系统)和子量表a(延髓)的前2个问题。
[0236]
在一些实施方案中，mfars评分可以基于从完整的fars问卷衍生的两个子评分：如上所述的mfars-neuro和如上所述的fars_adl。
[0237]
在一些实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致frda的严重程度降低，如通过例如mfars评分或至少一个如本文所述的mfars子评分所测量的。例如，如与基线相比(即在施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的mfars评分或至少一个mfars子评分)，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致mfars评分或至少一个mfars子评分的降低。
[0238]
在其他实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可以延迟受试者中frda的进展，如通过例如mfars评分或在至少一个本文公开的mfars子评分所测量的。例如，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致与基线值(即在施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的mfars评分或在至少一个mfars子评分)相比或与基线值相比基本相似的mfars评分或相似的至少一个mfars子评分或mfars评分或至少一个mfars子评分的基本缺乏的增加。
[0239]
九孔钉测试(nine-hole peg test,9hpt)可用于测量患有frda受试者的手指灵活性。在这个测试中，受试者被要求从容器中取出钉子，并尽快一一将它们放入板上的九个孔中。然后受试者必须从孔中取出钉子，然后一一将它们放回容器中。评分基于完成测试活动所用的时间，其以秒为单位记录。
[0240]
在一些实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致frda的严重程度降低，如例如通过9hpt评分测量的。例如，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致如完成测试活性的时间表示的9hpt评分与基线值(即在施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的9hpt评分)相比降低(例如如完成测试活性的时间表示的9hpt评分降低至少约5％、10％、25％或50％)。
[0241]
在其他实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可以延迟受试者中frda的进展，如通过例如9hpt评分所测量的。例如，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致与基线值(即在施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的9hpt评分)相比基本上相似的9hpt评分或如完成测试活性的时间表示的9hpt评分缺乏显著增加。
[0242]
在一些实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物导致与基线水平(即在施用公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物体液中的hfxn水平)相比受试者的至少一种组织或生物体液中hfxn水平的增加。在一些实施方案中，受试者的至少一种组织或生物体液中hfxn水平的增加是由于向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物引起的，该hfxn水平的增加足以具有治疗效果，即足以治疗受试者的frda。
[0243]
在一些实施方案中，向患有frda的受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致受试者的至少一种组织或生物体液中的hfxn水平低于没患frda的受试者(例如，正常、健康受试者)的至少一种组织或生物体液中的hfxn水平，但仍足以具有治疗效果，即足以治疗受试者的frda。例如，在将所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物施用于患有frda的受试者后，受试者的至少一种组织或生物体液中的hfxn水平可以是没患frda的受试者(例如，正常、健康受试者)的至少一种组织或生物体液中hfxn水平的约10％至约50％、约20％至约60％或约30％至约80％，但hfxn的水平仍然足以具有治疗效果，即足以治疗受试者的frda。
[0244]
在一些实施方案中，向患有frda的受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致受试者的至少一种组织或生物体液中hfxn水平与施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物体液中的hfxn水平相比或与基线水平相比增加至少约5％、约10％、约25％、约50％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％或约600％。
[0245]
在一些实施方案中，向患有frda的受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致受试者的至少一种组织或生物体液中hfxn水平与施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物体液中的hfxn水平相比或与基线水平相比增加约5％至约30％、约10％至约50％、约25％至约100％、约50％至约150％、约100％至约300％、约50％至约250％、约150％至约500％或约200％至约700。在一些实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致受试者的至少一种组织或生物体液中hfxn水平与施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物体液中的hfxn水平相比或与基线水平相比增加至少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍。在一些实施方案中，向受试者施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含所公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物可导致受试者的至少一种组织或生物体液中hfxn水平与施用所公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物体液中的hfxn水平相比或与基线水平相比增加约2倍至约5倍之间或约2倍至约10倍之间。
[0246]
在一些实施方案中，可以在hfxn水平得到测量和/或增加的受试者的组织可以是能够进行生检的任何组织。在一些实施方案中，该组织可以包含支气管肺泡组织(其可以通过例如支气管肺泡刷来取样)、粘膜(例如鼻粘膜，其可以通过例如鼻刷来取样)、毛发毛囊、皮肤组织或颊组织。在一些实施方案中，该组织包含皮肤组织或颊组织。
[0247]
在一些实施方案中，可以在hfxn水平得到测量和/或增加的受试者的生物体液可以是血液或其组分(例如血清、血浆、血小板或任何其他血组分)、尿液或唾液。
[0248]
frda相关肺炎
[0249]
被诊断患有frda的受试者会患有背根神经节的神经变性，从而导致进行性共济失调。这通常会导致逐渐丧失行走、自主进食、说话、吞咽和肺呼吸的能力。肺呼吸事件可导致肺炎、频繁住院，并最终自诊断之日起10至15年时间段内死亡。
[0250]
由于上述许多原因，施用公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合
多肽的药物组合物在诊断患有frda的fxn缺陷受试者中可有效地作为蛋白质替代疗法以防止肺呼吸，从而预防肺呼吸后的肺炎。因此，本公开提供了治疗受试者的frda相关肺炎的方法，其包括向有需要的受试者施用本公开的tat-fxn融合多肽，从而治疗受试者的frda相关肺炎。
[0251]
frda相关肥厚性心肌病
[0252]
肥厚性心肌病是心脏肌肉变厚，使心脏难以通过循环系统泵血的病况。它可能是由心脏细胞线粒体中的fxn缺乏引起的。在诊断患有frda的受试者中，进行性肥厚性心肌病，约50％的时间发展为心力衰竭和死亡。使用公开的tat-fxn融合多肽的蛋白质替代疗法可以替代肥厚性心肌病潜在的fxn缺陷。
[0253]
因此，施用公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物在诊断患有frda和肥厚性心肌病的fxn缺陷受试者中可有效地作为蛋白质替代疗法。因此，本公开提供了治疗受试者的frda相关的肥厚性心肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用本公开的tat-fxn融合多肽，从而治疗受试者的frda相关肥厚性心肌病。
[0254]
糖尿病
[0255]
糖尿病的标志是无法适当调节葡萄糖的血液水平，导致血糖水平升高。在诊断患有frda的受试者中，糖尿病通常是由于胰腺中fxn缺陷的线粒体而出现的。使用公开的tat-fxn融合多肽的蛋白质替代疗法可以替代糖尿病潜在的fxn缺陷。
[0256]
因此，施用公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物在诊断患有糖尿病的fxn缺陷受试者中可以有效地作为蛋白质替代疗法。因此，本公开提供了治疗受试者的frda相关糖尿病的方法，其包括向有需要的受试者施用本公开的tat-fxn融合多肽，从而治疗受试者的frda相关糖尿病。
[0257]
其他frda相关疾病/病症
[0258]
诊断患有frda的受试者经常经历与fxn缺乏相关的其他病症。此类frda相关病症可包括但不限于：神经性病症，包括但不限于本体感觉丧失、反射丧失、行走能力丧失、用眼睛保持凝视的能力丧失；吞咽受损和/或吞咽能力逐渐丧失；进行性听力丧失；由于缺乏fxn导致的视网膜变性导致的视力逐渐丧失；进行性语言丧失；代谢综合征，包括但不限于甘油三酯升高、低高密度脂蛋白(hdl)胆固醇和升高的低密度脂蛋白(ldl)胆固醇；需要手术矫正的脊柱侧弯；和/或其组合。使用公开的tat-fxn融合多肽的蛋白质替代疗法可以替代这些疾病/病症潜在的fxn缺陷。
[0259]
因此，施用公开的tat-fxn融合多肽和/或包含公开的tat-fxn融合多肽的药物组合物在诊断患有frda并经历神经性病症的fxn缺陷受试者中可以有效地作为蛋白质替代疗法。该神经性病症包括但不限于本体感觉丧失、反射丧失、行走能力丧失、用眼睛保持凝视的能力丧失；吞咽受损和/或吞咽能力逐渐丧失；进行性听力丧失；由于缺乏fxn导致的视网膜变性导致的视力逐渐丧失；进行性语言丧失；代谢综合征，包括但不限于甘油三酯升高、低hdl胆固醇和升高的ldl胆固醇；需要手术矫正的脊柱侧弯；和/或其组合。
[0260]
因此，本公开提供了治疗frda相关疾病、病症或病况的方法，其包括向有需要的受试者施用本公开的tat-fxn融合多肽，其中frda相关疾病、病症或病况选自以下：本体感觉丧失、反射丧失、行走能力丧失、用眼睛保持凝视的能力丧失；吞咽受损和/或吞咽能力逐渐丧失；进行性听力丧失；由于缺乏fxn导致的视网膜变性导致的视力逐渐丧失；进行性语言
丧失；代谢综合征，包括但不限于甘油三酯升高、低hdl胆固醇和升高的ldl胆固醇；和需要手术矫正的脊柱侧弯。
[0261]
在一些实施方案中，本公开还提供了治疗frda(包括例如frda相关的疾病、病症或病况)的方法，其包括向有需要的受试者施用药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的媒介物、载体和/或赋形剂和公开的tat-fxn融合多肽，例如含有以下或由以下组成的tat-fxn融合多肽：浓度大于或等于2mg/ml的seq id no:1和药学上可接受的媒介物、载体和/或赋形剂。例如，该方法可以包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物，其中所公开的tat-fxn融合多肽以大于或等于以下浓度存在于药物组合物中：约2mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml或约100mg/ml。在一些实施方案中，公开的tat-fxn融合多肽可以以下浓度存在于药物组合物中：约2.5mg/ml-约5mg/ml、约4mg/ml-约10mg/ml、约5mg/ml
–
约25mg/ml、约15mg/ml
–
约30mg/ml、约20mg/ml
–
约50mg/ml、约25mg/ml
–
约60mg/ml、约35mg/ml
–
约75mg/ml、约50mg/ml
–
约80mg/ml或约90mg/ml
–
约100mg/ml。或者，公开的tat-fxn融合多肽可以以下浓度存在于药物组合物中：约2.5mg/ml-约10mg/ml、约5mg/ml-约50mg/ml、约20mg/ml-约75mg/ml或约25mg/ml
–
约100mg/ml。在一些实施方案中，所述方法包括施用如本文所述的药物组合物，其中该药物组合物是可注射的药物组合物，例如适合于皮下施用。
[0262]
施用和给药
[0263]
公开的tat-fxn融合多肽可以通过注射施用于受试者。注射可以是静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内或皮内的。可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮物可以根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮物，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂是水、ringer溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常采用不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用包括合成的甘油单酯或甘油二酯的任何温和的不挥发性油。此外，脂肪酸(如油酸)可用于制备注射剂。可以使用二甲基乙酰胺、包括离子和非离子洗涤剂的表面活性剂和聚乙二醇。也可以使用如上所讨论的那些溶剂和润湿剂的混合物。
[0264]
在各个方面，公开的tat-fxn融合多肽通过皮下注射施用。皮下注射通常以推注(bolus)施用到真皮正下方的皮肤层中。由于在该位置几乎没有血管，因此施用至该位置的药物成分通常会随着时间缓慢释放，以提供公开的tat-fxn融合多肽吸收到受试者中的持续速率。
[0265]
静脉内给予的注射体积通常在5-20ml范围内。相比之下，皮下给予的注射体积通常仅在0.05至1ml之间，通常最大体积为约1.5ml，因此此类注射中药物成分的浓度必须足够高才能实现所需的治疗效果。在这方面，由公开的tat-fxn融合多肽展示的改善的溶解度是有利的，因为它在溶液中时将允许更大的浓度，从而适应经由皮下注射的施用。
[0266]
通过注射的施用通常需要以药学上可接受的方式配制肽以注射到受试者中，其中在一些实施方案中受试者是人。在一些实施方案中，公开的tat-fxn融合多肽通过溶解到药学上可接受的媒介物中被配制用于皮下注射。在各个方面，药学上可接受的媒介物还可以
包括一种或多种赋形剂。
[0267]
有许多合适的药学上可接受的媒介物可用于公开的tat-fxn融合多肽的药物配制剂中。合适的媒介物包括例如水、盐水溶液、乙酸钠、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、油乳液等。乳液包括以油为分散相的水包油乳液和以油为连续相的油包水乳液。油可以是植物来源的或合成产生的。合适地，乳液的植物油是大豆油或红花油，或它们的任何组合。在一些实施方案中，媒介物是乙酸钠。
[0268]
有许多合适的药学上可接受的赋形剂可用于公开的tat-fxn融合多肽的药物配制剂中。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是丙二醇。
[0269]
因此，在一个方面，本公开提供了用于经由皮下注射施用于受试者的药物组合物，其包含：(a)治疗有效量的公开的tat-fxn融合多肽；(b)一种或多种药学上可接受的媒介物；和(c)药学上可接受的赋形剂。
[0270]
药物组合物的ph可以变化。在各个方面，期望将药物组合物的ph维持在生理水平，例如ph在约5-7之间、约5-6之间、约5.5-6.5之间或约6-7之间。在一个实施方案中，药物组合物的ph为约5、约5.5、约6、约6.5或约7。在一个实施方案中，药物组合物的ph为约5。
[0271]
用于经由皮下注射施用于受试者的药物组合物可以包含：
[0272]
(a)公开的tat-fxn融合多肽，其量选自10-100mg/ml、10-50mg/ml、10mg/ml和50mg/ml；
[0273]
(b)浓度为50mm的乙酸钠；和
[0274]
(c)丙二醇，其量为组合物总体积的1％；
[0275]
其中组合物的ph为5.0。
[0276]
另一种药物组合物可以包含浓度大于或等于2mg/ml的公开的tat-fxn融合多肽和药学上可接受的媒介物、载体和/或赋形剂。例如，公开的tat-fxn融合多肽可以以大于或等于以下的浓度存在于药物组合物中：约2mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml或约100mg/ml。在一些实施方案中，公开的tat-fxn融合多肽可以以下浓度存在于药物组合物中：约2.5mg/ml-约5mg/ml、约4mg/ml-约10mg/ml、约5mg/ml
–
约25mg/ml、约15mg/ml
–
约30mg/ml、约20mg/ml
–
约50mg/ml、约25mg/ml
–
约60mg/ml、约35mg/ml
–
约75mg/ml、约50mg/ml
–
约80mg/ml或约90mg/ml
–
约100mg/ml。或者，公开的tat-fxn融合多肽可以以下浓度存在于药物组合物中：约2.5mg/ml-约10mg/ml、约5mg/ml-约50mg/ml、约20mg/ml-约75mg/ml或约25mg/ml
–
约100mg/ml。药物组合物可以是可注射的药物组合物，其在进一步的实施方案中适用于皮下施用。
[0277]
药学上可接受的媒介物可以是水性媒介物，如例如水、盐水溶液或水性缓冲液，如乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。存在于药物组合物中的公开的tat-fxn融合多肽完全溶解在药学上可接受的媒介物中。如本文所用，术语“完全溶解在药物组合物中”是指包含公开的tat-fxn融合多肽并且是澄清溶液和/或不包含可见沉淀物的药物组合物。
[0278]
包含公开的包含浓度大于或等于2mg/ml的tat-fxn融合多肽的药物组合物是基于惊人的发现而制备的，该惊人的发现是公开的tat-fxn融合多肽展示出比vyas等人的多肽显著更高的溶解度(例如，在水溶液中的溶解度)。例如，如上所述，可以制备包含浓度为约
50mg/ml或大于约50mg/ml的公开的tat-fxn融合多肽的组合物(例如，水性组合物)。相比之下，vyas等人的多肽在vyas多肽从溶液中沉淀出来之前不能超过约2mg/ml。
[0279]
本文提供的药物组合物包含浓度大于或等于2mg/ml的公开的tat-fxn融合多肽，其允许通过皮下注射以大于或等于2mg/注射的量向受试者施用公开的tat-fxn融合多肽。例如，公开的tat-fxn融合多肽可以以大于或等于以下的量通过皮下注射施用于受试者：2mg/注射、5mg/注射、10mg/注射、15mg/注射、20mg/注射、25mg/注射、30mg/注射、35mg/注射、40mg/注射、45mg/注射、50mg/注射、55mg/注射、60mg/注射、65mg/注射、70mg/注射、75mg/注射、80mg/注射、85mg/注射、90mg/注射、95mg/注射或100mg/注射。例如，公开的tat-fxn融合多肽可以以下量通过皮下注射施用至受试者：约2mg/注射-约150mg/注射、约2mg/注射-约100mg/注射、约10mg/注射-约150mg/注射、约20mg/注射-约150mg/注射、2.5mg/注射-约5mg/注射、约4mg/注射-约10mg/注射、约5mg/注射-约25mg/注射、约15mg/注射-约30mg/注射、约20mg/注射-约50mg/注射、约25mg/注射-约60mg/注射、约35mg/注射-约75mg/注射、约50mg/注射-约80mg/注射、约90mg/注射-约120mg/注射和/或约100mg/注射-约150mg/注射。公开的tat-fxn融合多肽可以以下浓度存在于药物组合物中：约2.5mg/注射-约10mg/注射、约5mg/注射-约50mg/注射、约20mg/注射-约75mg/注射、约25mg/注射-约100mg/注射或约50mg/注射-约150mg/注射。
[0280]
在一些实施方案中，本发明提供的药物组合物可以包含tat-fxn融合多肽和药学上可接受的载体，其中融合多肽可以以大于约4mg/ml的浓度存在于药物组合物中；并且其中融合多肽可以包含第一肽或由第一肽组成，该第一肽包含细胞渗透肽(cpp)；第二肽，其具有与seq id no：4的氨基酸序列有至少约90％序列同一性，例如至少约95％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的药物组合物可以包含tat-fxn融合多肽和药学上可接受的载体，其中融合多肽可以以大于约4mg/ml的浓度存在于药物组合物中；并且其中的融合多肽可以包含第一肽或由第一肽组成，该第一肽包含细胞渗透肽(cpp)；第二肽，其具有与seq id no：3的氨基酸序列有至少90％序列同一性，例如至少约95％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列；第三肽，其具有与seq id no：5的氨基酸序列有至少90％序列同一性，例如至少约95％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
[0281]
细胞渗透肽(cpp)是短肽序列，通常在5到30个氨基酸长之间，可以促进细胞摄取各种分子货物，如蛋白质。在本公开的上下文中有用的cpp可以是本领域技术人员已知的任何cpp。例如，包含在本公开的融合多肽中的cpp可以是在细胞穿透肽cppsite 2.0数据库中列出的任何cpp，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，在本公开的上下文中有用的cpp可以包含如例如在us 10,576,124中描述的芳香族阳离子肽，其全部内容通过引用并入本文。例如，芳香族阳离子肽可以是2'，6'二甲基-tyr-d-arg-phe-lys-nh2。在一些实施方案中，在本发明的上下文中有用的cpp可以是选择的tat-cpp(例如，seq id no：2或seq id no：7)、加兰肽(galanin)、黄蜂毒素(mastoparan)、转运蛋白(transportan)、渗透素(penetratin)、聚精氨酸(polyarginine)或vp22。
[0282]
本发明提供的药物组合物可以包含tat-fxn融合多肽和药学上可接受的载体，其中融合多肽可以大于约4mg/ml的浓度存在于药物组合物中；并且其中融合多肽可以包含第一肽或由第一肽组成，该第一肽具有与seq id no:2或seq id no:7的氨基酸序列有至少约
90％序列同一性，例如至少约95％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列；第二肽，其具有与seq id no：4的氨基酸序列有至少约90％序列同一性，例如至少约95％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
[0283]
在一些实施方案中，本公开提供的药物组合物可以包含tat-fxn融合多肽和药学上可接受的载体，其中融合多肽可以以大于约4mg/ml的浓度存在于药物组合物中并且其中融合多肽可以包含第一肽或由其组成，该第一肽具有与seq id no:2或seq id no:7的氨基酸序列有至少90％序列同一性，例如至少约95％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列；第二肽，其具有与seq id no：3的氨基酸序列有至少90％序列同一性，例如至少约95％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列；第三肽，其具有与seq id no：5的氨基酸序列有至少90％序列同一性，例如至少约95％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
[0284]
在一些实施方案中，融合多肽可进一步包含位于第一和第二肽之间的1、2或3个氨基酸的接头，例如2-氨基酸接头，如gly-gly。
[0285]
基于公开的tat-fxn融合多肽的个体受试者的敏感性、对随时间给药量的耐受性等，公开的tat-fxn融合多肽的给药可因受试者而异。通常，基于给定配制剂中活性组合物的毫克每千克受试者体重，施用于受试者的公开的tat-fxn融合多肽的量可以在每天约5mg kg-1
至约60mg kg-1
的范围内。总剂量必要时可以作为单剂量一次施用或者可以分成两个或多个剂量每天施用多次以实现所需的治疗效果。在一些情况下，可以在任何一个24小时周期内向给定患者施用三个或更多个剂量的公开的tat-fxn融合多肽；对治疗反应良好的患者可以施用较少的剂量。
[0286]
通常，将向受试者施用被医疗保健提供者认为安全的起始剂量，并且将根据个体受试者的耐受性和fxn的组织水平向上或向下滴定剂量以达到所需的治疗效果。例如，受试者的推荐起始剂量可以是30mg kg-1
，每天皮下施用3次。医疗保健提供者将施用该剂量，然后通过进行皮肤生检并测量本文存在的公开的tat-fxn融合多肽的量来监测公开的tat-fxn融合多肽的水平。存在的量将与已知基线进行比较，例如在健康受试者中观察到的，公开的tat-fxn融合多肽的剂量将根据需要递增或递减滴定，以将皮肤水平维持在靶量和/或以实现预期的治疗益处，达到最大剂量为每天60mg kg-1
。可以以1天、1周或更长的时间间隔滴定剂量。
[0287]
在一些实施方案中，本公开的tat-fxn融合多肽可以以下剂量施用于受试者：约10mg至约150mg，例如约10mg至约30mg、约20mg至约75mg、约50mg至约100mg或约100mg至约150mg。例如，tat-fxn融合多肽可以以下剂量施用于受试者：约25mg、约50mg、约75mg、约100mg或约150mg。在一些实施方案中，该剂量可以每天施用一次。在一些实施方案中，本公开的tat-fxn融合多肽可以以下剂量施用于受试者：每天约5mg kg-1
至约60mg kg-1
，例如约10mg kg-1
至50mg kg-1
每天、约20mg kg-1
至40mg kg-1
每天、约30mg kg-1
至40mg kg-1
每天、约40mg kg-1
至50mg kg-1
每天、约50mg kg-1
至60mg kg-1
每天、约5mg kg-1
至10mg kg-1
每天、约10mg kg-1
至15mg kg-1
每天、约15mg kg-1
至20mg kg-1
每天、约20mg kg-1
至25mg kg-1
每天、约25mg kg-1
至30mg kg-1
每天、约30mg kg-1
至35mg kg-1
每天、约35mg kg-1
至40mg kg-1
每天、约40mg kg-1
至45mg kg-1
每天、约45mg kg-1
至50mg kg-1
每天、约50mg kg-1
至55mg kg-1
每天、约55mg kg-1
至60mg kg-1
每天。在一些实施方案中，本公开的tat-fxn融合多肽可以以下剂量
施用于受试者：每天约0.05mg kg-1
至约20mg kg-1
，例如约0.05mg kg-1
至0.5mg kg-1
每天、约0.1mg kg-1
至1mg kg-1
每天、约0.5mg kg-1
至5mg kg-1
每天、约1mg kg-1
至10mg kg-1
每天、约2mg kg-1
至15mg kg-1
每天、约5mg kg-1
至15mg kg-1
每天或约10mg kg-1
至约10mg kg-1
每天。
[0288]
除了上面提到的皮肤生检，确定给定受试者的有效剂量的标准包括监测治疗期间受试者显示和/或报告的症状。在开始用公开的tat-fxn融合多肽治疗之前，受试者将经历或已经经历广泛的医学评估。对被诊断患有弗里德里希共济失调的受试者进行的典型医学评估可能包括测量以下一项或多项：神经功能、心脏功能、粗大和精细运动技能、听力、言语、视力、糖尿病的血液检查和吞咽。
[0289]
在治疗之前进行的评估的结果可以作为评估该施用的治疗的有效性的基线。这种“基线”评估可能是为任何给定受试者设计和调整适当给药方案的过程的一部分。可以根据需要增加或减少施用剂量以在受试者中产生所需的治疗效果。给药评估的要素可以包括来自受试者的关于活动性、平衡、感觉、情绪、疲劳、耐力、力量和与弗里德里希共济失调诊断相关的任何其他生理或心理特征的变化的反馈。
[0290]
本公开提供的药物组合物可考虑以下任何一项或多项进行配制：易于储存、运输、稳定性和患者便利性。配制剂可包括预装注射器、小瓶、瓶子等。在一些实施方案中，可以将公开的tat-fxn融合多肽冻干并放入无菌小瓶中用于储存和/或运输。为了产生药物组合物，可以将冻干肽与无菌媒介物、无菌赋形剂混合以产生适合皮下施用的药物组合物。
[0291]
tat-fxn融合多肽或药物组合物可用于制造(即制备)用于施用于受试者的药物。该药物是包含tat-fxn融合多肽的治疗组合物。药物组合物可以与药物相同。
实施例
[0292]
实施例1
[0293]
本研究的主要目的是确定公开的tat-fxn融合多肽，如与相同基因型的媒介物处理的小鼠相比是否可以显著延长弗里德里希共济失调(frda)小鼠模型mck-cre fxn ko小鼠(也称为mck-cre)的寿命。这种基因型的小鼠在心脏和骨骼肌中具有消融的frda基因，因此在这些组织中缺乏frataxin(fxn)。这些小鼠展示出frda的心脏表型，其包括严重的肥厚性心肌病，与野生型小鼠相比，这导致存活降低。
[0294]
方法和程序
[0295]
frda小鼠模型
[0296]
小鼠育种如下：使用与在外显子4上进行flox的frda条件性等位基因纯合的小鼠(称为frda
l3/l3
)杂交以产生基因型mck-cre::frda
l3/wt
的含有mck-cre转基因的转基因小鼠(jax labs b6.fvb(129s4)-tg(ckmm-cre)5khn/j)产生有条件消融心脏和骨骼肌中frda基因外显子4的小鼠。然后将这些小鼠杂交回到frda l3/l3
系以产生mck-cre::frda
l3/l3
的最终条件基因型(称为mck-cre::fxn ko)。这些小鼠在45天龄时发展为肥厚性心肌病，其与frda中的人心脏非常相似，该小鼠在～65天龄时演变为扩张性心肌病。小鼠在～85天龄时死于心力衰竭。
[0297]
测试物和对照物
[0298]
测试物：tat-fxn融合多肽(seq id no：1，图5)，224个氨基酸的重组融合蛋白，其由细胞渗透肽tat通过二肽(gly-gly)接头融合至完整的人frataxin(hfxn)cdna序列
(fujifilm diosynth batch#nba0838-24)的氨基端组成。这通过fujifilm diosynth在50mm naoac、1％丙二醇(ph 5.0)中以10mg/ml的浓度配制用于皮下施用。将该给药溶液无菌过滤，以1.8ml等分储存在-80℃并用于本研究中的所有给药。fujifilm diosynth确定该制剂在室温下稳定至少7天。然而，在本研究中使用的条件下(即无菌过滤并储存在
–
80℃)，稳定性并未确定。
[0299]
对照物：媒介物，由50mm naoac、1％丙二醇组成，ph 5.0，无菌过滤，并在-80℃下以1.8ml等分储存直至使用。
[0300]
实验方案
[0301]
mck-cre fxn ko小鼠在15
±
1天龄时进入试验。8只雄性和8只雌性经由皮下途径用10mg/kg的tat-fxn融合多肽(seq id no：1)处理3次/周。8只雄性和7只雌性经由皮下途径使用媒介物处理3次/周。受试者在给药前称重并根据体重(1μl/g)调整测试物或媒介物的剂量体积。根据批准的动物方案，对受试者给药长达170天；然而，存活超过170天的小鼠继续接受处理直到它们死亡或在200天后从研究中移除。
[0302]
每天检查小鼠的临床症状，包括死亡。对发现死亡的动物和存活至处理结束的动物进行尸检，收获组织并储存以供进一步分析。
[0303]
使用student's t检验或通过kaplan-meier生存曲线与对数秩分析来分析数据。
[0304]
结果
[0305]
用tat-fxn融合多肽处理的mck-cre fxn ko小鼠的寿命显著长于用媒介物处理的小鼠(图1，表1和2)。在研究期结束时(小鼠龄170天)，15只用媒介物处理的小鼠中没有一只存活，而用tat-fxn融合多肽处理的16只小鼠中有8只存活。在存活超过170天寿命的用tat-fxn融合多肽处理的小鼠组中，3只雄性和5只雌性表明存活没有显著的性别差异。通过对数秩分析(严格)，与用媒介物处理相比用tat-fxn融合多肽处理显著增加了mck-cre fxn ko小鼠的寿命(p＝0.001)。用tat-fxn融合多肽处理的小鼠的中位存活为166天，而媒介物处理的小鼠为98天。媒介物处理的小鼠的平均存活为107.5天：33％的媒介物处理的小鼠存活超过107.5天的平均龄，而用tat-fxn融合多肽处理的小鼠中有87.5％存活超过此时间。
[0306]
记录并绘制研究期间雄性和雌性动物的体重均增加(图2a和2b)。将用tat-fxn融合多肽处理的雄性体重与用媒介物处理的雄性体重进行比较(图2a)，并以相同方式分析雌性(图2b)。结果展示在用tat-fxn融合多肽处理的组和用媒介物处理的组之间，在任一性别中随着时间的体重增加没有显著差异。
[0307]
该研究结果展示tat-fxn融合多肽可以改善frda的mck-cre fxn ko小鼠模型的存活。这一发现证实并扩展了已发表的报告，即使用转录反式激活因子(tat)蛋白转导结构域将人fxn蛋白递送至线粒体改善小鼠frda模型的存活(vyas等人，同上)。在先前的研究中，nse-cre转基因用于驱动脑和神经组织以及心脏中frda基因的组织特异性消融(参见puccio et al.,nat genet.2001；27(2):181-186)，相对于当前mck-cre fxn ko小鼠模型中心脏和骨骼肌中frda基因的消融。这两种模型的不同之处在于，在nse-cre fxn ko模型中，媒介物处理的小鼠的存活较短(nse-cre fxn ko模型中的平均寿命为27.5 2.3天，而mck-cre fxn ko模型中的中位存活为98天)，并且体重增加的减少在nse-cre fxn ko模型中很显著，但在mck-cre fxn ko模型中不然。尽管用于fxn替代的剂量水平相同，但研究在施用途径上也不同。在第一项研究中使用腹膜内途径，而在当前研究中施用途径是皮下。在
这些研究中，vyas等人的多肽及其公开的tat-fxn融合多肽分别将中位存活提高了大约49％和70％。因此，本文称为tat-fxn融合多肽的细胞渗透肽能够在体内将替代蛋白fxn递送至线粒体，其量足以挽救受试者ko小鼠模型中非常严重(致命)的疾病表型。
[0308]
与用媒介物处理的小鼠相比，每周三次用10mg/kg sc的tat-fxn融合多肽(seq id no:1)处理mck-cre fxn ko小鼠耐受良好并延长了寿命。pvalb-cre fxn ko
[0309]
进行了在frda的神经学模型中检查tat-fxn融合多肽的研究。这些实验允许在没有心脏或肌肉功能障碍覆盖的情况下研究小鼠中frda的神经组分。frda基因的条件性丢失是由parvalbumin-cre(pvalb-cre)转基因(jax labs b6；129p2-pvalb tm1(cre)arbr
/j)驱动的，其遵循的育种策略与mck-cre fxn-ko(上图)相同，其仅导致脑、脊髓和背根神经节中的frda基因消融。简而言之，pvalb-cre

小鼠与frda l3/l3
系杂交以产生基因型pvalb-cre

::frda l3/wt
。然后这些小鼠杂交回到frda l3/l3
系以产生pvalb-cre

::frda l3/l3
的最终基因型，也称为pvko。这些小鼠在～90天龄时发生显著的神经表型，该表型由以下组成：共济失调步态、运动技能受损、本体感觉丧失和最终由于在～130至140天龄时无法进食或饮水而死亡。
[0310]
对三组小鼠进行了120天的研究。野生型小鼠(wt,n＝14)和一组未处理的ko小鼠(n＝13)与一组处理过的ko小鼠(n＝10)进行比较。处理组从7日龄开始每周三次接受10mg kg-1
腹膜内(ip)的tat-fxn融合多肽(seq id no:1)，而wt和未处理的ko小鼠未接受tat-fxn融合多肽。使用digigait(mouse specifics,inc,framingham,ma)评估动物的行走能力，该设备含有透明的跑步机带，其可在小鼠以20cm/sec行走时以数字方式捕获步态数据。小鼠在生命第30、45、60、75、90和120天行走。然后使用专有软件分析数据并报告41种结果测量。由于digigait设备故障，动物在90天和120天时间点丢失，因此，后期时间点的群体较小。研究期间没有动物死亡。此外，从第30天到第120天对所有动物进行了纵向跟踪。初步结果显示，在41个分析变量中的大约14个，wt动物与未处理的ko小鼠随时间不同。wt和未处理的ko之间的二十七个变量没有差异，并且因为没有提供信息而被丢弃。当将处理动物与未处理动物的这14个参数进行比较时，处理动物在多个变量方面的表现优于未处理动物，但在站姿宽度、共济失调系数和中线距离方面非常显著(参见图3)。在这3个行为生物标志物中，站姿宽度和共济失调系数可直接转化为人类步态，而中线距离与啮齿动物相关。处理过的pvko小鼠的寿命显著长于未处理的小鼠(图4)，并且根据批准的动物方案，试验在180天时终止。这些数据显示，当pvko小鼠用tat-fxn融合多肽处理时，步态的行为生物标志物和寿命都显示统计学显著改善。
[0311]
实施例2
[0312]
本研究的主要目的是展示tat-fxn融合多肽(seq id no:1)可以在单步过程中纯化。
[0313]
如上所述，vyas等人的多肽的纯化依赖于其氨基端的6x his标签(seq id no：11)。由于额外蛋白质将与vyas等人的多肽一起被拉下，这显著使纯化复杂化。这需要多个额外的纯化步骤和/或层析法以从这些其他肽中分离vyas等人的多肽。
[0314]
tat-fxn融合多肽不含his标签，因此不依赖它进行纯化(参见图5)。因此，公开的tat-fxn融合多肽的纯化将比vyas等人的多肽的纯化更快、更容易且更便宜。
[0315]
图6a描述了使用还原的、在标准条件下运行的4-12％bis-tris凝胶进行的纯化优
化研究。本研究旨在确定tat-fxn融合多肽的最佳单步层析基质和条件。使用四种不同的层析纯化技术产生了十四种tat-fxn融合多肽制剂。方框显示从以下分离的tat-fxn融合多肽：离子交换层析树脂(iex，1个样品)、快速流动树脂(spff，4个样品)、capto-mmc层析介质(mmc，4个样品)和sepharose高性能树脂(sphp，5个样品)。
[0316]
基于这些数据，明显的是，使用capto-mmc层析介质的单步纯化对于tat-fxn融合多肽的初始单步纯化来说完全足够。然后，接着使用商业stic柱去除内毒素，这更进一步纯化tat-fxn融合多肽。
[0317]
图6b描述了tat-fxn融合多肽的进一步分析，其使用如图6a所示的capto-mmc介质纯化。这些条件显示仅使用单步分离，然后去除内毒素，tat-fxn融合多肽的纯度极好，约为90％。
[0318]
实施例3
[0319]
本研究的目的是确定tat-fxn融合多肽是否以及在多大程度上会靶向小鼠脑、脊髓和心脏。
[0320]
图7a显示了tat-fxn融合多肽组织渗透到小鼠心脏中。心脏是frda中处理的靶组织。在这里，三只50日龄的mck-cre fxn ko小鼠连续3天以20mg/kg的剂量腹膜内(ip)注射tat-fxn融合多肽或等体积的媒介物(载液)。为了比较，野生型(wt)小鼠也注射媒介物3天，第二只wt小鼠以20mg/kg ip注射tat-fxn融合多肽3天。在这段时间结束时，取出心脏，均质化，并通过elisa(abcam,cambridge,ma)检测fxn的存在。正如预期的那样，mck-cre fxn ko无剂量小鼠的心脏没有fxn信号。这证实了ko小鼠心脏中的fxn表达确实被敲除。ko 1和ko 2给药的动物心脏中具有约15
–
20ng/mg的fxn总蛋白。未给药的wt小鼠(wt无剂量)具有相当于约25ng/mg的天然fxn总蛋白的fxn信号。对于用tat-fxn给药的wt小鼠，信号是相加的(天然fxn tat-fxn)以产生约90ng/mg总心脏蛋白的总fxn质量。这些数据展示，tat-fxn肽序列很好地渗透到敲除心脏中，其水平在为天然fxn表达的约50-75％。
[0321]
从这些数据中得出的结论是，与野生型小鼠相比，经由腹膜内途径每日单次给药可实现接近正常水平的fxn。对野生型小鼠的注射在心脏中产生非常高水平的fxn。
[0322]
图7b显示tat-fxn融合多肽(seq id no：1)组织渗透到小鼠脑、脊髓和背根神经节(drg)中。这些是frda中处理的靶组织。在这里，从1周龄开始，每周3次向多只pvko小鼠皮下注射10mg/kg的tat-fxn融合多肽。在120天龄时处死小鼠，收获脑(蓝色)脊髓(绿色、橙色和黄色)和背根神经节(drg)(灰色、粉红色和紫色)。将组织均质化，然后通过elisa(abcam ab176112，abcam，cambridge ma)测定来自每只动物的5mcg组织中人fxn的存在。这种特殊的elisa试剂盒对人fxn具有特异性。对于对照，还测定了给药等体积媒介物(无tat-fxn)的多只pvko小鼠的人fxn的存在(图7c的数据)。正如预期的，仅接受媒介物的pvko小鼠的脑、脊髓或drg中没有人fxn的信号。相比之下，所有pvko小鼠的脑、脊髓和drg中都具有显著的人fxn蛋白质量(pg/5mcg总蛋白)。水平变化取决于最后一次给药和处死之间的间隔。脊髓显然具有最大量的tat-fxn融合多肽，脑的略少。drg具有最少的tat-fxn融合多肽，与其小尺寸和最少的线粒体一致。这些数据展示tat-fxn融合多肽穿过血脑屏障以足以改善神经功能的量渗透并积聚在脑、脊髓和drg中。这些数据还展示，tat-fxn融合多肽根据细胞内线粒体的数量在组织中积累。tat-fxn融合多肽的靶向机制被工程化为通过线粒体基质加工肽酶(线粒体特异性)进行蛋白水解加工，从而将fxn捕获在线粒体基质中并从线粒体释放
tat细胞渗透肽。因此，线粒体数量显著多于drg的脑和脊髓将比drg积累更多的tat-fxn融合多肽。以类似的方式，每个心肌细胞具有非常多的线粒体的心脏比脑和脊髓(图7b)积累了显著更多量的tat-fxn融合多肽(图7a)。
[0323]
实施例4
[0324]
本研究的目的是确定tat-fxn融合多肽(seq id no:1)是否以及在何种程度上会在体内靶向大鼠脑和心脏。
[0325]
图8a显示皮下注射或静脉内注射后tat-fxn融合多肽的心脏水平。五组，每组三只大鼠，每天注射一次，注射3天。在最后一次注射后4小时收获组织并快速冷冻以供以后通过elisa(abcam ab176112,abcam,cambridge ma)分析人fxn。第一实验组大鼠注射20mg/kg的仅媒介物(无tat-fxn)、20mg/kg的tat-fxn融合多肽皮下(sq)或20mg/kg的tat-fxn融合多肽静脉内(iv)。第二实验组大鼠皮下(sq)注射仅媒介物(无tat-fxn)(体积相当于施用于测试组的tat-fxn的量)或注射80mg/kg的tat-fxn融合多肽。正如预期，注射仅媒介物，无tat-fxn的大鼠在注射后未显示tat-fxn融合多肽的组织水平。相比之下，用tat-fxn融合多肽皮下或静脉内注射的大鼠展示出显著的人fxn组织水平。这些数据显示，在大鼠中每天单次皮下或静脉内给药tat-fxn融合多肽产生药物的显著组织水平。
[0326]
图8b显示皮下注射或静脉内注射后tat-fxn融合多肽的脑水平。四组，每组三只，每天注射一次，注射3天；20mg/kg sq注射组仅含有2只大鼠。在最后注射后4小时收获组织并速冻。第一实验组大鼠注射20mg/kg的仅媒介物(无tat-fxn)、20mg/kg的tat-fxn融合多肽皮下(sq)或20mg/kg公开的tat-fxn融合多肽静脉内(iv)。第二实验组大鼠皮下(sq)注射80mg/kg仅媒介物(无tat-fxn)或注射80mg/kgtat-fxn的融合多肽。正如预期，注射仅媒介物，没有tat-fxn的大鼠在注射后显示很少至没有组织水平的tat-fxn融合多肽。相比之下，那些用tat-fxn融合多肽皮下或静脉内注射的大鼠展示出显著的组织水平。这些数据还显示，在大鼠中每天单次皮下或静脉内给药tat-fxn融合多肽产生药物的显著组织水平。
[0327]
另外，tat-fxn融合多肽的静脉内注射耐受良好，对大鼠血液化学(图9a)或血液学(图9b)几乎没有影响。大鼠静脉内注射仅媒介物(无tat-fxn)或20mg/kg的tat-fxn融合多肽(seq id no：1)。每组大鼠(n＝3/组)每天注射一次，注射3天。最后一次注射后4小时采集血液。
[0328]
数据显示胆固醇水平存在显著但小的差异(图9a)和红细胞水平存在显著但小的差异(图9b)。所有其他值均不显著。这些数据清楚地显示tat-fxn融合多肽在大鼠中耐受良好。
[0329]
实施例5
[0330]
本实施例提供了将tat-fxn融合多肽长期注射到大鼠后的毒代动力学研究结果。tat-fxn融合多肽皮下注射给4组大鼠(n＝4/组)，每周2次，共28天。然后将每组的动物处死并进行尸检。施用于每组的tat-fxn融合多肽的量，以及每组分析的组织，如表2所示：
[0331]
表2
[0332][0333][0334]
图10显示了tat-fxn融合多肽的组织水平。
[0335]
没有记录器官发现。在较高的药物剂量下在注射部位观察到局部肿胀/刺激，尽管这与高媒介物体积有关，而不是与tat-fxn融合多肽有关。所有动物的体重增加是适当的。
[0336]
图10中展现的数据显示了每周两次注射对心脏和肺组织随时间的剂量反应。在80mg/kg时观察到的组织水平下降反映了药物从注射部位泄漏或药物在注射部位沉淀。
[0337]
这些数据显示，在28天的时间里每周两次施用时tat-fxn融合多肽对大鼠没有毒性。
[0338]
实施例6
[0339]
实施例6中描述的实验的目的是比较tat-fxn融合多肽(seq id no：1)和vyas等人的多肽的活性和溶解度。活性测定涉及通过监测氢醌(hq)的氧化来监测肽的活性氧(ros)的产生。为此，制备了含有5μm fe(iii)硫酸盐、5μm氢醌(hq)作为还原剂和0.25μm 2',7'-二氯荧光素(h2dcf)作为ros检测化合物的测定混合物。将每种测定混合物添加到96孔板上的孔中，并添加ph 8.0的tris-hcl缓冲液以标准化体积。添加各种量的vyas等人的多肽或公开的tat-fxn融合多肽到每个测定混合物中使最终浓度为0-10μm，以启动反应。将96孔板温育1小时。为了确定vyas等人的多肽或公开的tat-fxn融合多肽的活性，使用485/20的激发和528/20的发射测量每种测定混合物的荧光。为了确定每种测定混合物中的肽聚集/沉淀，测量了630nm处的光密度。
[0340]
结果展现在图11中。具体而言，图11a是显示vyas等人的多肽或公开的tat-fxn融合多肽的活性量作为肽浓度函数的图，如通过荧光测量的。图11a中所示的结果表明，公开的tat-fxn融合多肽的活性作为肽浓度的增加的函数而增加。相比之下，vyas等人的多肽在所有测试的肽浓度下均不显示活性。
[0341]
图11b是显示vyas等人的多肽或公开的tat-fxn融合多肽的聚集/沉淀量作为肽浓度的函数的图，如通过od
630
测量的。图11b中显示的结果表明vyas等人的多肽的od 630
随着多肽浓度的增加而增加，这展示了vyas等人的多肽的聚集/沉淀增加。相反，对于公开的tat-fxn融合多肽，没有观察到od
630
作为肽浓度函数的增加，这表明没有聚集/沉淀。
[0342]
图11中显示的结果展示了vyas等人的多肽在测试的测定条件下不溶，并且在测试
的肽浓度下从溶液中聚集/沉淀出来。相反，公开的tat-fxn融合多肽在测试的测定条件下是可溶的和有活性的。
[0343]
实施例7
[0344]
实施例7中描述的实验目的是确定tat-fxn融合多肽(seq id no：1)和vyas等人的多肽在人血浆中的稳定性。为此，重组tat-fxn融合多肽与vyas等人的多肽在1mm异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)存在的情况下在大肠杆菌细胞中表达，以在lac操纵子的控制下诱导重组蛋白表达。然后通过离心收集细菌细胞，并使用适用于每种多肽的方法平行纯化两种多肽以获得高纯度多肽制剂。纯化后，将每种多肽配制在在pbs中稀释的15％人血浆(hp,bioreclamationivt)中。随后，在不存在或存在蛋白酶抑制剂混合物(sigma p/n p8340)的情况下，在37℃下，将500ng的每种多肽在50ml的pbs中的15％hp中温育0.5、1、2和4小时。作为对照，将500ng的每种多肽在50ml的100％pbs中温育。使用对人fxn特异的小鼠单克隆抗体(abcam ab110328)和红外染剂标记的山羊抗小鼠igg(li-cor biotech p/n 925-32210)作为二抗，通过蛋白质印迹法来分析来自每个反应的等分试样。使用odyssey clx红外扫描仪(li-cor biotech)对免疫印迹进行扫描和分析。
[0345]
图12a是tat-fxn融合多肽在15％人血浆中温育不同时间的蛋白质印迹图像。图13a显示了对应于全长tat-fxn融合多肽的条带和随时间积累的较低mw的降解产物。图12b是vyas等人的多肽在15％人血浆中温育不同时间的蛋白质印迹图像。图12b显示了对应于全长vyas等人的多肽的条带和随时间积累的较低mw的降解产物。
[0346]
使用蛋白质印迹的图像分析确定每种多肽的降解百分比，作为时间的函数。具体而言，通过将对应于较低mw降解产物的信号强度除以对应于仅在pbs中温育的全长多肽的较高mw条带的信号强度来计算每种多肽的降解百分比。
[0347]
图12c是条形图，显示了tat-fxn融合多肽和vyas等人的多肽在在pbs中稀释的15％人血浆中温育不同时间后的降解％。图12c中展现的结果表明vyas等人的多肽在所有测试的时间点在人血浆中的降解显著快于tat-fxn融合多肽。因此，tat-fxn融合多肽在人血浆中比vyas等人的多肽显著更稳定。
[0348]
实施例8
[0349]
实施例8中描述的实验目的是比较tat-fxn融合多肽(seq id no：1)和vyas等人的多肽进入细胞的能力。为此，用tat-fxn融合多肽和vyas等人的多肽转导了作为周围神经系统髓鞘细胞的许旺细胞，量化进入细胞的每种多肽的量，并且相互比较了tat-fxn融合多肽和vyas等人的多肽量化的量。
[0350]
许旺细胞以每孔约8000个细胞的接种密度铺板在组织培养96孔板中，并在37℃下温育过夜。第二天，每孔中的细胞用150μl pbs洗涤，并在37℃下与70μl的0μm(对照)或12.5μm的tat-fxn融合多肽或vyas等人的多肽在转导培养基(dmem、1％热灭活的fbs和20mm甘油)一起温育3小时。随后，加入等体积的完全培养基[dmem,10％fbs,1％抗生素：抗真菌剂(gemini bio,400-101)]中，并将细胞在37℃下温育过夜。第二天重复相同的处理，然后用150μl pbs洗涤每孔中的细胞，并在37℃下每孔使用50μltryple express(12604021)进行5分钟胰蛋白酶消化。
[0351]
将细胞重悬在50μl完全培养基中并转移到含有40μl预热的完全培养基的纤连蛋白包被的玻璃底板(4584)上。使细胞在37℃下沉降过夜。次日早上，用pbs清洗
细胞，然后每孔加入50μl新鲜制备的4％多聚甲醛溶液，室温温育细胞10分钟。随后，每孔细胞用150μl pbs洗涤2次，加入50μl封闭缓冲液(0.3％triton-x 100，5％正常山羊血清的pbs溶液)，室温温育细胞1小时。随后，吸出封闭缓冲液，将50μl在封闭缓冲液中稀释的一抗[抗frataxin抗体，ab110328(1:300)]添加到每个孔中，并将细胞在4℃下温育过夜。
[0352]
然后将每个孔中的细胞用120μl pbs洗涤两次，加入50μl在封闭缓冲液中稀释的二抗[抗小鼠igg alexafluor594,ab150116(1:1000)]，并室温温育细胞1小时。然后将每个孔中的细胞用150μl pbs洗涤3次，然后加入50μl的300nm hoechst 33342染剂，并在室温下温育细胞3分钟。随后，每孔中的细胞用pbs洗涤两次，并使用lionheart fx成像仪进行成像。使用从96孔板的5个不同孔以20倍放大倍数成像获得的16个场的平均值来量化每个细胞的frataxin量。数据报告为alexafluor594red信号的总面积(对应于frataxin的总量)与hoechst 33342信号的总面积(对应于核dna的量)的比。每次处理后以20倍放大倍率捕获图像的实例如图13a的a-d小图所示。每次处理后以更高分辨率(60倍油浸)捕获图像的实例如图13a的e-f小图所示。
[0353]
具体而言，图13a的a小图显示了用0μm的tat-fxn融合多肽处理两天并用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色的96孔板的一个孔中的许旺细胞。
[0354]
图13a的b小图显示了用0μm的vyas等人的多肽处理两天并用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色的96孔板的一个孔中的许旺细胞。
[0355]
图13a的c小图显示了用12.5μm的tat-fxn融合多肽处理两天并用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色的96孔板的一个孔中的许旺细胞。
[0356]
图13a的d小图显示了用12.5μm的vyas等人的多肽处理两天并用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色的96孔板的一个孔中的许旺细胞.
[0357]
图13a的e小图显示了用12.5μm的tat-fxn融合多肽处理两天，用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色并使用60x油物镜成像的96孔板的一个孔中的许旺细胞。
[0358]
图13a的f小图显示了用12.5μm的vyas等人的多肽处理两天，用核染剂hoechst 33342和抗frataxin染剂德克萨斯红染色并使用60x油物镜成像的96孔板的一个孔中的许旺细胞。
[0359]
图13b是条形图，其显示了用0μm或12.5μm的tat-fxn融合多肽或vyas等人的多肽处理的许旺细胞中德克萨斯红染剂的量与hoechst 33342核染剂的量的比。
[0360]
图14a和14b中展现的结果表明转导后进入许旺细胞的tat-fxn融合多肽的量显著高于vyas等人的多肽进入细胞的量。基于这些结果，预计tat-fxn融合蛋白在体内将比vyas等人的多肽更有效地进入细胞，因此将提供更好的处理效果。
[0361]
实施例9
[0362]
实施例9中描述的实验的目的是比较tat-fxn融合多肽(seq id no：1)和vyas等人的多肽的溶解度和活性。为了比较tat-fxn融合多肽和vyas等人的多肽的溶解度，od
630
用作多肽聚集/沉淀的测量。为此，tat-fxn融合多肽和vyas等人的多肽如实施例7中所述表达。制备每种多肽在50mm tris-hcl ph 8.0和不同浓度的nacl中的系列稀释，并测量每种稀释的od
630
[0363]
图14a是tat-fxn融合多肽和vyas等人的多肽的聚集/沉淀量的条形图，如在0mm或150mm nacl存在下，在10μm多肽浓度下通过od
630
测量的。图14a中展现的结果表明在0mm nacl和150mm nacl下均观察到vyas等人的多肽大量聚集/沉淀，而tat-fxn多肽未检测到显著量的聚集/沉淀。
[0364]
图14b是显示了tat-fxn融合多肽和vyas等人的多肽的聚集/沉淀量的条形图，如在没有nacl的情况下，在2.5mm、5μm和10μm的多肽浓度下通过od
630
测量的。图14b中展现的结果表明在所研究的所有多肽浓下均没有盐的情况下观察到vyas等人的多肽的显著量的聚集/沉淀。图14b中展现的结果进一步表明对于tat-fxn融合多肽，在2.5μm和5μm的多肽浓度下没有观察到可检测的聚集/沉淀，并且在没有盐的情况下，在10μm的多肽浓度下观察到几乎检测不到的聚集/沉淀量。
[0365]
tat-fxn融合多肽的两个不同批次(批次1和批次2)和vyas等人的多肽的活性通过使用实施例6中描述的活性测定法确定。图14c是显示在0.078μm、0.156μm、0.313μm、0.625μm和1.25μm的多肽浓度下，第1批和第2批的tat-fxn融合多肽和vyas等人的多肽活性百分比的条形图，该活性百分比相对于第2批tat-fxn融合多肽的比活性标准化。图14c中展现的结果表明，对于研究的所有多肽浓度，第1批tat-fxn融合多肽展示出的活性约为第2批tat-fxn融合多肽活性的80％，而vyas等人的多肽展示的活性低于第2批tat-fxn融合多肽的15％。
[0366]
图14a、14b和14c中显示的结果综合起来展示了vyas等人的多肽在测试的测定条件下表现出较差的溶解度和活性。相反，tat-fxn融合多肽在测试的测定条件下是可溶的和有活性的。
[0367]
新技术已在附图和前面的描述中详细阐明和描述，其在特征上应被视为阐明性而非限制性的，应理解，仅显示和描述了组合物、使用方法和制造组合物的方法的实例，并且所有在新技术精神内的变化和修饰都希望得到保护。
[0368]
同样，虽然使用特定实施例、理论论证、说明和插图来阐明新技术，但这些插图和随附的讨论不应理解为对技术的限制。