ofinterest，poi))的降解，而在存在去稳定结构域结合配体的情况下，融合的dd和有效负载可以是稳定化的，并且其稳定性是剂量依赖性的。11.本文提供的是包括至少一个效应器模块的生物回路系统。该效应器模块可以包括：(a)刺激应答元件(stimulusresponseelement,sre)，该刺激应答元件可以全部或部分地包括人碳酸酐酶2，例如但不限于(ca2；seqidno.5810)；以及，(b)至少一个有效负载，所述至少一个有效负载与所述sre附着、附加或关联。该有效负载可以是全部的cd40l或cd40l的部分。12.在一些实施方案中，本公开提供了刺激应答元件(sre)，该刺激应答元件可以全部或部分地包括源自人碳酸酐酶2(ca2；seqidno.5810)的去稳定结构域(dd)。在一个实施方案中，dd可以包括全部的ca2(seqidno.5810)。在另一个实施方案中，dd可以包括ca2的氨基酸2至260，例如但不限于seqidno.5810的氨基酸2至260。13.在一个方面，本公开提供了一种包括效应器模块的多肽，所述效应器模块包括：i)刺激应答元件(sre)，其中，所述sre包括药物应答性结构域(drugresponsivedomain,drd)，所述drd包括人碳酸酐酶2(ca2；seqidno.5810)或其区域，并且还包括相对于seqidno.5810的氨基酸序列的一个或多个突变；以及，ii)至少一个有效负载，所述至少一个有效负载可操作地连接至所述sre，其中：(a)所述有效负载包括cd40l(seqidno.6)或其部分；或者，(b)所述有效负载包括cd40l(seqidno.6)或其部分，所述cd40l或其部分包括相对于seqidno.6的氨基酸序列的一个或多个突变。14.在一个实施方案中，drd包括在seqidno.5810的位置122(h122)处的氨基酸中的h122y突变。在另一个实施方案中，drd还包括：(i)在seqidno.5810的位置27(r27)处的氨基酸中的r27l突变；(ii)在seqidno.5810的位置87(t87)处的氨基酸中的t87i突变；(iii)在seqidno.5810的位置252(n252)处的氨基酸中的n252d突变；或者，(iv)(i)、(ii)和/或(iii)的组合。15.在一个实施方案中，drd包括在seqidno.5810的位置106(e106)处的氨基酸中的e106d突变。在一个实施方案中，drd包括在seqidno.5810的位置208(w208)处的氨基酸中的w208s突变。在一个实施方案中，drd包括e106d突变或w208s突变，并且还包括在seqidno.5810的位置205(c205)处的氨基酸中的c205s突变。16.在一个实施方案中，drd包括在seqidno.5810的位置59(i59)处的氨基酸中的i59n突变。在另一个实施方案中，drd还包括在seqidno.5810的位置102(g102)处的氨基酸中的g102r突变。17.在一个实施方案中，drd包括在seqidno.5810的位置156(l156)处的氨基酸中的l156h突变。在另一个实施方案中，drd还包括：(i)在seqidno.5810的位置4(w4)处的氨基酸中的w4y突变；(ii)在seqidno.5810的位置225(f225)处的氨基酸中的f225l突变；(iii)在seqidno.5810的位置257-260处的氨基酸的缺失；(iv)在seqidno.5810的位置1-5处的氨基酸的缺失；或者，(v)seqidno.5810的氨基酸g234、e235和p236的缺失。在另一个实施方案中，drd包括相对于seqidno.5810的四个突变，所述突变对应于：(i)l156h、s172c、f178y和e186d；或者，(ii)d70n、d74n、d100n和l156h。18.在一个实施方案中，drd包括相对于seqidno.5810的第一突变和第二突变，其中：(i)第一突变是在seqidno.5810的位置73(s73)处的氨基酸中的s73n突变；并且，(ii)第二突变是在seqidno.5810的氨基酸位置89(r89)处的f或y的取代。19.在一个实施方案中，drd包括在seqidno.5810的氨基酸位置56(s56)处的n或f的取代。在一个实施方案中，drd包括相对于seqidno.5810的两个取代，所述两个取代对应于s56f和d71s。20.在一个实施方案中，drd包括在seqidno.5810的位置56(s56)处的氨基酸中的s56n突变。21.在一个实施方案中，drd包括相对于seqidno.5810的一个或多个取代，其中，至少一个取代是在seqidno.5810的氨基酸位置63(g63)处的d或n的取代，并且其中，所述一个或多个取代对应于：g63d；g63d和m240l；g63d、e69v和n231i；或者，t55k、g63n和q248n。22.在一个实施方案中，drd包括相对于seqidno.5810的两个或更多个取代，其中，所述两个或更多个取代中的一个是在seqidno.5810的氨基酸位置71(d71)处的l或k的取代，并且其中，所述两个或更多个取代对应于：d71l和t87n；d71l和l250r；d71l、t87n和l250r；或者d71k和t192f。23.在一个实施方案中，drd包括相对于seqidno.5810的两个或更多个取代，其中，所述两个或更多个取代中的至少一个是：(i)在seqidno.5810的氨基酸位置241(v241)处的f的取代；或者，(ii)在seqidno.5810的氨基酸位置249(p249)处的f或l的取代；并且其中，所述两个或更多个取代对应于：d72f和v241f；d72f和p249l；d72f和p249f；d72f、v241f和p249l；a77i和p249f；或者，v241f和p249l。24.在一个实施方案中，drd包括相对于seqidno.5810的一个或多个取代，所述一个或多个取代选自y51t、l183s、y193i、l197p、以及v134f和l228f的组合。25.在一些实施方案中，drd包括人ca2的区域，所述人ca2的区域对应于seqidno.5810的氨基酸2至260。26.在一些实施方案中，drd包括人ca2的区域，所述人ca2的区域对应于包括seqidno.5810的氨基酸1至260的全长ca2。27.在一些实施方案中，sre对一种或多种刺激有应答。在一些实施方案中，刺激是小分子，其中，所述小分子选自：乙酰唑胺(acetazolamide)、塞来昔布(celecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、醋甲唑胺(methazolamide)、多佐胺(dorzolamide)、布林佐胺(brinzolamide)、双氯非那胺(diclofenamide)、依索唑胺(ethoxzolamide)、唑尼沙胺(zonisamide)、丹酰胺(dansylamide)或者二氯苯磺胺(dichlorphenamide)。在一些实施方案中，所述小分子是乙酰唑胺。28.在一些实施方案中，有效负载是包括至少一个突变的cd40l(seqidno.6)或其部分。29.在一些实施方案中，有效负载是包括至少两个突变的cd40l(seqidno.6)或其部分，其中，所述至少两个突变选自：(i)h224g和g226f；(ii)h224g和g226h；(iii)y172g和g226f；(iv)h125和g227；(v)y120g、h224g和g226w；以及，(vi)s110g、f111g、e112s、m113g、q114g和k115s。30.在一些实施方案中，有效负载是cd40l(seqidno:6)。31.在一些实施方案中，drdn-末端定位至有效负载。32.在一些实施方案中，drd通过接头(linker)与有效负载分隔。33.在一些实施方案中，效应器模块还包括信号肽、靶向和/或穿透肽、接头、蛋白标签和/或蛋白切割位点。34.在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，该组合物包括如本文所述的多肽。35.在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，该组合物包括如本文所述的效应器模块。36.在一些实施方案中，本公开提供了一种多核苷酸，该多核苷酸编码如本文所述的效应器模块，其中，所述多核苷酸是dna分子或rna分子。在一些实施方案中，所述多核苷酸是单顺反子的、双顺反子的或多顺反子的。37.在一个实施方案中，多核苷酸是双顺反子的并且编码第二多肽，其中，所述第二多肽包括免疫治疗剂，所述免疫治疗剂选自：抗体及其片段和变体、t细胞受体(tcellreceptor，tcr)及其变体、嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,car)、嵌合开关受体、共抑制受体或配体的抑制剂、共刺激受体和配体的激动剂、细胞因子、趋化因子、细胞因子受体、趋化因子受体、细胞因子-细胞因子受体融合体、可溶性生长因子、代谢因子、自杀基因或归巢受体。在一个实施方案中，多核苷酸是多顺反子的并且编码至少两种额外的多肽，其中，所述至少两种额外的多肽包括免疫治疗剂，所述免疫治疗剂选自：抗体及其片段和变体、t细胞受体(tcr)及其变体、嵌合抗原受体(car)、嵌合开关受体、共抑制受体或配体的抑制剂、共刺激受体和配体的激动剂、细胞因子、趋化因子、细胞因子受体、趋化因子受体、细胞因子-细胞因子受体融合体、可溶性生长因子、代谢因子、自杀基因或归巢受体。在一些实施方案中，第二多肽、或至少两种额外的多肽可操作地连接至第二sre。在一些实施方案中，第二多肽、或至少两种额外的多肽没有可操作地连接至任何sre。38.在一些实施方案中，本公开提供了一种载体，该载体包括本文所述的任一种多核苷酸。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体，并且所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、γ-逆转录病毒载体、重组aav载体、腺病毒载体或溶瘤病毒载体。39.在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞，该细胞用如本文所述的载体转导或转染。40.在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞，该细胞包括以下至少之一：如本文所述的效应器模块、多核苷酸或载体。41.在一些实施方案中，本公开的细胞是用于过继细胞转移(adoptivecelltransfer,act)的免疫细胞；或者，cd8 t细胞、cd4 t细胞、辅助t细胞、自然杀伤(naturalkiller，nk)细胞、nkt细胞、细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxictlymphocyte，ctl)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte，til)、记忆t细胞、调节性t(regulatoryt,treg)细胞、细胞因子诱导的杀伤(cytokine-inducedkiller，cik)细胞、树突状细胞、淋巴因子激活的杀伤(lymphokineactivatedkiller，lak)细胞、人胚胎干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、或它们的混合物。在一些实施方案中，所述细胞被修饰以表达嵌合抗原受体(car)或抗原特异性t细胞受体(tcr)。在一个实施方案中，所述细胞是t细胞或nk细胞。42.在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞，该细胞表达如本文所述的效应器模块、和/或包括如本文所述的多核苷酸、和/或用如本文所述的载体感染或转染，其中，所述细胞是被修饰以表达抗原特异性t细胞受体(tcr)或抗原特异性嵌合抗原受体(car)的t细胞。43.在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物包括：如本文所述的多肽、多核苷酸、载体或细胞；以及，药学上可接受的赋形剂。44.在一些实施方案中，本公开提供了一种产生经修饰细胞(modifiedcell)的方法，所述方法包括：将含有如本文所述的多核苷酸的核酸分子引入至细胞中。45.在一些实施方案中，本公开提供了一种调整(modulating)如本文所述的细胞中有效负载的表达、功能和/或水平的方法，所述方法包括向细胞施用刺激，其中，sre对所述刺激进行应答，并且其中，应答于所述刺激来调整至少一种有效负载的表达、功能和/或水平。46.在一些实施方案中，本公开提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病和/或诱导免疫应答的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物、多肽、多核苷酸、载体或细胞中的任一种，并且向受试者施用治疗有效量的刺激，其中，sre对所述刺激进行应答，并且其中，应答于刺激来调整至少一种有效负载的表达，从而治疗疾病和/或诱导免疫应答。在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，刺激选自：乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺或二氯苯磺胺。47.在本公开的另一方面，提供了一种工程化细胞(engineeredcell)，所述工程化细胞包括：(i)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码第一多肽，所述第一多肽包括：(a)第一刺激应答元件(sre)，其中，所述第一sre包括药物应答性结构域(drd)，所述drd包括人碳酸酐酶2(ca2；seqidno.5810)或其区域，并且还包括相对于seqidno.5810的氨基酸序列的一个或多个突变；和，(b)第一有效负载，所述第一有效负载可操作地连接至所述第一sre，其中：(i)所述第一有效负载包括cd40l(seqidno.6)或其部分；或者，(ii)所述第一有效负载包括cd40l(seqidno.6)或其部分，所述cd40l(seqidno.6)或其部分包括相对于seqidno.6的氨基酸序列的一个或多个突变；以及，(ii)第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码一种或多种额外的多肽，所述一种或多种额外的多肽包括免疫治疗剂，所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：t细胞受体(tcr)及其变体，或嵌合抗原受体(car)；其中，在不存在第一刺激的情况下，所述drd和所述第一有效负载是去稳定的，并且其中，在存在所述第一刺激的情况下，所述drd和所述第一有效负载是稳定化的，并且所述一种或多种额外的多肽独立于所述第一有效负载而被表达。48.在一些实施方案中，所述第一有效负载是：(a)包括至少一个突变的cd40l(seqidno.6)或其部分；(b)包括至少两个突变的cd40l(seqidno.6)或其部分，任选地，其中所述至少两个突变选自：(i)h224g和g226f；(ii)h224g和g226h；(iii)y172g和g226f；(iv)h125和g227；(v)y120g、h224g和g226w；以及，(vi)s110g、f111g、e112s、m113g、q114g和k115s。49.在一些实施方案中，一个或多个额外的多肽连接至含有第二drd的第二sre，其中，第二drd与第一sre中的drd相同或不同，在不存在第一刺激或第二刺激的情况下，第二drd和一个或多个额外的多肽是去稳定的，并且其中，在存在第一刺激或第二刺激的情况下，第二drd和一种或多种额外的多肽是稳定化的。50.在一些实施方案中，本公开提供了一种dd，所述dd包括人碳酸酐酶2(ca2；seqidno.5810)的区域或全部人碳酸酐酶2，并且还包括相对于seqidno.5810的突变，所述突变选自：a115l、a116q、a116v、a133l、a133t、a141p、a152d、a152l、a152r、a173c、a173g、a173l、a173t、a23p、a247l、a247s、a257l、a257s、a38p、a38v、a54q、a54v、a54x、a65l、a65n、a65v、a77i、a77p、a77q、c205m、c205r、c205v、c205w、c205y、d101g、d101m、d110i、d129i、d138g、d138m、d138n、d161*、d161m、d161v、d164g、d164i、d174*、d174t、d179e、d179i、d179r、d189g、d189i、d19t、d19v、d242g、d242t、d32t、d34t、d41t、d52i、d52l、d71f、d71g、d71k、d71m、d71s、d71y、d72i、d72s、d72t、d72x、d75t、d75v、d85m、e106d、e106g、e106s、e117*、e117n、e14n、e186*、e186n、e204a、e204d、e204g、e204n、e213*、e213g、e213n、e220k、e220r、e220s、e233d、e233g、e233r、e235*、e235g、e235n、e237k、e237r、e238*、e238n、e238r、e26s、e69d、e69k、e69s、f130l、f146v、f175i、f175l、f175s、f178l、f178s、f20l、f20s、f225i、f225l、f225s、f225y、f230i、f230l、f230s、f259l、f259s、f66s、f70i、f70l、f95y、g102d、g104r、g104v、g128r、g12d、g12e、g131e、g131r、g131w、g139d、g144d、g144v、g150a、g150s、g150w、g155a、g155c、g155d、g155s、g170a、g170d、g182a、g182w、g195a、g195r、g232r、g232w、g234l、g234v、g25e、g63d、g63v、g81e、g81v、g82d、g86a、g86d、g98v、h107i、h107q、h119t、h119y、h122t、h122y、h15l、h15t、h15y、h17d、h17i、h36i、h36q、h64m、h94t、h96t、i145f、i145m、i166h、i166l、i209d、i209l、i215h、i215s、i22l、i255n、i255s、i33s、i59f、i59n、i59s、i91f、k111e、k111n、k112r、k113i、k113n、k126n、k132e、k132r、k148e、k148r、k153*、k153n、k158e、k158n、k167*、k169n、k169r、k171q、k171r、k18r、k212n、k212q、k212r、k212w、k224e、k224n、k227*、k227n、k24r、k251e、k251r、k256q、k260f、k260l、k260q、k39s、k45n、k45s、k80m、k80r、l118f、l120w、l140v、l140w、l143*、l147*、l147f、l156f、l156h、l156p、l156q、l163a、l163w、l183p、l183s、l184f、l184p、l188p、l188w、l197*、l197m、l197p、l197r、l197t、l202f、l202h、l202i、l202p、l202r、l202s、l203p、l203s、l203w、l211*、l211a、l211s、l223*、l223i、l223v、l228f、l228h、l228t、l239*、l239f、l239t、l250*、l250p、l250t、l44*、l44m、l47c、l47v、l57*、l57x、l60s、l79f、l79s、l84w、l90*、l90v、m240d、m240l、m240r、m240w、n11d、n11k、n124t、n177*、n177t、n229*、n229t、n231d、n231f、n231k、n231l、n231m、n231q、n231t、n243q、n243t、n252e、n252t、n61r、n61t、n61y、n62k、n62m、n67d、n67t、p137l、p13a、p13h、p13l、p13s、p154l、p154r、p154t、p180l、p180s、p185l、p185s、p185v、p194q、p200a、p200l、p200s、p200t、p201a、p201l、p201r、p201s、p214t、p236l、p236t、p246l、p246q、p249a、p249f、p249h、p249i、p249x、p30l、p30s、p42l、p83a、q103k、q135s、q136n、q157r、q157s、q221a、q221r、q248f、q248l、q248s、q254a、q254k、q28s、q53h、q53k、q53n、q74r、q92h、q92s、r181h、r181s、r181v、r226h、r226p、r226v、r245a、r253g、r253q、r27a、r58g、r89d、r89f、r89i、r89x、r89y、s105l、s105q、s151a、s151i、s151q、s165f、s165p、s172e、s172v、s187i、s187p、s196h、s196l、s216a、s216q、s218a、s218q、s219a、s219q、s258f、s258p、s29c、s29p、s43p、s43t、s48l、s50p、s56f、s56n、s56p、s56x、s73l、s73n、s73x、s99h、t108l、t125i、t125p、t168k、t168n、t168q、t176h、t176l、t192d、t192f、t192i、t192n、t192p、t192x、t198d、t198i、t198p、t199a、t199h、t199p、t207d、t207i、t207p、t207s、t35i、t35l、t37q、t55l、t87l、v109m、v109w、v121f、v134c、v134f、v142f、v149g、v149l、v159l、v159s、v160c、v160l、v162a、v162c、v206*、v206c、v206m、v210c、v217l、v217r、v217s、v222a、v222c、v222g、v241g、v241w、v241x、v31l、v49f、v68l、v68w、v78c、w123g、w123r、w16g、w191*、w191g、w191l、w208g、w208l、w208s、w244*、w244g、w244l、w97c、w97g、y114h、y114m、y127m、y190*、y190l、y190t、y193c、y193f、y193i、y193l、260，t199n、l202p、l228f)、ca2(wt的氨基酸2-260，k9n、h122y、t168k)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53h、l90v、q92h、g131e)、ca2(wt的氨基酸2-260，l44m、l47v、n62k、e69d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d75v、k169n、f259l)、ca2(wt的氨基酸2-260，t207s、v222a、n231d)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59f、v206m、g232r)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13a、a133t)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n、r89i)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65n、g86d、g131r、g155d、k158n、v162a、g170d、p236l)、ca2(wt的氨基酸2-260，g12r、h15y、d19v)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65v、f95y、e106g、h107q、i145m、f175i)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d、e69v、n231i)、ca2(wt的氨基酸2-260，s29a、c205s)、和/或ca2(wt的氨基酸2-260，s29c、c205s)。如本文所使用的，“x”表示任何氨基酸。53.在一些实施方案中，dd可以包括ca2(wt的氨基酸2-260，r27l、h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i、h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y、n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l、l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k、g63n、q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、a257del、s258del、f259del、k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、s2del、h3del、h4del、w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y、l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、g234del、e235del、p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n、d74n、d100n、l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n、g102r)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d、e69v、n231i)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l、t87i、h122y、n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、v241f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l、t87n、l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、s172c、f178y、e186d)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77i、p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，e106d、c205s)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s、w208s)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n、r89y)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k、t192f)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n、r89f)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d、m240l)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f、l228f)、和/或ca2(wt的氨基酸2-260，s56f、d71s)。54.本文所述的生物回路系统可以对一种或多种刺激进行应答。这种刺激可以是小分子，例如但不限于：乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺和二氯苯磺胺。在一个实施方案中，小分子可以是乙酰唑胺。在一个实施方案中，刺激可以是塞来昔布。55.在一些实施方案中，有效负载可以是全部的cd40l或cd40l的部分。在一个实施方案中，有效负载可以是全部的cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，有效负载可以是包括以下的cd40l的部分：(i)scd40l(wt的113-261)(seqidno.5800)；(ii)cd40l(wt的氨基酸14-261)(seqidno.5802)；或者，(iii)cd40l(wt的氨基酸14-261，(s110-g116)del)(seqidno.5804)。56.在一些实施方案中，有效负载可以是与以下相比具有一个或多个突变的cd40l：(i)scd40l(wt的113-261)(seqidno.5800)；(ii)cd40l(wt的氨基酸14-261)(seqidno.5802)；或者，(iii)cd40l(wt的氨基酸14-261，(s110-g116)del)(seqidno.5804)。57.在一些实施方案中，有效负载可以是与野生型cd40l(以seqidno.6提供的氨基酸序列)相比具有一个或多个突变的cd40l。在一些方面，cd40l包括至少一个突变，例如但不限于s110g、f111g、e112s、m113g、q114g、k115s、y120g、h125g、y172g、h224g、g226f、g226h、g226w和g227f。cd40l有效负载可以包括两个突变，并且该突变可以是但不限于h224g和g226f、h224g和g226h、y172g和g226f、或者h125和g227。cd40l有效负载可以包括三个突变，并且该突变可以是但不限于y120g、h224g和g226w。cd40l有效负载可以包括四个突变。cd40l有效负载可以包括五个突变。cd40l有效负载可以包括六个突变，并且该突变可以是但不限于s110g、f111g、e112s、m113g、q114g和k115s。58.本文还提供了编码本文所述的sre、生物回路系统、多肽、和/或组合物的多核苷酸，以及包括该多核苷酸的载体和包括该多核苷酸的细胞。本公开还描述了药物组合物，该药物组合物包括：ca2生物回路系统的组分、和/或本文所述的组合物、以及药学上可接受的赋形剂。59.本公开提供了合适的实施例和实施方案，这些实施例和实施方案描述了使用各种组合物、生物回路系统及其组分来治疗有需要的人的疾病。例如，一种用于在有需要的受试者中治疗疾病和/或诱导免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：(a)向受试者施用治疗有效量的组合物(包括：效应器模块，其中效应器模块包括：i)刺激应答元件(sre)，其中sre包括药物应答性结构域(drd)，所述drd包括人碳酸酐酶2(ca2；seqidno.5810)或其区域，并且还包括相对于seqidno.5810的氨基酸序列的一个或多个突变；以及，ii)至少一种有效负载，所述至少一种有效负载可操作地连接至sre，其中(a)所述有效负载包括cd40l(seqidno.6)或其部分；或者，(b)所述有效负载cd40l(seqidno.6)或其部分，所述cd40l(seqidno.6)或其部分包含相对于seqidno.6的氨基酸序列的一个或多个突变、或者编码组合物组分的多核苷酸、或者包括编码组合物组分的此类多核苷酸的载体、或者能够合成本文所述的组合物组分的包括此类载体的细胞；以及，(b)向受试者施用治疗有效量的刺激，例如乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹酰胺或二氯苯磺胺，其中sre对所述刺激进行应答，并且其中，应答于所述刺激来调整所述至少一种有效负载的表达，从而治疗疾病和/或诱导免疫应答。60.可以使用本文的生物回路系统和工程化细胞治疗和/或预防的示例性疾病可以包括：免疫性疾病、自体免疫性疾病、感染性疾病和过度增殖性疾病(例如，癌症)。具体实施方式61.本公开的一个或多个实施方案的细节在以下所附描述中阐述。尽管与本文中描述的材料和方法相似或等效的任何材料和方法都可以用于实践或测试本公开，但现在将描述优选的材料和方法。本公开的其他特征、目的和优点将从描述中变得显而易见。在说明书中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式也包括复数形式。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在发生冲突的情况下，以本说明书为准。62.i.组合物63.生物回路或生物回路系统64.根据本公开，提供了生物回路系统，该生物回路系统在其核心处包括至少一个效应器模块。该效应器模块独立地具有关联的、或与其集成的一个或多个刺激应答元件(sre)。一般而言，刺激应答元件(sre)可以可操作地连接至有效负载以形成效应器模块，该有效负载可以是任何目的蛋白(poi)(例如，免疫治疗剂)。当被特定刺激(例如，小分子)激活时，sre可以产生信号或结果，以通过使稳定信号或去稳定信号持续或任何其他类型的调控来向上或向下调控连接的有效负载的转录和/或蛋白水平。在共同拥有的2016年4月11日提交的美国临时专利申请第62/320,864号、2017年3月3日提交的美国临时专利申请第62/466,596号和国际公开wo2017/180587中教导了对生物回路系统的非常详细的描述(这些文件中的每一个的内容通过引用整体并入本文)。根据本公开，提供了调节用于免疫疗法的任何试剂的表达水平和活性的生物回路系统、效应器模块、sre和组分。65.如本文所使用的，“生物回路”或“生物回路系统”被定义为在包含刺激和对刺激进行应答的至少一个效应器模块的生物系统内或在该生物系统中有用的回路，其中对刺激的应答产生生物系统内、生物系统之间、作为生物系统的指标或生物系统上的至少一种信号或结果。生物系统通常被理解为任何细胞、组织、器官、器官系统或生物体，无论是动物、植物、真菌、细菌还是病毒。还应理解的是，生物回路可以是人工回路，该人工回路采用本公开教导的刺激或效应器模块、并在非细胞环境(例如，具有诊断、报告系统、装置、测定或试剂盒)中影响信号或结果。人工回路可以与一个或多个电子、磁性或放射性组分或部件相关联。66.效应器模块67.本公开的生物回路包括至少一个效应器模块。如本文所使用的，“效应器模块”是单组分或多组分构建体或复合物，其至少包括：(a)一种或多种刺激应答元件(sre)；和(b)一种或多种有效负载(例如，目的蛋白(poi))。68.效应器模块可被设计成包括一种或多种有效负载、一种或多种sre、一种或多种切割位点、一种或多种信号序列、以及一种或多种额外特征(包括存在或不存在一种或多种接头)。本公开的代表性效应器模块实施方案在国际公开第wo2017/180587号(其内容通过引用整体并入本文)的图2-6中示出。利用此类效应器分子的生物回路和组分在国际公开第wo2017/180587号(其内容通过引用整体并入本文)的图7-12中给出。69.如国际公开第wo2017/180587号的图2所示的，示出了包括一种有效负载(即，一种免疫治疗剂)的代表性效应器模块实施方案。效应器模块的每个组分可以位于或定位在没有(a至f)或具有(g至z和aa至dd)切割位点的各种排列中。可选的接头可以插入在效应器模块的每个组分之间。70.国际公开第wo2017/180587号的图3至图6示出了包括两个有效负载(即，两种免疫治疗剂)的代表性效应器模块实施方案。在一些方面，在相同sre(例如，相同dd)的调控下，在效应器模块中可以包括多于两种的免疫治疗剂(有效负载)。两种或更多种试剂可以彼此直接连接或分离。sre可以定位在构建体的n-末端处、或构建体的c-末端处或在内部位置中。71.调节性t细胞、髓源性抑制细胞(myeloidderivedsuppressorcell，mdsc)和肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)内广泛的基质网络的组合可以通过阻止t细胞浸润和/或由当前免疫疗法的激活来减弱(dampen)抗肿瘤免疫应答(参见maetal.acd40agonistandpd-1antagonistantibodyreprogramthemicroenvironmentofnon-immunogenictumorstoallowtcell-mediatedanticanceractivity.cancerimmunolresjan.14,2019；doi:10.1158/2326-606.cir-18-0061；其内容通过引用整体并入本文)。目前的cart疗法不是有效的，因为这些疗法具有免疫抑制、肿瘤抗原逃逸、cart40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。77.包括其sre和有效负载的效应器模块可以单独地、共同地或独立地包括肽、多肽或蛋白质。在蛋白质水平下，这种有效负载可以是任何天然的或人工的肽、或多肽、或其片段。有效负载的天然的肽、或多肽组分可以源自任何物种的任何已知蛋白质。78.效应器模块可以被设计成以在一个、两个、三个、四个或更多个模块的组中进行操作。当在生物回路中利用多于一个的效应器模块时，该多于一个的效应器模块被称为该生物回路的效应器模块系统。79.去稳定结构域80.去稳定结构域(dd)是可以附加至靶向目的蛋白的小蛋白结构域。术语去稳定域(dd)可以与术语药物应答性结构域(drd)互换。在不存在dd结合配体的情况下，dd使附着的目的蛋白变得不稳定，使得该蛋白质由细胞的泛素-蛋白酶体系统迅速降解(stankunas,k.等人,mol.cell,2003,12:1615-1624；banaszynski等人,cell；2006,126(5):995-1004；在banaszynski,l.a.和wandless,t.j.chem.biol.:2006,13:11-21和rakhitr等人,chembiol.2014；21(9):1238-1252中综述的)。然而，当特定的小分子配体结合其预期的dd作为配体结合配偶体(ligandbindingpartner)时，不稳定性被逆转，并且蛋白功能被恢复。dd稳定性的条件性质允许从稳定的蛋白质快速且无干扰地切换为用于降解的不稳定底物。此外，dd对其配体浓度的依赖性还提供了对降解速率的调节性控制。81.在一个实施方案中，sre是去稳定结构域(dd)。结合至dd或与dd相互作用的小分子配体的存在、不存在或数量可以根据这种结合或相互作用来调整有效负载的稳定性，并因此调整有效负载的功能。根据结合和/或相互作用的程度，有效负载的更改功能可能会改变，因此提供了有效负载功能的“调节”。82.在一些实施方案中，dd的所需特征可以包括但不限于：在不存在dd配体的情况下的低蛋白水平(例如，低基础稳定性)；大动态范围；稳健且可预测的剂量-应答行为；以及，快速降解动力学。结合至所需配体但没有结合至内源分子的dd可以是优选的。83.在一些实施方案中，本公开的dd可以从本文中被称为亲本蛋白的已知蛋白质开发。在一些实施方案中，本文所描述的或本领域已知的ca2去稳定结构域可以用作与本文教导的有效负载(例如，目的蛋白或免疫治疗剂)中的任一种相关联的、本公开的生物回路系统中的sre。84.可以全部或部分地采用野生型蛋白(例如，ca2)的区域、或部分、或结构域作为sre/dd。它们可以组合或重新排列以创建新的肽、蛋白质、区域或结构域，其中任何一个都可以作为sre/dd使用或用于进一步sre和/或dd的设计的出发点。85.在一个实施方案中，sre源自亲本蛋白(例如，ca2)的区域或源自突变蛋白。亲本蛋白的区域的长度可以是5-50、25-75、50-100、75-125、100-150、125-175、150-200、175-225、200-250、225-275、250-300、275-325、300-350、325-375、350-400、375-425或400-450个氨基酸。作为非限制性实施例，亲本蛋白的区域的长度可以是250-270个氨基酸。作为非限制性实施例，亲本蛋白的区域的长度可以是225-250个氨基酸。作为非限制性实施例，亲本蛋白的区域的长度可以是225-260个氨基酸。86.在一个实施方案中，sre源自亲本蛋白(例如，ca2)或源自突变蛋白，并且包括亲本蛋白的区域。sre可以包括亲本蛋白的区域，该区域是亲本蛋白或突变蛋白的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、10-40％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％、60-90％、70-100％、10-50％、20-60％、30-70％、40-80％、50-90％、60-100％、10-60％、20-70％、30-80％、40-90％、50-100％、10-70％、20-80％、30-90％、40-100％、10-80％、20-90％、30-100％、10-90％、20-100％、25-50％、50-75％或75-100％。87.在一个实施方案中，sre源自亲本蛋白(例如，ca2)或源自突变蛋白，并且可以与亲本蛋白或突变蛋白具有1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、10-40％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％、60-90％、70-100％、10-50％、20-60％、30-70％、40-80％、50-90％、60-100％、10-60％、20-70％、30-80％、40-90％、50-100％、10-70％、20-80％、30-90％、40-100％、10-80％、20-90％、30-100％、10-90％、20-100％、25-50％、50-75％或75-100％的同一性。88.从亲本蛋白的蛋白结构域鉴定的候选去稳定结构域序列(作为模板)可以是突变的，从而基于模板候选结构域序列生成突变体的文库(libraries)。用以生成dd文库的诱变策略可以包括：定点诱变，例如通过使用结构引导信息；或者，随机诱变，例如使用易错pcr；或者，两者的组合。在一些实施方案中，使用随机诱变鉴定的去稳定结构域可以用于鉴定去稳定化可能需要的候选dd的结构性特性，然后可以用以使用定点诱变进一步生成突变体的文库。89.在一些实施方案中，与野生型蛋白相比，dd突变体文库可以针对具有改变的、优选更高的、对配体的结合亲和力的突变体进行筛选。dd文库也可以使用两个或更多个配体进行筛选，并且可以优先选择由一些配体稳定而不是由其他配体稳定化的dd突变。与天然存在的蛋白质相比，也可以选择优先结合至配体的dd突变。此类方法可以用以优化dd的配体选择和配体结合亲和力。额外地，此类方法可以用以使由脱靶配体结合引起的有害影响最小化。90.在一些实施方案中，可以通过使用条形码筛选突变体文库来鉴定合适的dd。此类方法可以用以检测、鉴定和量化异质突变体文库内的个体突变克隆体。文库内的每个dd突变体可以具有不同的条形码序列(相对于彼此)。在其他情况下，多核苷酸还可以具有相对于2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核酸碱基的不同的条形码序列。文库内的每个dd突变体还可以包括多个条形码序列。当使用多个时，可以使每个条形码对于任何其他条形码都是唯一的。替代地，使用的每个条形码可以不是唯一的，但所使用的条形码的组合可以创建可以单独跟踪的唯一序列。条形码序列可以放置在sre的上游、sre的下游，或者在某些情况下可以放置在sre内。dd突变体可以通过条形码使用测序方法(例如，桑格测序(sangersequencing)和下一代测序)来进行鉴定，但也可以通过聚合酶链反应和定量聚合酶链反应来进行鉴定。在一些实施方案中，可以使用用于每个条形码扩增不同大小产物的聚合酶链反应引物来鉴定琼脂糖凝胶(agarosegel)上的每个条形码。在其他情况下，每个条形码可以具有能够使每个条形码靶向地扩增的唯一的定量聚合酶链反应探针序列。91.在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括至少一个去稳定结构域(dd)。效应器模块和/或sre可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个的dd。当存在多于一个dd时，dd中的每一个可以源自相同的亲本蛋白、源自不同的亲本蛋白，可以是两种不同亲本蛋白的融合体，或者可以是人工的。92.在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括2个dd。在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括3个dd。在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括4个dd。在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括5个dd。在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括6个dd。在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括7个dd。在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括8个dd。在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括9个dd。在一个实施方案中，本公开的效应器模块和/或sre可以包括10个dd。dd可以源自本领域已知的、和/或本文所描述的任何亲本蛋白。在一些实施方案中，dd源自相同的亲本蛋白。在一些实施方案中，dd源自相同的亲本蛋白的不同区域。在一些实施方案中，dd源自不同的亲本蛋白。93.ca2去稳定结构域94.在一些实施方案中，本公开的dd可以源自人碳酸酐酶2ca2，ca2是存在于所有生命界的金属酶超家族的碳酸酐酶(ca，ec4.2.1.1)的成员。ca平衡三种化学物质之间的反应：co2、碳酸氢盐(bicarbonate)和质子。ca已经趋同地进化，具有在细菌、古生菌和真核生物中独立地进化的七个遗传上不同的ca家族，其分别是α-ca、β-ca、γ-ca、δ-ca、ζ-ca、η-ca和θ-ca。在一些实施方案中，本文所描述的dd可以源自至少一种亲本蛋白，所述亲本蛋白选自，但不限于：碳酸酐酶2(ca2)、碳酸酐酶1(ca1)、碳酸酐酶3(ca3)、碳酸酐酶4(ca4)、碳酸酐酶5a(ca5a)、碳酸酐酶5b(ca5b)、碳酸酐酶6(ca6)、碳酸酐酶7(ca7)、碳酸酐酶8(ca8)、碳酸酐酶9(ca9)、碳酸酐酶10(ca10)、碳酸酐酶11(ca11)、碳酸酐酶12(ca12)、碳酸酐酶13(ca13)和碳酸酐酶14(ca14)。95.在一个实施方案中，dd可以源自细胞溶质的ca，例如但不限于：碳酸酐酶2(ca2)、碳酸酐酶1(ca1)、碳酸酐酶3(ca3)、碳酸酐酶7(ca7)和碳酸酐酶13(ca13)。在一个实施方案中，dd可以源自线粒体的ca，例如但不限于：碳酸酐酶5a(ca5a)和碳酸酐酶5b(ca5b)。在一个实施方案中，dd可以源自分泌的ca，例如但不限于：碳酸酐酶6(ca6)。在一个实施方案中，dd可以源自膜关联的ca，例如但不限于：碳酸酐酶4(ca4)、碳酸酐酶9(ca9)、碳酸酐酶12(ca12)和碳酸酐酶14(ca14)。在一个实施方案中，dd源自ca2。在另一方面，dd可以源自ca9。96.在一些实施方案中，本公开的dd可以源自ca2(seqidno.5810；uniprotid：p00918)，其可以通过配体(例如，ca2的小分子抑制剂)来稳定。如本文所使用的，术语“ca2wt”是指人野生型ca2蛋白序列，其被定义为seqidno.5810，具有基因库(genbank)访问号p00918，具有以下氨基酸序列：97.mshhwgygkhngpehwhkdfpiakgerqspvdidthtakydpslkplsvsydqatslrilnnghafnvefddsqdkavlkggpldgtyrliqfhfhwgsldgqgsehtvdkkkyaaelhlvhwntkygdfgkavqqpdglavlgiflkvgsakpglqkvvdvldsiktkgksadftnfdprgllpesldywtypgslttppllecvtwivlkepisvsseqvlkfrklnfngegepeelmvdnwrpaqplknrqikasfk。98.在一些实施方案中，本公开的dd可以通过利用ca2抑制剂的混合物(cocktail)来鉴定。在其他情况下，合适的dd可以通过首先用一种ca2抑制剂筛选且随后用第二种ca2抑制剂筛选来鉴定。99.本公开中涉及的去稳定结构域的氨基酸序列与本文提出的氨基酸序列具有至少约40％、50％或60％的同一性，进一步具有至少约70％的同一性，优选具有至少约75％或80％的同一性，更优选具有至少约85％、86％、87％、88％、89％或90％的同一性，并且进一步优选具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。百分比同一性例如可以通过使用高级blast计算机程序(包括可以从美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)获得的magic-blast1.2.0版)的比较序列信息来确定。blast程序基于karl和altschul(1990)proc.natl.acad.sciusa,87:2264-68(其内容通过引用整体并入本文)中讨论的比对方法(alignmentmethod)。100.在一些实施方案中，源自ca2的dd可以包括亲本ca2序列的氨基酸2-260。这在本文中称为m1del突变。在一个实施方案中，源自ca2的dd可以包括亲本ca2序列的氨基酸2-237。101.本文在表1、表2、表3、表4和表6中提供了通过诱变鉴定的ca2突变体，该诱变例如：使用核苷酸类似物诱变和易错pcr的组合的随机诱变筛选，以生成突变体的文库；或者，饱和诱变。ca2去稳定突变体也可以通过结构引导的诱变来鉴定并提供在表1中。表1、表2、表3、表4、表5和表6中列出的突变氨基酸的位置是相对于seqidno.5810的全长ca2。102.表1：ca2dd103.104.105.106.107.108.109.[0110][0111]在表2中提供了额外的ca2去稳定结构域。[0112]表2：ca2dd[0113][0114][0115][0116][0117][0118][0119][0120]在一些实施方案中，本文所描述的ca2dd可以包括表3中提供的序列中的任一个。在表3中，“*”代表终止密码子的翻译。当表3中的氨基酸序列含有一个或多个终止密码子时，“氨基酸seqidno.”列以组分在氨基酸序列中出现的顺序提供终止密码子之前和之后的各个组分的seqidno.。[0121]表3：ca2dd[0122][0123][0124][0125][0126][0127][0128][0129]在表4中提供了额外的ca2去稳定结构域。如上文所描述的鉴定在表4中提供的ca2去稳定突变体，例如通过结构引导的诱变或通过组合单个突变体。[0130]表4:ca2dd[0131][0132][0133][0134][0135][0136][0137]在一些实施方案中，ca2wt的区域或部分可以用作生成ca2dd的模板。在一些实施方案中，ca2dd可以排除seqidno.5810的位置260处的赖氨酸。在一些方面，ca2区域可以包括但不限于表5中所描述的那些ca2区域。[0138]表5：ca2区域[0139][0140][0141]可以采用本文所描述的ca2区域中的任一个以生成ca2dd。表6提供了源自ca2区域的ca2dd。[0142]表6：源自ca2区域的ca2dd[0143][0144][0145]在一些实施方案中，源自ca2的dd可以包括在之前表格中描述的突变中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个。[0146]在一些实施方案中，源自ca2的dd包括相对于野生型ca2的氨基酸序列的至少一个突变，该突变在不存在刺激的情况下使dd和可操作地连接至dd或包括dd的sre的至少一种有效负载去稳定。在存在刺激的情况下，dd和至少一个有效负载是稳定化的。在一些实施方案中，源自ca2的dd包括一个、两个、三个、四个或更多个突变，这些突变在不存在刺激的情况下使dd和至少一个可操作地连接的有效负载去稳定。在一些实施方案中，源自包括至少一个突变的ca2的dd的去稳定率低于野生型ca2的去稳定率。在一些实施方案中，源自包括至少一个突变的ca2的dd的稳定率高于野生型ca2的稳定率。在一些实施方案中，dd可以包括不显著影响去稳定率和稳定率的一个或多个额外的突变。[0147]在一些实施方案中，突变可以是保守的(具有与突变位点处的氨基酸相似的物理化学特性)、半保守的(例如，带负电荷到带正电荷的氨基酸)或非保守的(具有与突变位点处的氨基酸不同的物理化学特性的氨基酸)。在一些实施方案中，氨基酸赖氨酸可以突变为谷氨酸或精氨酸；氨基酸苯丙氨酸可以突变为亮氨酸；氨基酸亮氨酸可以突变为苯丙氨酸；或者，氨基酸天冬酰胺可以突变为丝氨酸。可以全部或部分采用野生型蛋白的区域、或部分、或结构域作为sre/dd。它们可以组合或重新排列以创建新的肽、蛋白质、区域或结构域，其中任何一个都可以作为sre/dd使用或用于进一步sre和/或dd的设计的出发点。[0148]本文所描述的去稳定结构域还可以包括不影响稳定性的氨基酸和核苷酸置换，其包括保守、非保守置换和/或多态性。在一些实施方案中，本文所描述的ca2dd也可以是上述去稳定结构域的片段，其包括含有变体氨基酸序列的片段。优选的片段在不存在刺激的情况下是不稳定的，并且在加入刺激后被稳定。优选的片段保留以与本文所描述的dd相似的效率与刺激相互作用的能力。[0149]在一个实施方案中，sre包括ca2蛋白的区域。ca2蛋白的区域的长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260个或多于260个的氨基酸。亲本蛋白的区域的长度可以是5-50、25-75、50-100、75-125、100-150、125-175、150-200、175-225、200-250、225-260个氨基酸。[0150]在一些实施方案中，本公开提供了包括人碳酸酐酶2(ca2；seqidno.5810)的区域或全部人碳酸酐酶2的dd，并且还包括相对于seqidno.5810的突变，该突变选自：a115l、a116q、a116v、a133l、a133t、a141p、a152d、a152l、a152r、a173c、a173g、a173l、a173t、a23p、a247l、a247s、a257l、a257s、a38p、a38v、a54q、a54v、a54x、a65l、a65n、a65v、a77i、a77p、a77q、c205m、c205r、c205v、c205w、c205y、d101g、d101m、d110i、d129i、d138g、d138m、d138n、d161*、d161m、d161v、d164g、d164i、d174*、d174t、d179e、d179i、d179r、d189g、d189i、d19t、d19v、d242g、d242t、d32t、d34t、d41t、d52i、d52l、d71f、d71g、d71k、d71m、d71s、d71y、d72i、d72s、d72t、d72x、d75t、d75v、d85m、e106d、e106g、e106s、e117*、e117n、e14n、e186*、e186n、e204a、e204d、e204g、e204n、e213*、e213g、e213n、e220k、e220r、e220s、e233d、e233g、e233r、e235*、e235g、e235n、e237k、e237r、e238*、e238n、e238r、e26s、e69d、e69k、e69s、f130l、f146v、f175i、f175l、f175s、f178l、f178s、f20l、f20s、f225i、f225l、f225s、f225y、f230i、f230l、f230s、f259l、f259s、f66s、f70i、f70l、f95y、g102d、g104r、g104v、g128r、g12d、g12e、g131e、g131r、g131w、g139d、g144d、g144v、g150a、g150s、g150w、g155a、g155c、g155d、g155s、g170a、g170d、g182a、g182w、g195a、g195r、g232r、g232w、g234l、g234v、g25e、g63d、g63v、g81e、g81v、g82d、g86a、g86d、g98v、h107i、h107q、h119t、h119y、h122t、h122y、h15l、h15t、h15y、h17d、h17i、h36i、h36q、h64m、h94t、h96t、i145f、i145m、i166h、i166l、i209d、i209l、i215h、i215s、i22l、i255n、i255s、i33s、i59f、i59n、i59s、i91f、k111e、k111n、k112r、k113i、k113n、k126n、k132e、k132r、k148e、k148r、k153*、k153n、k158e、k158n、k167*、k169n、k169r、k171q、k171r、k18r、k212n、k212q、k212r、k212w、k224e、k224n、k227*、k227n、k24r、k251e、k251r、k256q、k260f、k260l、k260q、k39s、k45n、k45s、k80m、k80r、l118f、l120w、l140v、l140w、l143*、l147*、l147f、l156f、l156h、l156p、l156q、l163a、l163w、l183p、l183s、l184f、l184p、l188p、l188w、l197*、l197m、l197p、l197r、l197t、l202f、l202h、l202i、l202p、l202r、l202s、l203p、l203s、l203w、l211*、l211a、l211s、l223*、l223i、l223v、l228f、l228h、l228t、l239*、l239f、l239t、l250*、l250p、l250t、l44*、l44m、l47c、l47v、l57*、l57x、l60s、l79f、l79s、l84w、l90*、l90v、m240d、m240l、m240r、m240w、n11d、n11k、n124t、n177*、n177t、n229*、n229t、n231d、n231f、n231k、n231l、n231m、n231q、n231t、n243q、n243t、n252e、n252t、n61r、n61t、n61y、n62k、n62m、n67d、n67t、p137l、p13a、p13h、p13l、p13s、p154l、p154r、p154t、p180l、p180s、p185l、p185s、p185v、p194q、p200a、p200l、p200s、p200t、p201a、p201l、p201r、p201s、p214t、p236l、p236t、p246l、p246q、p249a、p249f、p249h、p249i、p249x、p30l、p30s、p42l、p83a、q103k、q135s、q136n、q157r、q157s、q221a、q221r、q248f、q248l、q248s、q254a、q254k、q28s、q53h、q53k、q53n、q74r、q92h、q92s、r181h、r181s、r181v、r226h、r226p、r226v、r245a、r253g、r253q、r27a、r58g、r89d、r89f、r89i、r89x、r89y、s105l、s105q、s151a、s151i、s151q、s165f、s165p、s172e、s172v、s187i、s187p、s196h、s196l、s216a、s216q、s218a、s218q、s219a、s219q、s258f、s258p、s29c、s29p、s43p、s43t、s48l、s50p、s56f、s56n、s56p、s56x、s73l、s73n、s73x、s99h、t108l、t125i、t125p、t168k、t168n、t168q、t176h、t176l、t192d、t192f、t192i、t192n、t192p、t192x、t198d、t198i、t198p、t199a、t199h、t199p、t207d、t207i、t207p、t207s、t35i、t35l、t37q、t55l、t87l、v109m、v109w、v121f、v134c、v134f、v142f、v149g、v149l、v159l、v159s、v160c、v160l、v162a、v162c、v206*、v206c、v206m、v210c、v217l、v217r、v217s、v222a、v222c、v222g、v241g、v241w、v241x、v31l、v49f、v68l、v68w、v78c、w123g、w123r、w16g、w191*、w191g、w191l、w208g、w208l、w208s、w244*、w244g、w244l、w97c、w97g、y114h、y114m、y127m、y190*、y190l、y190t、y193c、y193f、y193i、y193l、y193t、y193v、y193x、y40m、y51f、y51m、y51t、y51x、y88t、k9n和s29a。如本文所使用的，“*”表示终止密码子的翻译，并且“x”表示任何氨基酸。[0151]在一些实施方案中，本公开提供了包括人碳酸酐酶2(ca2；seqidno.5810)的区域或全部人碳酸酐酶2的dd，并且还包括相对于seqidno.5810的突变，该突变选自：e106d、g63d、h122y、i59n、l156h、l183s、l197p、s56f、s56n、w208s、y193i和y51t。[0152]在一些实施方案中，本公开提供了包括人碳酸酐酶2(ca2；seqidno.5810)的区域或全部人碳酸酐酶2的dd，并且还包括相对于seqidno.5810的两个或更多个突变。在一些实施方案中，dd可以包括ca2(wt的氨基酸2-260，r27l、h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i、h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y、n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l、l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k、g63n、q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、a257del、s258del、f259del、k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、s2del、h3del、h4del、w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y、l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、g234del、e235del、p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n、d74n、d100n、l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n、g102r)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d、e69v、n231i)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l、t87i、h122y、n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、v241f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l、t87n、l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、s172c、f178y、e186d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71f、n231f)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77i、p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k、p249h)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、p249h)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53n、n61y)、ca2(wt的氨基酸2-260，e106d、c205s)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s、w208s)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n、r89y)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k、t192f)、ca2(wt的氨基酸2-260，y193l、k260l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71f、v241f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，l147f、q248f)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52i、s258p)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72s、t192n)、ca2(wt的氨基酸2-260，d179e、t192i)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56n、q103k)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71y、q248l)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n、r89f)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k、n231l、e235g、l239f)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、p249i)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72x、v241x、p249x)、ca2(wt的氨基酸2-260，a54x、s56x、l57x、t192x)、ca2(wt的氨基酸2-260，y193v、k260f)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d、m240l)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f、l228f)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71g、n231k)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56f、d71s)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52l、g128r、q248f)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73x、r89x)、ca2(wt的氨基酸2-260，y51x、d72x、v241x、p249x)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72i、w97c)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k、t192f、n231f)、ca2(wt的氨基酸2-260，h36q、s43t、y51f、n67d、g131w、r226h)、ca2(wt的氨基酸2-260，f70i、f146v)、ca2(wt的氨基酸2-260，k45n、v68l、h119y、k169r、d179e)、ca2(wt的氨基酸2-260，h15l、a54v、k111e、e220k、f225i)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13s、p83a、d101g、k111n、f230i)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d、w123r、e220k)、ca2(wt的氨基酸2-260，n11d、e69k、g86d、v109m、k113i、t125i、d138g、g155s)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n、g102r、a173t)、ca2(wt的氨基酸2-260，l79f、p180s)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77p、g102r、d138n)、ca2(wt的氨基酸2-260，f20l、k45n、g63d、e69v、n231i)、ca2(wt的氨基酸2-260，t199n、l202p、l228f)、ca2(wt的氨基酸2-260，k9n、h122y、t168k)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53h、l90v、q92h、g131e)、ca2(wt的氨基酸2-260，l44m、l47v、n62k、e69d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d75v、k169n、f259l)、ca2(wt的氨基酸2-260，t207s、v222a、n231d)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59f、v206m、g232r)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13a、a133t)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n、r89i)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65n、g86d、g131r、g155d、k158n、v162a、g170d、p236l)、ca2(wt的氨基酸2-260，g12r、h15y、d19v)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65v、f95y、e106g、h107q、i145m、f175i)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d、e69v、n231i)、ca2(wt的氨基酸2-260，s29a、c205s)、和/或ca2(wt的氨基酸2-260，s29c、c205s)。如本文所使用的，“x”表示任何氨基酸。[0153]在一些实施方案中，dd可以包括ca2(wt的氨基酸2-260，r27l、h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i、h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y、n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l、l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k、g63n、q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、a257del、s258del、f259del、k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、s2del、h3del、h4del、w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y、l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、g234del、e235del、p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n、d74n、d100n、l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n、g102r)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d、e69v、n231i)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l、t87i、h122y、n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f、v241f、p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l、t87n、l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h、s172c、f178y、e186d)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77i、p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，e106d、c205s)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s、w208s)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n、r89y)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k、t192f)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n、r89f)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d、m240l)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f、l228f)、和/或ca2(wt的氨基酸2-260，s56f、d71s)。[0154]在一些实施方案中，ca2可以源自智人(homosapiens)的碳酸酐酶。在一些实施方案中，本文所描述的ca2dd可以与由本文中所描述的以及本领域技术人员已知的序列比对程序和参数确定的特定参考多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、但小于100％的序列同一性。在一些实施方案中，参考多肽可以是seqidno.5810。用于比对的工具可以包括blast套件的那些工具(stephenf.altschul、etal.(1997)，“gappedblastandpsi-blast：anewgenerationofproteindatabasesearchprograms”，nucleicacidsres.25:3389-3402)。[0155]在一些实施方案中，ca2dd可以源自除智人之外的物种的碳酸酐酶。在一些实施方案中，ca2dd可以源自例如但不限于以下的物种的碳酸酐酶：猎豹(acinonyxjubatus)、大熊猫(ailuropodamelanoleuca)、小鳁鲸北太平洋亚种(balaenopteraacutorostratascammoni)、普通狨(callithrixjacchus)、北海狗(callorhinusursinus)、双峰驼(camelusbactrianus)、单峰驼(camelusdromedarius)、野骆驼(camelusferns)、澳洲野犬(canislupusdingo)、家犬(canislupusfamiliaris)、菲律宾眼镜猴(carlitosyrichta)、美洲河狸(castorcanadensis)、巴拿马卷尾猴(cebuscapucinusimitator)、南白犀(ceratotheriumsimumsimum)、白枕白眉猴(cercocebusatys)、毛丝鼠(chinchillalanigera)、绿猴(chlorocebussabaeus)、安哥拉疣猴彼得斯亚种(colobusangolensispalliatus)、白鲸(delphinapterusleucas)、奥氏更格卢鼠(dipodomysordii)、阿拉斯加海獭(enhydralutriskenyoni)、非洲野驴(equusasinus)、马(equuscaballus)、普氏野马(equusprzewalskii)、刺猬(erinaceuseuropaeus)、北海狮(eumetopiasjubatus)、家猫(feliscatus)、马来亚鼯猴(galeopterusvariegatus)、西非低地大猩猩(gorillagorillagorilla)、智人、地松鼠(ictidomystridecemlineatus)、非洲跳鼠(jaculusjaculus)、太平洋短吻海豚(lagenorhynchusobliquidens)、节尾狐猴(lemurcatta)、韦德尔氏海豹(leptonychotesweddellii)、白暨豚(lipotesvexillifer)、非洲草原象(loxodontaafricana)、食蟹猴(macacafascicularis)、恒河猴(macacamulatta)、豚尾猴(macacanemestrina)、鬼狒(mandrillusleucophaeus)、马来穿山甲(manisjavanica)、黄腹旱獭(marmotaflaviventris)、阿尔卑斯旱獭(marmotamarmotamarmota)、小嘴狐猴(microcebusmurinus)、卡氏小鼠(muscaroli)、小家鼠(musmusculus)、锡金小鼠(muspahari)、地中海雪貂(mustekputoriusfuro)、以色列鼹鼠(nannospalaxgalili)、夏威夷僧海豹(neomonachusschauinslandi)、长江江豚(neophocaenaasiaeorientalisasiaeorientalis)、白颊长臂猿(nomascusleucogenys)、太平洋海象(odobenusrosmarusdivergens)、虎鲸(orcinusorca)、家兔(oryctolaguscuniculus)、加氏大婴猴(otolemurgamettii)、倭黑猩猩(panpaniscus)、黑猩猩(pantroglodytes)、金钱豹(pantherapardus)、东北虎(pantheratigrisaltaica)、东非狒狒(papioanubis)、抹香鲸(physetercatodon)、乌干达红疣猴(piliocolobustephrosceles)、苏门答腊猩猩(pongoabelii)、克氏冕狐猴(propithecuscoquereli)、美洲狮(pumaconcolor)、滇金丝猴(rhinopithecusbieti)、川金丝猴(rhinopithecusroxellana)、玻利维亚亚马逊松鼠猴(saimiriboliviensisboliviensis)、欧亚野猪(susscrofa)、狮尾狒(theropithecusgelada)、佛罗里达海牛(trichechusmanatuslatirostris)、树鼩(tupaiachinensis)、宽吻海豚(tursiopstruncatus)、堪察加北极地松鼠(urocitellusparryii)、北美灰熊(ursusarctoshorribilis)、北极熊(ursusmaritimus)、赤狐(vulpesvulpes)、和/或加利福尼亚海狮(zalophuscalifornianus)。[0156]sre的稳定率和去稳定率[0157]在一些实施方案中，本公开提供了用于通过测量稳定率和去稳定率来调整蛋白表达、功能或水平的方法。如本文所使用的，稳定率可以被定义为对刺激进行应答的目的蛋白的表达、功能或水平与在不存在对sre的特异性刺激的情况下目的蛋白的表达、功能或水平的比率。在一些方面，稳定率至少为1，例如至少达到1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、20-30、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-95、20-100、30-40、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-95、30-100、40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-95、40-100、50-60、50-70、50-80、50-90、50-95、50-100、60-70、60-80、60-90、60-95、60-100、70-80、70-90、70-95、70-100、80-90、80-95、80-100、90-95、90-100或95-100。如本文所使用的，去稳定率可以被定义为在不存在对sre特异性的刺激的情况下目的蛋白的表达、功能或水平与在不存在对sre特异性的刺激的情况下组成型表达的目的蛋白的表达、功能或水平的比值。如本文所使用的，“组成型”是指没有连接至sre并且因此在存在和不存在刺激的情况下都被表达的目的蛋白的表达、功能或水平。在一些方面，去稳定率至少为0，例如至少达到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或至少为0-0.1、0-0.2、0-0.3、0-0.4、0-0.5、0-0.6、0-0.7、0-0.8、0-0.9、0.1-0.2、0.1-0.3、0.1-0.4、0.1-0.5、0.1-0.6、0.1-0.7、0.1-0.8、0.1-0.9、0.2-0.3、0.2-0.4、0.2-0.5、0.2-0.6、0.2-0.7、0.2-0.8、0.2-0.9、0.3-0.4、0.3-0.5、0.3-0.6、0.3-0.7、0.3-0.8、0.3-0.9、0.4-0.5、0.4-0.6、0.4-0.7、0.4-0.8、0.4-0.9、0.5-0.6、0.5-0.7、0.5-0.8、0.5-0.9、0.6-0.7、0.6-0.8、0.6-0.9、0.7-0.8、0.7-0.9或0.8-0.9。[0158]在一些实施方案中，效应器模块的sre可以以1或更大的稳定率来稳定目的有效负载，其中稳定率可以包括在存在刺激的情况下目的有效负载的表达、功能或水平与在不存在刺激的情况下目的有效负载的表达、功能或水平的比率。[0159]在一些实施方案中，sre可以通过在0与0.09之间的去稳定率使有效负载去稳定，其中去稳定率可以包括在不存在对sre特异性的刺激的情况下目的有效负载的表达、功能或水平与在不存在对sre特异性的刺激的情况下组成型表达的目的有效负载的表达、功能或水平的比率。[0160]有效负载[0161]如本文所使用的，“有效负载”或“靶向有效负载”或“目的有效负载(payloadofinterest，poi)”被定义为功能待被改变的任何蛋白质或核酸。[0162]有效负载可以包括任何编码或非编码基因或任何蛋白质或其片段。[0163]有效负载通常与一种或多种sre相关联，并且可以单独地或与本公开的多核苷酸中的一种或多种sre组合地编码。有效负载本身可以被改变(在蛋白质或核酸水平下)，从而提供用于效应器模块的额外的可维持层(addedlayeroftenability)。例如，有效负载可以被工程化或设计以含有单个或多个突变，该突变影响有效负载的稳定性或有效负载对降解、切割或转运的敏感性(susceptibility)。可以具有对刺激的一系列(aspectrumof)应答的sre与被改变以表现出输出信号的各种应答或等级(例如，表达水平)的有效负载的组合产生优于现有技术的生物回路。独立调节sre和有效负载的能力极大地增加了本公开的效应器模块的使用范围。[0164]如本文所使用的，当涉及效应器模块、sre或有效负载时，短语“源自”是指效应器模块、sre或有效负载至少部分源自所述的亲本分子或序列。例如，在设计sre时，这种sre可以源自天然存在的蛋白表位或蛋白区域，但随后已以本文教导的任何方式进行修饰以优化sre功能。[0165]在一个实施方案中，有效负载源自亲本蛋白的区域或源自突变蛋白。亲本蛋白的区域的长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450个或多于450个氨基酸。亲本蛋白的区域的长度可以是5-50、25-75、50-100、75-125、100-150、125-175、150-200、175-225、200-250、225-275、250-300、275-325、300-350、325-375、350-400、375-425或400-450个氨基酸。[0166]在一个实施方案中，有效负载源自亲本蛋白的区域或源自突变蛋白，并且包括亲本蛋白的区域。有效负载可以包括亲本蛋白的区域，该区域是亲本蛋白或突变蛋白的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、10-40％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％、60-90％、70-100％、10-50％、20-60％、30-70％、40-80％、50-90％、60-100％、10-60％、20-70％、30-80％、40-90％、50-100％、10-70％、20-80％、30-90％、40-100％、10-80％、20-90％、30-100％、10-90％、20-100％、25-50％、50-75％或75-100％。[0167]在一个实施方案中，有效负载源自亲本蛋白或源自突变蛋白，并且可以具有与亲本蛋白或突变蛋白1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、10-40％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％、60-90％、70-100％、10-50％、20-60％、30-70％、40-80％、50-90％、60-100％、10-60％、20-70％、30-80％、40-90％、50-100％、10-70％、20-80％、30-90％、40-100％、10-80％、20-90％、30-100％、10-90％、20-100％、25-50％、50-75％或75-100％的同一性。[0168]在一个实施方案中，第一有效负载的跨膜结构域区域可以与来自第二亲本蛋白的跨膜结构域、其变体或片段替换。[0169]多肽及作为有效负载的多肽[0170]本公开的刺激、生物回路组分、效应器模块(包括其sre和有效负载)可以作为全部多肽、多个多肽或多肽的片段存在，该全部多肽、多个多肽或多肽的片段可以独立地由一种或多种核酸、多种核酸或核酸片段或上述任一种的变体编码。[0171]如本文所使用的，术语“多肽”是指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然的)的聚合物。如本文所使用的，该术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸，那么该多肽被称为肽。如果该多肽是肽，则其至少为约2、3、4或至少5个氨基酸残基长。因此，多肽包括：基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述物质的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或可以是多分子复合物(例如，二聚体、三聚体或四聚体)。它们还可以包括单链或多链的多肽，并且可以是关联的或连接的。术语多肽还可以适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。[0172]如本文所使用的，术语“多肽变体”是指其氨基酸序列与天然的或参考的序列不同的分子。与天然的或参考的序列相比，氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置处拥有替代、缺失和/或插入。通常，变体与天然的或参考的序列将拥有至少约50％的同一性(同源性)，并且优选地，变体将与天然的或参考的序列至少约80％、更优选至少约90％相同(同源性)。[0173]在一些实施方案中，提供了“变体模拟物”。如本文所使用的，术语“变体模拟物”是指含有将模拟激活序列的一个或多个氨基酸的变体。例如，谷氨酸可以作为用于磷酸-苏氨酸和/或磷酸-丝氨酸的模拟物。替代地，变体模拟物可以导致去活(deactivation)或含有模拟物(例如，苯丙氨酸)的失活产物(inactivatedproduct)可以作为用于酪氨酸的失活替代物；或者，丙氨酸可以作为用于丝氨酸的失活替代物。本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)的氨基酸序列可以包括天然存在的氨基酸，并且同样地可以被认为是蛋白质、肽、多肽或其片段。替代地，药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)可以包括天然地和非天然地存在的氨基酸。[0174]如本文所使用的，术语“氨基酸序列变体”是指与天然或起始序列相比，其氨基酸序列具有一些差异的分子。氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置处拥有取代、缺失和/或插入。如本文所使用的，当提及序列时，术语“天然”或“起始”是相对术语，是指可以与之进行比较的原始分子。天然或起始序列不应当与野生型序列混淆。天然序列或分子可以代表野生型(自然界中发现的序列)，但不必与野生型序列相同。[0175]通常，变体将拥有与天然序列至少约70％的同源性，并且优选地，变体将是与天然序列至少约80％、更优选至少约90％同源的。[0176]如本文所使用的，术语“同源性”在应用于氨基酸序列时被定义为在比对序列和引入缺口(如果必要)以实现最大百分比的同源性之后，与第二序列的氨基酸序列中的残基相同的候选氨基酸序列中的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。应当理解，同源性取决于百分比同一性的计算，但由于计算中引入的缺口和惩罚项(penalties)，其值可能不同。[0177]如本文所使用的，术语“同源物”在应用于氨基酸序列时是指与第二物种的第二序列具有基本同一性的其他物种的相应序列。[0178]如本文所使用的，术语“类似物”是指包括通过一个或多个氨基酸改变(例如，仍保持亲本多肽的特性的氨基酸残基的取代、添加或缺失)而不同的多肽变体。[0179]如本文所使用的，术语“衍生物”与术语“变体”同义地使用，并且是指相对于参考分子或起始分子已经以任何方式修饰或改变的分子。[0180]本公开考虑了包括变体和衍生物的氨基酸类的几种类型的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)。这些变体和衍生物包括取代性、插入性、缺失性和共价性变体和衍生物。同样地，包括在本公开范围内的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)包括取代、插入、添加、缺失和/或共价修饰。例如，可以将序列标签或氨基酸(例如，一种或多种赖氨酸)添加至本公开的肽序列(例如，在n-末端或c-末端处)。序列标签可以用于肽纯化或定位。赖氨酸可以用以增加肽溶解度或允许用于生物素化。替代地，可以任选地删除位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域处的氨基酸残基，以提供截短的序列。某些氨基酸(例如，c-末端残基或n-末端残基)可以根据序列的用途替代地被删除，例如，作为可溶的或连接至固体支持物的更大序列的部分序列的表达。[0181]当提及蛋白质时，“取代性变体”是指去除天然或起始序列中的至少一个氨基酸残基并在相同位置插入不同氨基酸的那些变体。取代可以是单个的，其中分子中只有一个氨基酸被取代，或者取代可以是多个的，其中在同一分子中两个或更多个氨基酸被取代。[0182]如本文所使用的，术语“保守性氨基酸取代”是指用相似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代通常存在于序列中的氨基酸。保守性取代的实施例包括用非极性(疏水性)残基(例如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸)取代另一个非极性残基。类似地，保守性取代的实施例包括用一个极性(亲水性)残基取代另一个极性(亲水性)残基，例如在精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、以及甘氨酸和丝氨酸之间。额外地，用碱性残基(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一个碱性残基，或者用一个酸性残基(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代另一个酸性残基，这是保守性取代的额外实施例。非保守性取代的实施例包括用非极性(疏水性)氨基酸残基(例如，异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸)取代极性(亲水性)残基(例如，半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸)、和/或用极性残基取代非极性残基。[0183]如本文所使用的，当提及蛋白质时，术语“插入性变体”是具有在天然或起始序列中的特定位置处紧邻氨基酸插入的一个或多个氨基酸的那些变体。如本文所使用的，术语“紧邻(immediatelyadjacent)”是指连接至起始或参考氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团的相邻氨基酸。[0184]如本文所使用的，当提及蛋白质时，术语“缺失性变体”是指具有去除的天然或起始氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的那些变体。通常，缺失性变体将在分子的特定区域中具有一个或多个缺失的氨基酸。[0185]如本文所使用的，本文所指的术语“衍生物”包括天然或起始蛋白的变体，这些变体包括用有机蛋白或非蛋白衍生剂进行的一种或多种修饰、以及翻译后修饰。共价性修饰传统上是通过使蛋白质的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应、或通过利用在选定的重组宿主细胞中起作用的翻译后修饰机制来引入的。所得的共价性衍生物在旨在鉴定对生物活性、对免疫测定或对用于重组糖蛋白的免疫亲和纯化的抗蛋白抗体的制备重要的残基的程序中是有用的。此类修饰在本领域普通技术范围内，并且在无需过多实验的情况下即可进行。[0186]如本文所使用的，术语“位点(site)”在其从属于氨基酸类的实施方案时与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义地使用。位点代表肽或多肽内的位置，该肽或多肽可以在本公开的多肽类的分子内被修饰、操纵、改变、衍生化或变化。[0187]如本文所使用的，当提及蛋白质时，术语“多个末端(termini)”或“末端(terminus)”是指肽或多肽的端部。这种端部不仅限于肽或多肽的第一个或最后一个位点，还可以包括在末端区域中的额外的氨基酸。本公开的多肽类的分子可以以具有n-末端(由具有游离氨基(nh2)的氨基酸终止)和c-末端(由具有游离羧基(cooh)的氨基酸终止)为特征。[0188]在一些情况下，本公开的多肽或蛋白质由通过二硫键或通过非共价力(多聚体、寡聚体)聚集在一起的多个多肽链组成。这些种类的蛋白质将具有多个n末端和c末端。替代地，多肽的末端可以被修饰，使得多肽在开始或结束时(视情况而定)具有非多肽类的部分(例如，有机缀合物)。[0189]一旦任何特征被鉴定或定义为本公开的生物回路系统组分、刺激、效应器模块(包括sre或有效负载)的组分，则这些特征的若干操纵和/或修饰中的任一种可以通过以下进行：移动、交换、反转、删除、随机化或复制。此外，应当理解的是，特征的操纵可以导致与对本公开的组合物的修饰相同的结果。例如，涉及删除结构域的操纵将导致分子长度的改变，正如修饰核酸以使其编码少于全长分子一样。[0190]修饰和操作可以通过本领域已知的方法(例如，定点诱变)完成。然后，可以使用体外或体内测定法(例如，本文所述的那些测定法或本领域已知的任何其他合适的筛选测定法)对所得的修饰分子的活性进行测试。[0191]在一些实施方案中，本公开的组合物可以包括作为同位素的一个或多个原子。如本文所使用的，术语“同位素”是指具有一个或多个额外的中子的化学元素。在一些实施方案中，可以使本公开的化合物氘化。如本文所使用的，术语“氘化”是指用氘同位素代替物质中的一个或多个氢原子的过程。氘同位素是氢的同位素。氢的原子核含有一个质子，而氘的原子核含有一个质子和一个中子。可以使本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)氘化，以便改变一种或多种物理特性(例如，稳定性)，或者允许药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)用于诊断和/或实验应用。[0192]在蛋白水平下，任何生物回路组分可以包括一个或多个翻译后修饰(post-translationalmodifications，ptm)。这些ptm可以在蛋白类的生物回路组分的施用之后或在作为编码所述生物回路组分的核酸施用的生物回路组分的翻译时或之后细胞内地发生。[0193]本公开的翻译后修饰(ptm)包括但不限于：乙酰化、磷酸化、泛素化、羧化、脱酰胺化、脱氨基化、脱乙酰化、二羟基化、脱磷酸化、甲酰化、γ-羧基谷氨酸化、谷胱甘肽化、糖化、羟基化、甲基化、硝化、sumo化(sumoylation)、n-或o-转谷氨酰胺化、糖基化和法尼基化(farnesylation)。[0194]效应器模块(包括其sre和有效负载)可以独立地具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个相同或不同的ptm。[0195]可以将效应器模块可以设计成包括蛋白质家族的一个或多个结构性或功能性结构域、重复体或基序。这些结构域、重复体和基序按蛋白质家族分类；并且在embl-ebi数据库(位于http://www.ebi.ac.uk/)中给出了代表性家族。[0196]在一些实施方案中，工程化为本公开的组合物的结构以干扰抗原加工和肽负载(例如，糖基化和聚乙二醇化)的蛋白质修饰也可以用于本公开。还可以将本公开的组合物工程化成包括非经典氨基酸侧链，以设计较少免疫原性的组合物。国际专利公开号wo2005051975(其内容通过引用整体并入本文)中讨论的、用于降低免疫原性的方法中的任一种均可以用于本公开。[0197]sre可以是但不限于：肽、肽复合物、肽-蛋白复合物、蛋白质、融合蛋白、蛋白复合物、蛋白-蛋白复合物。sre可以包括源自任何天然或突变蛋白、或抗体的一个或多个区域。在这方面，当对刺激进行应答时，sre是可以调节细胞内定位、分子内激活、和/或有效负载降解的元件。[0198]在一些实施方案中，本公开的效应器模块可以包括促进效应器模块的表达和调控的额外特征，例如一个或多个信号序列(signalsequences，ss)、一个或多个切割和/或加工位点、一个或多个靶向和/或穿透肽、一个或多个标签、和/或一个或多个接头。额外地，本公开的效应器模块还可以包括其他调控性部分，例如诱导型启动子、增强子序列、微小rna位点、和/或微小rna靶向位点。每个方面或调节形式都可以为效应器模块或生物回路带来不同的调节特征。例如，sre可以代表去稳定结构域，而蛋白有效负载中的突变可以改变其切割位点或二聚化特性或半衰期，并且包含一个或多个微小rna或微小rna结合位点可以赋予细胞脱靶或转运特征。因此，本公开涉及在其有效性方面(tenability)是多因素的生物回路。可以将这类生物回路工程化成含有一个、两个、三个、四个或更多个调节特征。[0199]在一些实施方案中，本公开的效应器模块可以包括用于调节表达的一个或多个降解决定子(degron)。如本文所使用的，“降解决定子”是指蛋白质内足以由蛋白水解系统识别和降解的最小序列。降解决定子的一个重要特性是它们是可转运的，也就是说，将降解决定子附加至序列会使序列退化。在一些实施方案中，可以将降解决定子附加至去稳定结构域、有效负载、或两者。将降解决定子合并至本公开的效应器模块中赋予效应器模块额外的蛋白不稳定性，并且可以用以使基础表达最小化。在一些实施方案中，降解决定子可以是n-末端降解决定子、磷化降解决定子、热诱导性降解决定子、光敏性降解决定子、氧依赖性降解决定子。作为非限制性实施例，降解决定子可以是如takeuchi等人(takeuchijetal.(2008).biochemj.2008marl；410(2):401-7；其内容通过引用整体并入本文)描述的鸟氨酸脱羧酶降解决定子。可以用于本公开的降解决定子的其他实施例包括在国际专利公开号wo2017004022、wo2016210343和wo2011062962(每个国际专利公开的内容以其整体通过引用并入)中描述的降解决定子。[0200]免疫治疗剂[0201]在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是在生物体中诱导免疫应答的免疫治疗剂。免疫治疗剂可以是共刺激分子，例如cd40l及其片段和变体。在一个实施方案中，免疫治疗剂在细胞或受试者中诱导抗癌免疫应答。[0202]在一些实施方案中，本公开的有效负载可以包括全部人cd40lwt(seqidno.6；uniprotid:p29965)或人cd40lwt的部分。如本文所使用的，术语“cd40lwt”是指人野生型cd40l蛋白序列，其被定义为seqidno.6、保藏号为p29965，具有以下氨基酸：mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhrrldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdimlnkeetkkensfemqkgdqnpqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslclkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl。[0203]细胞因子和共刺激分子[0204]在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是细胞因子及其片段、变体、类似物和衍生物，包括但不限于：白介素、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)、干扰素(interferons，ifn)、tgfβ和趋化因子。本领域理解的是，用于相同基因或蛋白质的某些基因和/或蛋白质命名法可以包括或不包括标点符号(例如，破折号“‑”)或符号(例如，希腊字母)。无论在本文中包括还是不包括这些标点符号或符号，如本领域技术人员所理解的那样，并不意味着改变其含义。例如，cd40l、cd40l和cd40lg指的是相同的蛋白质。[0205]在一些实施方案中，可以利用本公开的细胞因子以改善用于免疫疗法的免疫细胞(例如，cd8 tem)、自然杀伤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(til)细胞的扩增、存活、持久性和效力。在其他实施方案中，采用用两种或更多种dd调控的细胞因子工程化的t细胞以提供对t细胞激活和肿瘤微环境重塑的动力学控制。一方面，本公开提供了生物回路和组合物以使与细胞因子疗法相关的毒性最小化。尽管在减轻肿瘤负担方面取得了成功，但全身细胞因子疗法通常导致严重的剂量限制副作用的发展。两个因素导致观察到的毒性：(a)多效性(pleiotropism)，其中细胞因子影响不同的细胞类型，且有时会根据情况对相同细胞产生相反的影响；(b)细胞因子具有较短的血清半衰期，因此需要以高剂量施用以达到治疗效果，这加剧了多效性效应(pleiotropiceffect)。一方面，可以采用本公开的细胞因子以在出现不良反应的情况下调整细胞因子表达。在一些实施方案中，可以将本公开的细胞因子设计成具有延长的寿命或增强的特异性以使毒性最小化。[0206]在一些实施方案中，免疫治疗剂可以是cd40l(也称为cd154和tnfsf5)。cd40l属于tnf超家族，并且主要在t细胞上表达。cd40l结合至在多种免疫细胞上表达的cd40，并且根据细胞类型启动一系列细胞应答。cd40l也可以结合至α5β1整联蛋白和αiibβ3整联蛋白。在一些实施方案中，可以将本公开的cd40l工程化成仅结合至其结合配偶体的一种(例如，cd40)结合。在一些方面，本文所述的cd40l可能能够与其所有同源结合配偶体结合。[0207]cd40l可以与在但不限于抗原呈递细胞(apc)、b细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、中性粒细胞、树突细胞、内皮细胞和αsmc(平滑肌细胞)中表达的cd40结合。cd40l与树突细胞上表达的cd40的结合可促进树突细胞(dc)的授权。dc可以通过抗原特异性t辅助细胞转化为功能状态，以便激活细胞毒性cd8 t细胞，这一过程被称为dc的授权。如共刺激和mhc分子的表面表达；促炎细胞因子产生(例如，il12和tnf)以及表位扩散所证明的那样，dc上的cd40的接合引起dc刺激。[0208]在一些实施方案中，可以采用由本文所描述的生物回路系统调控的cd40l来用于实体的、免疫原性的肿瘤的疗法。cd40l可以通过原位激活适应性和先天性免疫应答来改善实体瘤靶向的t细胞在免疫原性肿瘤中的功效。由于内源性cd40l在t细胞中的表达是瞬时的，因此本文所描述的调控性cd40l类的生物回路系统可能是合乎需要的。此外，肿瘤微环境富含可以切割由t细胞表达的内源性cd40l的脱落酶(sheddase)。外源性表达的组成型cd40l表达(constitutivecd40lexpression)可能引起肝毒性和过度的b细胞增殖，从而导致淋巴瘤(schmitzetal(2006)hepatology44(2):430-9,vonderheideetal.(2007)jclinoncol.l；25(7):876-83,saccoetal(2000)cancergenether.；7(10):1299-306)；其中每一个的内容通过引用整体并入)。组成型(不受调控的)表达可能导致crs、血栓栓塞综合征(thromboembolicsyndromes)、自身免疫反应、由于超免疫刺激和肿瘤血管生成引起的aicd，从而产生对本公开的生物回路的需要。[0209]在一些实施方案中，免疫治疗剂可以是cd40l分子的多聚体，例如但不限于：二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、九聚体(septamer)或七聚体(heptamer)。在一个实施方案中，cd40l可以形成三聚体。cd40l的多聚化可以经由cd40l/cd40轴增强信号传递。三聚体cd40l与cd40的结合也可以引发cd40聚集和traf激活，最终导致nf-κb激活。[0210]本文所描述的cd40l可能对蛋白酶和脱落酶具有抗性，例如在肿瘤微环境中发现的那些蛋白酶和脱落酶，例如adam10或adam17。adam17在肿瘤微环境中增强的活性已经与经由cd40/cd40l轴的减弱的信号传递相关联(参见lowe和corvaia(2016),intjcancerclinres,3:058；其内容通过引用整体并入)。[0211]cd40l参与树突细胞抗原呈递；il12的产生、以及cd8 t细胞免疫的生成。curren等人描述的使用cd40l增强cars的抗肿瘤功效的方法中的任一种可以用于本公开(curren等人，molther.2015apr；23(4)：769-778；其内容通过引用整体并入)。在一个实施方案中，激动性cd40抗体可以用于本公开。cd40单克隆抗体在不存在致残毒性的情况下已显示出临床活性。[0212]在一个实施方案中，cd40l免疫治疗剂可以源自uniprotid:p29965(在本文中也称为“wt”)。本公开的有效负载可以是cd40l的区域或部分。cd40l的区域的非限制性实施例包括但不限于uniprotid:p29965的氨基酸113-261，其中细胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域的部分已经从uniprotid:p29965中移除，保留细胞外结构域的部分和完整的受体结合结构域。在一个实施方案中，有效负载可以是不包括cd40l的细胞质尾区的uniprotid:p29965的氨基酸14-261，从而可能潜在地减少内化(internalization)。一方面，有效负载可以是具有氨基酸s110-g116缺失的uniprotid:p29965的氨基酸14-261，这使cd40l对蛋白水解酶的切割具有抗性。[0213]在一些实施方案中，可以在cd40l有效负载内对突变进行工程化，使得该cd40l有效负载不结合至由本文所描述的细胞内源表达的cd40l、或以降低的亲和力结合至由本文所描述的细胞内源表达的cd40l。cd40l是一种在细胞表面上形成三聚体的ii型跨膜蛋白。在一些实施方案中，三聚化通过seqidno.6的氨基酸残基47-261的相互作用发生。在一些实施方案中，seqidno.6的47-261内的残基可以在cd40l有效负载中发生突变以阻止三聚化(本文称为“三聚化突变体”)。在一些实施方案中，seqidno.6的116-261内的残基可能发生突变。在某些方面，突变可以允许选择性三聚化，使得cd40l三聚化突变体可能能够结合至另一个cd40l三聚化突变体蛋白，但不能结合至缺乏突变的cd40l蛋白。如由cd40l三聚体的晶体结构所确定的，三聚化突变位点可以是cd40l蛋白内参与三聚化的位点。cd40l内可以突变的位置包括但不限于seqidno.6的位置125、170、172、224、226和/或227处的氨基酸。在一些实施方案中，阻止其与内源性cd40l三聚化的cd40l有效负载的突变可以包括但不限于y170g、y172g、h224g、g226f、g226h、g226w、和/或g227f。[0214]存在于肿瘤微环境中的脱落酶(例如，adam10/17)可以切割cd40l，从而阻止cd40l成功地激活cd40。cd40l的序列的分析揭示了adam10/17蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，可以将cd40l的氨基酸1-13的缺失工程化以减少内化。也可以将cd40l的氨基酸110-116的缺失设计成移除adam10/17位点。也可以采用cd40l的氨基酸位置113处的甲硫氨酸残基的缺失或突变，以减少adam10/17酶的切割。在一个实施方案中，人cd40l蛋白的区域或部分可以由鼠cd40l蛋白序列替代以生成对adam10/17的切割具有抗性的cd40l蛋白。如美国专利公开us20180085451a1、和/或美国专利us7,495,090b2(这些专利中的每一个的内容通过引用整体并入)中所描述的旨在减少其脱落的cd40l序列中的任一种均可以用于本文所描述的效应器模块和生物回路。cd40l可以使用跨膜结构域固定(tethered)至膜上。在一个实施方案中，cd40l可以使用cd8衍生结构域(例如但不限于cd8跨膜结构域、cd8铰链结构域、和/或cd8细胞质尾区)固定至膜上。[0215]在一些实施方案中，有效负载可以是但不限于cd40l(seqidno.5-6)及其编码序列(即，分别为seqidno.11-12)。[0216]嵌合抗原受体(car)[0217]在一些实施方案中，本公开的生物回路可以包括：当将其转导至免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)中时，嵌合抗原受体(car)可以针对靶标(例如，肿瘤细胞)重新引导免疫细胞，该靶标表达由car的细胞外靶向部分识别的分子。[0218]如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体(car)”是指模拟t细胞表面上的tcr的合成受体。一般来说，car由细胞外靶向结构域、跨膜结构域/区域、和细胞内信号传递/激活结构域组成。在标准car受体中，将以下成分线性地构建为单个融合蛋白：细胞外靶向结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传递/激活结构域。细胞外区包含识别特异性肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子的靶向结构域/部分(例如，scfv)。细胞内区域可以含有tcr复合物的信号传递结构域(signalingdomain)(例如，cd3ζ的信号区域)、和/或一个或多个共刺激信号传递结构域(例如，来自cd28、4-1bb(cd137)和ox-40(cd134)的那些信号传递结构域)。例如，“第一代car”仅具有cd3ζ信号传递结构域。为了增加t细胞持久性和增殖，添加共刺激细胞内结构域，从而产生具有cd3ζ信号结构域加上一个共刺激信号传递结构域的第二代car、以及具有cd3ζ信号结构域加上两个或更多个共刺激信号传递结构域的第三代car。当由t细胞表达时，car赋予t细胞由car的细胞外靶向部分决定的抗原特异性。最近，还需要添加一个或多个元件(例如，归巢基因和自杀基因)以开发更有效且更安全的car架构，即所谓的第四代car。[0219]在一些实施方案中，效应器模块的免疫治疗剂是嵌合抗原受体(car)。嵌合抗原可以包括：细胞外靶向部分；跨膜结构域；细胞内信号传递结构域；以及任选地，一个或多个共刺激结构域。[0220]在一些实施方案中，细胞外靶向结构域通过铰链(hinge)(也称为空间结构域或间隔子)和跨膜区域接合至细胞内信号传递结构域。铰链将细胞外靶向结构域连接至跨膜结构域，该跨膜结构域穿过细胞膜并连接至细胞内信号传递结构域。由于靶向部分结合的靶蛋白的大小、以及靶向结构域本身的大小和亲和力，可能需要改变铰链，以优化car表达细胞对癌细胞的效力。在靶向部分的识别以及结合至靶细胞后，细胞内信号传递结构域引起针对cart细胞的激活信号，该激活信号由来自一个或多个细胞内共刺激结构域的“第二信号”进一步放大。一旦激活cart细胞，就可以破坏靶细胞。[0221]在一些实施方案中，本公开的car可以分成两部分，每一个部分连接至二聚化结构域，使得触发二聚化的输入促进完整功能性受体的组装。wu和lim最近报道了一种分裂car，其中将细胞外cd19结合结构域和细胞内信号传递元件分离并连接至fkbp结构域和frb*(fkbp-雷帕霉素(rapamycin)结合的t2089l突变体)结构域，该fkbp结构域和frb*结构域在存在雷帕霉素类似物ap21967的情况下发生异源二聚化(heterodimerize)。分裂受体在存在ap21967的情况下、并且与特异性抗原结合一起被组装，以激活t细胞(wu等人，science,2015,625(6258):aab4077)。[0222]在一些实施方案中，可以将本公开的car设计为诱导型car。sakemura等人最近报道了将tet-on诱导型系统合并至cd19car构建体。cd19car仅在存在多西环素(doxycycline，dox)的情况下被激活。sakemura报道了与传统的cd19cart细胞相比，tet-cd19cart细胞在存在dox的情况下对cd19 细胞系具有同等的细胞毒性，并且在cd19刺激后具有同等的细胞因子产生和增殖(sakemura等，sakemura等人,cancerimmuno.res.,2016,jun21,epubaheadofprint)。在一个实施例中，生物回路可以包括tet-car。在另一个实施例中，tet-car可以是本文所描述的sre(例如，ca2dds)的控制下的ca2效应器模块的有效负载。双系统为打开和关闭转导t细胞中的car表达提供了更大的灵活性。[0223]根据本公开，car可以是第一代car、或第二代car、或第三代car、或第四代car。在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是由细胞外结构域、铰链和跨膜结构域、以及细胞内信号传递区域组成的全car构建体。在其他实施方案中，包括细胞外靶向部分、铰链区域、跨膜结构域、细胞内信号传递结构域、一个或多个共刺激结构域、以及改善car架构和功能的其他额外元件的全car构建体的组分包括但不限于：前导序列、归巢元件和安全开关，或者这些组分的组合可以包括在生物回路中。[0224]细胞外靶向结构域/部分[0225]根据本公开，car的细胞外靶向部分可以以高特异性和亲和力识别并结合至给定靶分子(例如，肿瘤细胞上的新抗原)的任何试剂。靶向部分可以是：特异性结合至肿瘤细胞上的靶分子的抗体及其变体；或者，基于其结合至肿瘤细胞上的靶分子的能力而选自随机序列池的肽适体；或者，可以结合至肿瘤细胞上的靶分子的变体及其片段；或者，来自天然t细胞受体(tcr)的抗原识别结构域，例如识别hiv感染细胞的cd4细胞外结构域；或者，外来识别成分，例如引起携带细胞因子受体的靶细胞的识别的相关细胞因子；或者，受体的天然配体。[0226]在一些实施方案中，car的靶向结构域可以是ignar、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、f(ab)'3片段、fv、单个链可变片段(singlechainvariablefragment，scfv)、bis-scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定化fv蛋白(disulfidestabilizedfvprotein，dsfv)、单抗体、纳米抗体、或源自特异性识别靶分子(例如，肿瘤特异性抗原(tumorspecificantigen，tsa))的抗体的抗原结合区域。在一个实施方案中，靶向部分为scfv。当scfv结构域在cart细胞表面上表达并随后结合至癌细胞上的靶蛋白结合时，scfv结构域能够将cart细胞维持在癌细胞附近并触发t细胞的激活。可以使用常规重组dna技术生成scfv，并且将在本公开中进行讨论。[0227]在一个实施方案中，car的靶向部分可以识别cd19。cd19是众所周知的b细胞表面分子，它在b细胞受体激活后增强b细胞抗原受体诱导的信号传递和b细胞群的扩增。cd19在正常的b细胞和赘生性(neoplastic)b细胞中广泛地表达。源自b细胞的恶性肿瘤(例如，慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病和许多非霍奇金淋巴瘤)经常保留cd19表达。这种对单个细胞谱系的近乎普遍的表达和特异性使cd19成为用于免疫疗法的有吸引力的靶标。人cd19有14个外显子，其中外显子1-4编码cd19的细胞外部分，外显子5编码cd19的跨膜部分，并且外显子6-14编码细胞质尾区。在一个实施方案中，靶向部分可包括源自fmc63抗体的可变区域的scfvs。fmc63是与b谱系细胞上的cd19抗原反应的、对cd19抗原特异性的igg2a小鼠单克隆抗体克隆体。由fmc63抗体识别的cd19的表位位于外显子2中(sotillo等人(2015)cancerdiscov；5(12):1282-95；其内容通过引用整体并入)。在一些实施方案中，car的靶向部分可以源自其他cd19单克隆抗体克隆体(包括但不限于4g7、sj25c1、cvid3/429、cvid3/155、hib19和j3-119)的可变区域。[0228]在一方面，细胞外靶向部分可以是源自抗体的scfv。在一方面，scfv可以特异性地结合至cd19抗原。[0229]细胞内信号传递结构域[0230]car融合多肽的细胞内结构域在结合至其靶分子后，将信号传输至效应器免疫细胞，从而激活效应器免疫细胞的至少一种正常效应器功能，该效应器功能包括溶细胞活性(例如，细胞因子分泌)或辅助细胞活性。因此，细胞内结构域包括t细胞受体(tcr)的“细胞内信号传递结构域”。[0231]在一些方面，可以采用全部细胞内信号传递结构域。在其他方面，可以使用细胞内信号传递结构域的截短部分代替完整链，只要该截短部分转导效应器功能信号即可。[0232]在一些实施方案中，本公开的细胞内信号传递结构域可以含有称为免疫受体酪氨酸类的激活基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，itam)的信号传递基序。含有细胞质信号传递序列的itam的实施例包括源自tcrcd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些序列。在一个实施例中，细胞内信号传递结构域是cd3ζ(cd3ζ)信号传递结构域。[0233]在一些实施方案中，本公开的细胞内区域还包括向效应器免疫细胞提供额外的信号的一个或多个共刺激信号传递结构域。这些共刺激信号传递结构域与信号传递结构域组合可以进一步改善car工程改造的免疫细胞(例如，cart细胞)的扩增、激活、记忆、持久性和肿瘤根除效率。在一些情况下，共刺激信号传递区域含有一种或多种细胞内信号传递和/或共刺激分子的1、2、3或4个细胞质结构域。共刺激信号传递结构域可以是共刺激分子的细胞内/细胞质结构域，包括但不限于：cd2、cd7、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd30、cd40、icos(cd278)、gitr(glucocorticoid-inducedtumornecrosisfactorreceptor，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体)、lfa-1(lymphocytefunction-associatedantigen-1，淋巴细胞功能关联抗原-1)、light、nkg2c、b7-h3。在一个实施例中，共刺激信号传递结构域源自cd28的细胞质结构域。在另一个实施例中，共刺激信号传递结构域源自4-1bb(cd137)的细胞质结构域。在另一个实施例中，共刺激信号传递结构域可以是如美国专利号9,175,308(其内容通过引用整体并入本文)中教导的gitr的细胞内结构域。[0234]跨膜结构域和铰链区域[0235]在一些实施方案中，本公开的car可以包括跨膜结构域。如本文所使用的，术语“跨膜结构域(transmembrancedomain，tm)”泛指跨越质膜的长度为约15个残基的氨基酸序列。更优选地，跨膜结构域包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸残基并且跨越质膜。在一些实施方案中，本公开的跨膜结构域可以源自天然来源或源自合成来源。car的跨膜结构域可以源自任何天然的膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜区域可以源自以下(即，至少包括以下的跨膜区域)：t细胞受体的α、β或ζ链；cd3ε、cd4、cd5、cd8、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152或cd154。在一些实施方案中，本公开的跨膜结构域可选自由以下组成的组：cd8α跨膜结构域、cd4跨膜结构域、cd28跨膜结构域、ctla-4跨膜结构域、pd-1跨膜结构域、以及人igg4fc区域。[0236]替代地，本公开的跨膜结构域可以是合成的。在一些方面，合成序列可主要包括疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。[0237]在一些实施方案中，本公开的跨膜结构域可以选自由以下组成的组：cd8α跨膜结构域、cd4跨膜结构域、cd28跨膜结构域、ctla-4跨膜结构域、pd-1跨膜结构域、以及人igg4fc区域。作为非限制性实施例，跨膜结构域可以是：包括国际专利公开号wo2014/100385的seqidnos.1-5的氨基酸序列的ctla-4跨膜结构域；以及，包括国际专利公开号wo2014100385的seqidnos.6-8的氨基酸序列的pd-1跨膜结构域，所述国际专利公开中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0238]在一些实施方案中，本公开的car可以包括任选的铰链区域(也称为间隔子)。铰链序列是促进细胞外靶向结构域灵活性的一段短的氨基酸序列，其将靶标结合结构域从效应器细胞表面移开，以实现适当的细胞/细胞接触、靶标结合和效应器细胞激活(patel等人,genetherapy,1999；6:412-419)。铰链序列可以定位在靶向部分与跨膜结构域之间。[0239]在一些实施方案中，本公开的car可以包括在car的任何结构域之间的一个或多个接头。该接头可以是在1-30个氨基酸长之间。[0240]在一些实施方案中，本发明的包括靶向部分、跨膜结构域和细胞内信号传递结构域的组分可以在单个融合多肽中构建。[0241]在一个实施方案中，car构建体包括cd19scfv(例如，cat13.1e10或fmc63)、cd8α间隔子或跨膜结构域、以及4-1bb和cd3ζ内结构域。与具有fmc63的构建体相比，这些具有cat13.1e10的构建体在体外刺激后可以具有增加的增殖、增加的对cd19 靶标的细胞毒性、以及增加的效应器与靶标的相互作用。[0242]在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是本文所描述的共刺激分子和/或细胞内结构域中的任一种。在一些实施方案中，在本公开中可以使用一种或多种共刺激分子，每种分子在不同sre的控制下。sre调控的共刺激分子也可以与第一代car、第二代car、第三代car、第四代car或本文所描述的任何其他car设计来结合表达。[0243]串联型car(tandemcar，tancar)[0244]在一些实施方案中，本公开的car可以是能够靶向两种、三种、四种或更多种肿瘤特异性抗原的串联型嵌合抗原受体(tancar)。在一些方面，car是双特异性tancar，其包括识别肿瘤细胞上两种不同tsa的两个靶向结构域。双特异性car可以进一步定义为包括细胞外区域，该细胞外区域包括对第一肿瘤抗原特异的靶向结构域(例如，抗原识别结构域)和对第二肿瘤抗原特异的靶向结构域(例如，抗原识别结构域)。在其他方面，car是以串联布置配置的三个或更多个靶向结构域的多特异性tancar。tancar中靶向结构域之间的空间的长度可以在约5与约30个氨基酸之间，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个氨基酸。[0245]分裂型car[0246]在一些实施方案中，可以将本公开的包括靶向部分、跨膜结构域和细胞内信号传递结构域的组分分裂成两个或更多个部分，使得它依赖于促进完整功能性受体组装的多个输入。在一个实施方案中，可以构建分裂合成的car系统，其中激活的car受体的组装依赖于配体与sre(例如，小分子)以及特异性抗原与靶向部分的结合。作为非限制性实施例，分裂型car由两部分组成，这两部分以小分子依赖的方式组装；受体的一个部分的特性是细胞外抗原结合结构域(例如，scfv)，而另一个部分具有细胞内信号传递结构域(例如，cd3ζ细胞内结构域)。[0247]在其他方面，可以进一步修饰car系统的分裂部分以增加信号。在一个实施例中，细胞质片段的第二部分可以通过将跨膜结构域(例如，cd8α跨膜结构域)合并至构建体来锚定至质膜。还可以将额外的细胞外结构域添加至car系统的第二部分，例如介导同源二聚化的细胞外结构域。这些修饰可以增加受体输出活性(即，t细胞激活)。[0248]在一些方面，分裂型car系统的两个部分含有在异源二聚化小分子的结合时有条件地相互作用的异源二聚化结构域。同样地，受体成分在存在小分子的情况下组装，以形成完整系统，然后该系统可以由抗原接合(engagement)激活。可以将任何已知的异源二聚化成分都合并至分裂型car系统中。也可以使用其他小分子依赖性异源二聚化结构域，其包括但不限于：赤霉素诱导的二聚化系统(gibberellin-induceddimerizationsysytem，gid1-gai)、甲氧苄啶-slf诱导的ecdhfr和fkbp二聚化(czlapinski等人，jamchemsoc.,2008,130(40)：13186-13187)和aba(abscisicacid，脱落酸)诱导的pp2c和pyl结构域的二聚化(cutler等人，annurevplantbiol.2010,61:651-679)。使用分裂型car系统的诱导组装(例如，配体依赖性二聚化)和降解(例如，去稳定结构域诱导的car降解)的双重调控可以提供更大的灵活性来控制经car修饰的t细胞的活性。[0249]可切换型car[0250]在一些实施方案中，本公开的car可以是可切换型car。juillerat等人(juilerat等人，sci.rep.,2016,6:18950；其内容通过引用整体并入本文)最近报道了可控型cars，其可以对刺激(例如，小分子)进行应答而瞬时启动。在这个car设计中，系统直接集成在将car中的scfv结构域与细胞膜结构域分开的铰链结构域中。这种系统可以分裂或组合受体复合物的不同链内的car的不同关键功能(例如，激活和共刺激)，从而模仿tcr天然架构的复杂性。该集成系统可以在由不存在/存在刺激来控制的开/关状态之间切换scfv和抗原相互作用。[0251]可逆型car[0252]在其他实施方案中，本公开的car可以是可逆型car系统。在这个car架构中，将lid结构域(ligand-induceddegradation，配体诱导的降解)合并至car系统中。通过添加lid结构域的配体，可以暂时下调car。lid和dd介导的调控的组合提供了对持续激活的cart细胞的调节性控制，从而降低了car介导的组织毒性。[0253]条件激活型car[0254]在一些实施方案中，本文所描述的生物回路可以包括条件激活型嵌合抗原受体，其仅在激活的免疫细胞中表达。car的表达可以耦合至激活条件控制区域，该激活条件控制区域是指在其控制下诱导序列(例如，car)的转录和/或表达的一种或多种核酸序列。这种条件激活型控制区域可以是在效应器免疫细胞的激活期间上调的基因的启动子，例如il2启动子或nfat结合位点。在一些实施方案中，免疫细胞的激活可以通过结构性表达的car来实现(国际公开号wo2016126608；其内容通过引用整体并入本文)。[0255]多核苷酸[0256]包括效应器模块、效应器模块的sre和有效负载的生物回路组分可以是核酸类的。术语“核酸”在其最广泛的意义上包括包含核苷酸聚合物(例如，连接的核苷)的任何化合物和/或物质。这些聚合物通常被称为多核苷酸。本公开的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于：核糖核酸(ribonucleicacids，rna)、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacids，dna)、苏糖核酸(threosenucleicacids，tna)、乙二醇核酸(glycolnucleicacids，gna)、肽核酸(peptidenucleicacids，pna)、锁核酸(lockednucleicacids，lna，包括具有β-d-核糖构型的lna、具有α-l-核糖构型的α-lna(lna的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2'-氨基-lna、和具有2'-氨基官能化的2'-氨基-α-lna)或其杂交体。[0257]在一些实施方案中，核酸分子是信使rna(messengerrna，mrna)。如本文所使用的，术语“信使rna”(mrna)是指编码目的多肽并且能够被体外、体内、原位或离体翻译以产生所编码的目的多肽的任何多核苷酸。本文所描述的多核苷酸可以是mrna或任何核酸分子，并且可以进行化学修饰或可以不进行化学修饰。[0258]传统上，mrna分子的基本成分至少包括编码区域、5'utr、3'utr、5'帽和poly-a尾区。建立在这种野生型模块结构上，本公开通过提供有效负载构建体而扩展了传统mrna分子的功能范围，该有效负载构建体维持模块化组织，但其包括一个或多个结构性和/或化学性修饰或改变，这些修饰或改变赋予了多核苷酸有用的特性，例如功能的可维持性。如本文所施用的，“结构性”特征或修饰是在多核苷酸中插入、删除、复制、倒置或随机化两个或更多个连接的核苷，而核苷本身没有显著化学修饰的特征或修饰。因为化学键将必然会被破坏和重新形成以影响结构性修饰，所以结构性修饰具有化学性质，因此是化学修饰。然而，结构修饰将导致不同的核苷酸序列。例如，可以将多核苷酸“atcg”化学修饰为“at-5mec-g”。相同的多核苷酸可以在结构上从“atcg”修饰为“atcccg”。此处，已经插入了二核苷酸“cc”，从而导致对多核苷酸的结构修饰。[0259]在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可以保持(harbor)在翻译起始中起作用的5'utr序列。5'utr序列可以包括一些特征，例如通常已知参与核糖体启动基因翻译的过程的kozak序列，kozak序列具有一致的xccr(a/g)ccaug，其中r是起始密码子(startcodon，aug)上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)的三个碱基，并且x是任何核苷酸。在一个实施方案中，kozak序列是accgcc。通过工程化通常在靶细胞或组织的大量表达的基因中发现的特征，可以增强本公开的多核苷酸的稳定性和蛋白质产生。[0260]进一步地，提供了可以含有内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,ires)的多核苷酸，该内部核糖体进入位点在多核苷酸中不存在5'帽结构的情况下在启动蛋白合成中起重要作用。ires可以充当唯一的核糖体结合位点或可以用作多个结合位点的一个。本公开的、含有多于一个功能性核糖体结合位点的多核苷酸可以编码由核糖体独立翻译的数种肽或多肽，从而产生双顺反子的和/或多顺反子的核酸分子。[0261]在一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以编码具有与参考多肽序列一定的同一性的变体多肽。如本文所使用的，“参考多肽序列”是指起始多肽序列。参考序列可以是野生型序列、或在设计另一序列中进行参考的任何序列。[0262]如本领域已知的，术语“同一性”是指如通过比较序列所确定的两个或更多个序列之间的关系。在本领域中，同一性也意味着如由两个或更多个残基(氨基酸或核酸)串(strings)之间的匹配数所决定的、序列之间序列关联性的程度。同一性用由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)解决的间隙比对(如果有)测量两个或更多个序列之间的相同匹配的百分比。可以通过已知方法容易地计算相关序列的同一性。此类方法包括但不限于在以下中描述的那些方法：computationalmolecularbiology,lesk,a.m.,ed.,oxforduniversitypress,newyork,1988；biocomputing:informaticsandgenomeprojects,smith,d.w.,ed.,academicpress,newyork,1993；computeranalysisofsequencedata,part1,griffin,a.m.,andgriffin,h.g.,eds.,humanapress,newjersey,1994；sequenceanalysisinmolecularbiology,vonheinje,g.,academicpress,1987；sequenceanalysisprimer,gribskov,m.anddevereux,j.,eds.,m.stocktonpress,newyork,1991；以及，canlloetah,siamj.appliedmath.48,1073(1988)。[0263]在一些实施方案中，变体序列可以具有与参考序列相同或相似的活性。替代地，变体可以具有相对于参考序列的改变的活性(例如，增加的或减少的)。通常，如通过本文所描述的和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的，本公开的特定多核苷酸或多肽的变体将具有与该特定参考多核苷酸或多肽至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性。此类用于比对的工具包括blast套件的那些工具(stephenf.altschul,thomasl.madden,alejandroa.schaffer,jinghuizhang,zhengzhang,webbmiller,anddavidj.lipman(1997),"gappedblastandpsi-blast:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",nucleicacidsres.25:3389-3402)。[0264]对多核苷酸的化学修饰[0265]根据本公开，术语“修饰”或“经修饰”(视情况而定)多核苷酸是指相对于a、g、u(dna中的t)或c核苷酸的修饰。[0266]本公开的多核苷酸的修饰可以在包含多核苷酸的核苷的核苷碱基和/或糖部分上。在一些实施方案中，在经修饰核酸中或在一种或多种单独的核苷或核苷酸中包括多个修饰。例如，对核苷的修饰可以包括对核碱基(nucleobase)和糖的一种或多种修饰。对本公开的多核苷酸的修饰可以包括在例如国际公开wo2013052523(其内容通过引用整体并入本文)中教导的那些修饰中的任一种。[0267]如本文所描述的，“核苷”被定义为含有与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物组合的糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物(在本文中也称为“核碱基”)。如本文所描述的，“核苷酸”被定义为包括磷酸基团的核苷。[0268]可以合并至多核苷酸中的经修饰核苷酸可以在核苷间连接(例如，磷酸骨架)上进行修饰。本文中，在多核苷酸骨架的上下文中，短语“磷酸”和“磷酸二酯”可以互换使用。可以通过用不同的取代基替代氧原子中的一个或多个来修饰骨架磷酸基团。进一步地，经修饰核苷和核苷酸可以包括用另一个核苷间连接整体替代未经修饰磷酸部分。经修饰磷酸基团的实施例包括但不限于：硫代磷酸盐(酯)(phosphorothioate)、磷硒酸盐(酯)(phosphoroselenates)、硼烷磷酸盐(酯)(boranophosphates)、硼烷磷酸的酯(boranophosphateesters)、氢膦酸盐(酯)(hydrogenphosphonates)、氨基磷酸盐(酯)(phosphoramidates)、二氨基磷酸盐(酯)(phosphorodiamidates)、膦酸烷基盐(酯)或膦酸芳基盐(酯)(alkylorarylphosphonates)和磷酸三酯(phosphotriesters)。二硫代磷酸盐(酯)(phosphorodithioates)具有均由硫替代的两个非连接氧。磷酸接头也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸盐(酯))、硫(桥连的硫代磷酸盐(酯))和碳(桥连的亚甲基膦酸盐(酯))替代连接的氧来修饰。可以使用在例如国际申请wo2013052523(其内容通过引用整体并入本文)中教导的其他修改。[0269]不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间连接(例如，骨架结构)可以存在于多核苷酸的不同位置处。本领域普通技术人员将理解的是，核苷酸类似物或其他修饰可以位于多核苷酸的任何位置处，使得多核苷酸的功能不会大幅降低。修饰也可以是5'或3'末端修饰。多核苷酸可以含有从约1％至约100％的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即a、g、u或c中的任何一种或多种)或任何介入的百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％以及95％至100％)。[0270]在一些实施方案中，多核苷酸包括经修饰嘧啶或嘌呤。在一些实施方案中，多核苷酸分子中的嘧啶或嘌呤可以用约1％至约100％的经修饰尿嘧啶或经修饰尿苷(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％以及95％至100％的经修饰嘧啶或嘌呤)替代。[0271]在一些实施方案中，多核苷酸可以包含两个或更多个效应器模块组分序列，该序列处于重复一次、两次或多于三次的的模式(例如，ababab或aabbaabbaabb、或abcabcabc、或其变体)中。在这些模式中，每个字母a、b或c代表不同的效应器模块组分。[0272]在又一个实施方案中，多核苷酸可以包含两个或更多个效应器模块组分序列，每个组分具有一个或多个序列。作为非限制性实施例，该序列可以处于在每个区域中重复一次、两次或多于三次的模式(例如，ababab或aabbaabbaabb、或abcabcabc、或其变体)中。作为另一个非限制性实施例，该序列可以处于在整个多核苷酸中重复一次、两次或多于三次的模式(例如，ababab、或aabbaabbaabb、或abcabcabc、或其变体)中。在这些模式中，每个字母a、b或c代表不同的序列或组分。[0273]密码子选择[0274]在一些实施方案中，本公开的多核苷酸的一个或多个密码子可以通过称为密码子选择的过程用编码天然氨基酸序列的其他密码子替代，以调节sre的表达。由于mrna密码子和trna反密码子池倾向于在生物体、细胞类型、亚细胞位置中和时间上变化，因此本文所描述的密码子选择是时空的(spatiotemporal,st)密码子选择。[0275]在本公开的一些实施方案中，某些多核苷酸可以以密码子优化为特征。密码子优化是指以下过程：在维持天然氨基酸序列的情况下，通过用在宿主细胞的基因中最频繁使用的密码子替代天然序列的至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子来修饰核酸序列的过程，以用于增强在宿主细胞中的表达。密码子选用(usage)可以使用密码子适应指数(codonadaptationindex,cai)进行测量，该密码子适应指数测量编码多核苷酸序列与参考基因集的偏差。密码子选用表可以在密码子选用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)中找到，并且cai可以通过embosscai程序(http://emboss.sourceforge.net/)进行计算。密码子优化方法是本领域已知的，并且可用于努力实现数个目标中的一个或多个。这些目标包括：匹配靶向和宿主生物体中的密码子频率，以确保正确的折叠；偏置核苷酸(biasnucleotide)含量，以改变稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运行最小化；定制转录和翻译控制区域；插入或移除蛋白信号传递序列；在编码蛋白中移除/添加翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、移除或改组蛋白结构域；插入或删除限制位点；修改核糖体结合位点和降解位点，以调节翻译率，从而允许蛋白质的各个结构域正确的折叠，或者减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。在一个实施方案中，多核苷酸序列或其部分使用优化算法进行密码子优化。用于每个氨基酸的密码子选择是本领域众所周知的，用于优化在该特定物种中的表达的各种物种表也是如此。[0276]在本公开的一些实施方案中，某些多核苷酸特征可以使密码子优化。例如，用于密码子优化的优选区域可以在编码多肽的区域的上游(5')或下游(3')。这些区域可以在有效负载编码区域或可读框(openreadingframe，orf)的密码子优化之前和/或之后合并至多核苷酸中。[0277]在优化(如果需要)之后，将多核苷酸组分重构并转化至载体中，该载体例如但不限于质粒、病毒、粘粒和人工染色体。[0278]可以将本公开的多核苷酸的终止密码子修饰为包括序列和基序，以改变本公开的sre、有效负载和效应器模块的表达水平。可以合并此类序列以诱导终止密码子连读，其中终止密码子可以指定氨基酸(例如，硒代半胱氨酸(selenocysteine)或吡咯赖氨酸)。在其他情况下，可以完全跳过终止密码子以通过替代的可读框恢复翻译。可以采用终止密码子连读，从而以特定比率(例如，由终止密码子上下文指示的)调节效应器模块的组分的表达。优选的终止密码子基序的实施例包括ugan、uaan和uagn，其中n是c或u。[0279]在许多病毒mrna的翻译期间发生终止的抑制，作为生成具有延长的羧基末端的第二蛋白的手段。在逆转录病毒中，gag和pol基因由单个mrna编码，并且由琥珀终止密码子uag分离。琥珀密码子的翻译抑制允许gagpol前体的合成。翻译抑制由可以识别终止密码子并插入特定氨基酸的抑制器trnas介导。在一些实施方案中，本文所描述的效应器模块可以合并琥珀终止密码子。此类密码子可以在双顺反子的构建体中代替或附加至ires和p2a序列中使用。终止密码子连读可以与p2a组合，以获得下游基因的低水平表达。在一些实施方案中，琥珀终止密码子可以与trna表达或氨酰基trna合成酶组合，以用于进一步控制。[0280]缀合物[0281]由本公开预期的本发明的组合物可以与一种或多种同源分子或异源分子复合、缀合或组合。如本文所使用的，术语“同源分子”是指相对于起始分子在结构或功能中的至少一项上相似的分子，而“异源分子”是相对于起始分子在结构或功能中的至少一项上不同的分子。因此，结构同源物是可能在结构上基本相似的分子。在一些实施方案中，此类同源物可以是同一的。功能同源物是可能在功能上基本相似的分子。在一些实施方案中，此类同源物可以是同一的。[0282]本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)可以包含缀合物。本公开的此类缀合物可以包括天然存在的物质或配体，例如蛋白质(例如，人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)、低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，ldl)、高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein，hdl)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、可溶性支链淀粉(pullulan)、甲壳质(chitin)、壳聚糖、菊粉、环糊精、或透明质酸)；或脂质。缀合物也可以是重组分子或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸、寡核苷酸(例如，适体)。聚氨基酸的实施例可包括聚赖氨酸(polylysine，pll)、聚l-天冬氨酸、聚l-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(l-丙交酯-共聚-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(n-(2-hydroxypropyl)methacrylamidecopolymer，hmpa)、聚乙二醇(polyethyleneglycol，peg)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol，pva)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、n-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实施例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(pll)、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺(pseudopeptide-polyamine)、拟肽聚胺(peptidomimticpolyamine)、树枝状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α螺旋肽。[0283]在一些实施方案中，缀合物还可以包括靶向基团(targetinggroup)。如本文所使用的，术语“靶向基团”是指附着至试剂的、促进该试剂定位至所需区域、组织、细胞、和/或蛋白质的官能团或部分。此类靶向基团可以包括但不限于细胞或组织的靶试剂或基团(例如，凝集素、糖蛋白、脂质、蛋白质、结合至特定细胞类型(例如，肾细胞或其他细胞类型)的抗体)。在一些实施方案中，靶向基团可以包括促甲状腺素、促黑激素(malanotropins)、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白a、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰-半乳糖胺、n-乙酰-氨基葡萄糖、多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素b12、生物素、rgd肽、rgd肽模拟物或适体。[0284]在一些实施方案中，靶向基团可以是蛋白质，例如糖蛋白；或肽，例如具有对共配体特异性亲和力的分子；或抗体，例如结合至特定细胞类型(例如，癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的抗体。靶向基团还可以包括激素和/或激素受体。[0285]在一些实施方案中，靶向基团可以是能够靶向特定受体的任何配体。实施例包括但不限于：叶酸、galnac、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸盐(酯)、适体、整合素受体配体(integrinreceptorligand)、趋化因子受体配体(chemokinereceptorligand)、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、psma、内皮素、gcpii、生长抑素、ldl和hdl配体。在一些实施方案中，靶向基团为适体。此类适体可以是未修饰的或包含本文公开的修饰的任何组合。[0286]在其他实施方案中，本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)可以共价地缀合至细胞穿透多肽。在一些实施方案中，细胞穿透肽还可以包括信号序列。在一些实施方案中，本公开的缀合物可以设计为具有增加的稳定性、增加的细胞转染、和/或改变的生物分布(例如，靶向至特定组织或细胞类型)。[0287]在一些实施方案中，缀合部分可以添加至本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)，使得它们允许附着可检测地标识记以用于清除靶标。此类可检测标识包括但不限于：生物素标识、泛素、荧光分子、人流感血凝素(humaninfluenzahemagglutinin，ha)、c-myc、组氨酸(histidine，his)、flag、谷胱甘肽s-转移酶(glutathiones-transferase，gst)、v5(paramyxovirusofsimianvirus5epitope，猿猴病毒5表位的副粘病毒)、生物素、亲和素、链霉亲和素、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)和异羟基洋地黄毒苷(digoxigenin)。[0288]在一些实施方案中，在疾病和/或病症的治疗中，本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应器模块(包括其sre或有效负载)可以彼此组合或与其他分子组合。[0289]额外的效应器模块特征[0290]本公开的效应器模块还可以包括：信号序列，该信号序列调控目的有效负载的分布；切割和/或加工特征，该切割和/或加工特征促进有效负载从效应器模块构建体的切割；靶向和/或穿透信号，该靶向和/或穿透信号可以调控效应器模块的细胞定位；标签；和/或，一个或多个接头序列，该一个或多个接头序列连接效应器模块的不同组分。[0291]信号序列[0292]除了sre和有效负载区域之外，本公开的效应器模块还可以包括一个或多个额外特征，例如一个或多个信号序列。[0293]信号序列(有时称为信号肽、靶向信号、靶肽、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)将蛋白质(例如，本公开的效应器模块)引导至其指定的细胞和/或细胞外位置。蛋白信号序列在几乎所有分泌蛋白和许多内在膜蛋白的靶向和易位中起核心作用。[0294]信号序列是存在于大多数被指定向特定位置的新合成蛋白质的n-末端处的短(5-30个氨基酸长)肽。信号序列可以由信号识别颗粒(signalrecognitionparticles，srp)识别，并且使用i型和ii型信号肽肽酶进行切割。源自人蛋白的信号序列可以作为效应器模块的调控模块进行合并，以将效应器模块引导至特定的细胞和/或细胞外位置。这些信号序列经过实验验证并且可以进行切割(zhangz.andhenzelw.j.；"signalpeptidepredictionbasedonanalysisofexperimentallyverifiedcleavagesites."；proteinsci.im,13:2819-2824)。[0295]在一些实施方案中，信号序列可以(尽管不是必须)位于效应器模块的n-末端或c-末端处，并且可以(尽管不是必须)从期望的效应器模块切下以产生“成熟”的有效负载。[0296]在一些实施方案中，本文使用的信号序列可以排除信号序列的氨基酸序列的位置1处的甲硫氨酸。这可以称为m1del突变。[0297]除了天然存在(例如，来自分泌蛋白)的信号序列，信号序列可以是从蛋白质的已知信号序列修饰的变体。例如，sleep的美国专利号8,258,102和9,133,265公开了一种经修饰白蛋白信号序列，该白蛋白信号序列具有分泌信号和可以增加蛋白分泌的额外x1-x2-x3-x4-x5-基序；do的美国专利号9,279,007公开了可以增强蛋白表达和分泌的人免疫球蛋白重链结合蛋白(bingdingprotein，bip)的修饰片段的信号序列；leonhartsberger等人的美国专利号8,148,494公开了一种具有可以与重组蛋白融合的切割位点的信号肽；这些专利中的每一个的内容通过引用整体并入。[0298]在一些情况下，分泌的信号序列可以是细胞因子信号序列，例如但不限于，il2信号序列或p40信号序列。[0299]在一些情况下，可以使用将目的有效负载引导至靶细胞的表面膜的信号序列。有效负载在靶细胞表面上的表达可能有助于限制有效负载向非靶向体内环境的扩散，从而潜在地改善有效负载的安全性。此外，有效负载的膜呈现可能允许生理和定性信号传递、以及用于延长半衰期的有效负载的稳定和循环。膜序列可以是目的有效负载的n末端组分的内源性信号序列。任选地，可能需要将该序列交换为不同的信号序列。可以基于信号序列与目的细胞类型的分泌途径的兼容性来选择信号序列，使得有效负载呈现在t细胞的表面上。在一些实施方案中，信号序列可以是ige信号序列、cd8α信号序列(也称为cd8α前导)或il15ra信号序列(也称为il15ra前导)、或m1delcd8a信号序列(也称为m1delcd8前导序列)。[0300]可以在本效应器模块中使用的其他信号序列变体，其可以包括在以下专利中讨论的那些：美国专利申请公开号：2007/0141666；pct专利申请公开号：1993/018181；这些专利申请公开中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0301]信号序列变体的其他实施例可以是以下中讨论的经修饰信号序列：美国专利号8,148,494、8,258,102、9,133,265、9,279,007；以及，美国专利申请公开号20070141666和国际专利申请公开号wo1993018181；这些专利中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0302]在其他实施例中，信号序列可以是来自其他生物体(例如，病毒、酵母和细菌)的异质信号序列，其可以将效应器模块引导至特定的细胞位点，例如细胞核(例如，ep1209450)。其他实施例可以包括：来自木霉属(trichoderma)的天冬氨酸蛋白酶(nsp24)信号序列，其可以增加融合蛋白(例如，酶)的分泌(例如，cervin和kim的美国专利号8,093,016)；细菌脂蛋白信号序列(例如，lau和rioux的pct申请公开号wo199109952)；大肠杆菌(e.coli)肠毒素ii信号肽(例如，kwon等人的美国专利号6,605,697)；大肠杆菌分泌信号序列(例如，malley等人的美国专利公开号us2016090404)；来自甲基营养型酵母(methylotrophicyeast)的脂肪酶信号序列(例如，美国专利号8,975,041)；以及，源自棒状杆菌(coryneformbacteria)的dna酶(dnase)的信号肽(例如，美国专利号4,965,197)；这些专利中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0303]信号序列还可以包括核定位信号(nuclearlocalizationsignals，nls)、核输出信号(nuclearexportsignals，nes)、极化细胞管-囊泡结构定位信号(polarizedcelltubule-vesicularstructurelocalizationsignals，参见例如，美国专利号8,993,742；corn等人,nucleicacidsres.2003,31(1):393-396；二者中的每一个的内容通过引用整体并入本文)、细胞外定位信号、亚细胞定位的信号(例如，溶酶体、内质网、高尔基体、线粒体、质膜和过氧化物酶体等)(参见例如，美国专利号7,396,811；和negi等人，database,2015,1-7；二者中的每一个的全部内容通过引用整体并入本文)。[0304]切割位点[0305]在一些实施方案中，效应器模块包括切割和/或加工特征。[0306]本公开的效应器模块可以包括至少一个蛋白切割信号/位点。蛋白切割信号/位点可以位于n-末端、c-末端处，在n-末端与c-末端之间的任何空间处，例如但不限于，n-末端与c-末端之间的中途、在n-末端与中途点之间、在中途点与c-末端之间、以及它们的组合。[0307]效应器模块可以包括任何蛋白酶的一个或多个切割信号/位点。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、肽链内切酶、二肽酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。在一些方面，切割位点可以是弗林蛋白酶(furin)、猕猴桃蛋白酶(actinidain)、钙蛋白酶(calpain)-1、羧肽酶(carboxypeptidase)a、羧肽酶p、羧肽酶y、caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，cysteinylaspartatespecificproteinase)-1、caspase-2、caspase-3、caspase-4、caspase-5、caspase-6、caspase-7、caspase-8、caspase-9、caspase-10、组织蛋白酶(cathepsin)b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶g、组织蛋白酶h、组织蛋白酶k、组织蛋白酶l、组织蛋白酶s、组织蛋白酶v、梭菌蛋白酶(clostripain)、糜蛋白酶(chymase)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、弹性蛋白酶(elastase)、细胞内蛋白酶(endoproteinase)、肠激酶(enterokinase)、xa因子、甲酸、颗粒酶b、基质金属肽酶-2、基质金属肽酶-3、胃蛋白酶(pepsin)、蛋白酶k、sumo蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、tev蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、凝血酶(thrombin)、胰蛋白酶(trypsin)和tagzyme。[0308]标签[0309]在一些实施方案中，效应器模块包含蛋白标签。[0310]蛋白标签可以用于检测和监测效应器模块的过程。效应器模块可以包括一个或多个标签，例如表位标签(例如，flag或血凝素(ha)标签)。大量蛋白标签可以用于本效应器模块。这些蛋白标签包括但不限于：自标识多肽标签(例如，卤代烷脱卤酶(haloalkanedehalogenase，halotag2或halotag7)、acp标签、clip标签、mcp标签、snap标签)、表位标签(例如，flag、ha、his和myc)、荧光标签(例如，绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)、红色荧光蛋白(redfluorescentprotein，rfp)、黄色荧光蛋白(yellowfluorescentprotein，yfp)、及其变体)、生物发光标签(例如，荧光素酶(luciferase)及其变体)、亲和标签(例如，麦芽糖-结合蛋白(maltose-bindingprotein，mbp)标签、谷胱甘肽s-转移酶(glutathione-s-transferase，gst)标签)、免疫原性亲和标签(例如，蛋白a/g、irs、au1、au5、glu-glu、kt3、s-tag、hsv、vsv-g、xpress和v5)、以及其他标签(例如，生物素(小分子)、streptag(strepii)、sbp、生物素羧基载体蛋白(biotincarboxylcarrierprotein，bccp)、exact、cbp、cyd、hpc、cbd内含肽-甲壳质结合结构域、trx、norpa和nusa)。[0311]在其他实施方案中，标签也可以选自在以下中公开的那些：美国专利号8,999,897、8,357,511、7,094,568、5,011,912、4,851,341和4,703,004；美国专利申请公开号us2013115635和us2013012687；以及，国际申请公开号wo2013091661，以上这些中的每一个的内容通过引用整体并入。[0312]在一些方面，可以使用多种蛋白标签，相同或不同的标签；标签中的每一个可以位于相同的n末端或c末端处，而在其他情况下，这些标签可以位于每个末端处。[0313]接头[0314]在一些实施方案中，效应器模块包含接头。[0315]在一些实施方案中，本公开的效应器模块还可以包含接头序列。接头区域主要用作效应器模块内两个或更多个多肽之间的间隔子。如本文所使用的，“接头”或“间隔子”是指连接两个分子或分子的两个部分(例如，重组蛋白的两个结构域)的分子或分子组。[0316]在一些实施方案中，如本文所使用的，“接头(l)”或“接头结构域”或“接头区域”或“接头模块”或“肽接头”是指约1至100个氨基酸长度的寡肽或多肽区域，该寡肽或多肽区域将效应器模块的任何结构域/区域连接在一起(也称为肽接头)。肽接头的长度可以是1-40个氨基酸、或2-30个氨基酸、或20-80个氨基酸、或50-100个氨基酸。还可以根据所利用的有效负载的类型且基于有效负载的晶体结构来优化接头长度。在一些情况下，可以优选地选择较短的接头长度。在一些方面，肽接头由通过肽键连接在一起的氨基酸组成，优选由通过肽键连接的1至20个氨基酸组成，其中氨基酸选自20个天然存在的氨基酸：甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、丝氨酸(s)、半胱氨酸(c)、苏氨酸(t)、甲硫氨酸(m)、脯氨酸(p)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、精氨酸(r)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)。如本领域技术人员所理解的，可以将这些氨基酸中的一个或多个糖基化。[0317]接头序列可以是源自多结构域蛋白的天然接头。天然接头是一种可以将蛋白质内的两个不同的结构域或基序分开的短肽序列。[0318]在一些方面，接头可以是柔性的或刚性的。在其他方面，接头可以是可切割的或不可切割的。如本文所使用的，术语“可切割接头结构域或区域”或“可切割肽接头”可以互换使用。在一些实施方案中，接头序列可以是酶促切割的和/或化学切割的。[0319]本公开的接头还可以是非肽接头。例如，可以使用烷基接头，例如—nh—(ch2)a-c(o)—，其中a＝2-20。这些烷基接头可以进一步由任何非空间位阻基团取代，例如低级烷基(例如，c1-c6)、低级酰基、卤素(例如，cl、br)、cn、nh2、苯基等。[0320]靶向或穿透肽[0321]在一些实施方案中，效应器模块包含靶向和/或穿透肽。[0322]可以采用选择性识别细胞表面标志物(例如，受体、跨膜蛋白和细胞外基质分子)的小靶向和/或穿透肽，以将效应器模块靶向至所需器官、组织或细胞。体外合成的短肽(5-50个氨基酸残基)和天然存在的肽，或其类似物、变体、衍生物，可以合并至效应器模块，以用于将效应器模块归巢至所需器官、组织和细胞、和/或细胞内的亚细胞位置。[0323]在一些实施方案中，靶向序列和/或穿透肽可以包括在效应器模块中，以将效应器模块驱动至靶器官、或组织、或细胞(例如，癌细胞)。在其他实施方案中，靶向和/或穿透肽可以将效应器模块引导至细胞内的特定亚细胞位置。作为非限制性实施例，此类靶向序列和/或穿透肽可以包括用于将效应器模块靶向至中枢神经系统(例如，美国专利号9,259,432；美国申请公开号2015/259392)、或脂肪组织(例如，美国专利号8,067,377和第8,710,01)、或前列腺(例如，美国专利公开号2016/0046668)的所需区域的靶向序列和/或穿透肽，这些专利中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0324]在其他实施方案中，靶向和/或穿透肽可以将效应器模块引导至细胞内的特定亚细胞位置。作为非限制性实施例，线粒体靶向肽、和/或线粒体膜穿透肽可以包括在效应器模块中，以将效应器模块驱动至细胞的线粒体。参见例如，美国专利号：9,260,495、9,173,952和9,132,198；以及美国申请公开号：2015/361140；这些专利中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0325]靶向肽具有约6至约30(包括端值)的任意数量的氨基酸。肽可以具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。通常，靶向肽可以具有25个或更少的氨基酸，例如20个或更少，例如15个或更少。[0326]识别特定组织或细胞的、天然存在的小靶向和/或穿透肽以高亲和力结合细胞表面分子(例如，受体、跨膜蛋白)，这使它们成为有吸引力的转运部分。此类肽可以包括：来自melanocyte-stimulatinghormone)、神经肽y、神经生长因子(ngf)、神经营养因子(neurotrophin)-3/4、nph胰岛素、食欲素(orexin)、肥胖抑制素(obestatin)、骨钙素(osteocalcin)、胰激素(pancreatichormone)、甲状旁腺素(parathyroidhormone)、肽激素、肽yy、催乳素(prolactin)、前激素原(preprohormone)、松弛素(relaxi)、肾素(renin)、鲑降钙素(salcatonin)、生长抑素(somatostatin，sst)、促胰液素(secretin)、物质p、辛卡利特(sincalide)、硬骨鱼瘦蛋白(teleostleptins)、两栖类抗菌肽(temporin)、替莫瑞林(tesamorelin)、促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone)、尿皮素(urocortin)、血管活性肠肽(vasoactiveintestinalpeptide,vip)、vgf和卵黄生成素(vitellogenin)。[0330]靶向和穿透肽也可以是工程化仿生肽和/或化学修饰的小肽。在正常或患病条件下以高亲和力且选择性地靶向特定细胞和组织的、具有特定基序和序列的众多肽被鉴定。合成靶向肽的长度可以高达30个氨基酸，也可能更长。靶向肽通常具有至少约5个氨基酸但可能具有更少，例如4个氨基酸或3个氨基酸。通常，靶向肽具有约6至约30(包括端值)的任意数量的氨基酸。通常，靶向肽可以具有25个或更少的氨基酸，例如20个或更少，例如15个或更少。[0331]嵌合肽也可以用来自天然存在的蛋白质和人工氨基酸序列的融合氨基酸合成。[0332]刺激[0333]本公开的生物回路由一种或多种刺激触发。刺激包括配体、外部添加的或内源性的代谢物、确定存在或不存在的配体、一个或多个效应器模块的存在或作用、或者离子或生物分子的浓度梯度等。[0334]配体[0335]在一些实施方案中，刺激是配体。配体可以是核酸类的、蛋白类的、脂质类的、有机的、无机的或前述的任何组合。[0336]在一些实施方案中，配体可以是但不限于蛋白质、肽、核酸、脂质、脂质衍生物、甾醇、类固醇、代谢物、代谢物衍生物和小分子。[0337]在一些实施方案中，刺激是小分子。在一些实施方案中，小分子是细胞可渗透的(cellpermeable)。在一些实施方案中，小分子是fda批准的、安全的、且口服施用的。[0338]在一些实施方案中，配体结合至碳酸酐酶。在一些实施方案中，配体结合至碳酸酐酶并抑制碳酸酐酶功能，并且在本文中称为碳酸酐酶抑制剂。[0339]在一些实施方案中，配体是结合至碳酸酐酶2的小分子。在一个实施方案中，小分子是ca2抑制剂。ca2抑制剂的实施例包括但不限于：塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、乙酰唑胺、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹磺胺和二氯苯磺胺。[0340]在一些实施方案中，配体可以包含已知介导结合至ca2的小分子的部分。还可以对配体进行修饰以减少结合至ca2以外的碳酸酐酶的脱靶性并增加结合至ca2的特异性。[0341]配体也可以通过结构活性关系(structureactivityrelkationship，sar)研究从已知ca2配体的活性对其分子/化学结构的依赖性的分析中选择。可以利用本领域已知的与sar相关的任何方法来鉴定本公开的稳定配体。可以利用sar以改善配体的特性，例如特异性、效力、药代动力学、生物利用度和安全性。已知ca2抑制剂的sar分析也可以与与配体络合的ca2的高分辨率x射线结构相组合。[0342]在一个实施方案中，本公开的刺激可以是能够结合至特定dd或dd内的靶区域的fda批准的配体。[0343]在一些实施方案中，可以优选地选择在不存在sre的情况下不影响免疫细胞和/或嵌合抗原受体的活性的配体。[0344]在一些实施方案中，可以利用两种或更多种配体来稳定相同的刺激应答元件。[0345]配体缀合物[0346]在一些实施方案中，配体可以络合的(complex)或结合至另一分子，例如但不限于，另一配体、蛋白质、肽、核酸、脂质、脂质衍生物、甾醇、类固醇、代谢物、代谢物衍生物或小分子。在一些实施方案中，配体刺激络合的或结合至一个或多个其他分子。在一些实施方案中，配体刺激络合的或结合至一个或多个不同种类的其他分子和/或不同数量的其他分子。在一些实施方案中，配体刺激是同种配体的多聚体。在一些实施方案中，配体刺激多聚体包含2、3、4、5、6个或更多个单体。[0347]可以针对配体在蛋白应答中的调控测试配体(例如，众所周知结合候选蛋白质的小分子)。小分子可以是在临床上批准为安全的，并且具有合适的药物动力学和分布。在一些实施方案中，刺激是去稳定结构域(dd)的配体，例如，结合去稳定结构域并使融合至去稳定结构域的poi稳定的小分子。[0348]启动子[0349]在一些实施方案中，本公开的组合物包含启动子。[0350]如本文所使用的，启动子被定义为由细胞转录机制识别的dna序列，需要启动本公开的多核苷酸序列的特异性转录。载体可以包含可操作地连接至本公开的多核苷酸的天然或非天然启动子。选择的启动子可以是强的、弱的、组成型的、诱导型的、组织特异性的、发育阶段特异性的、和/或生物体特异性的。合适启动子的一个实施例是即刻早期巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)启动子，例如但不限于，seqidno:5635-5637。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动可操作地连接至该启动子序列的多核苷酸序列的高水平表达。启动子的另一个实施例是延伸生长因子-1α(elongationgrowthfactor，ef-1α)，例如但不限于，seqidno:5638-5642。也可以使用其他组成型启动子，包括但不限于：猿猴病毒40(simianvirus40，sv40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mousemammarytumorvirus，mmtv)、人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)、长末端重复序列(longterminalrepeat，ltr)、启动子、禽白血病病毒启动子(avianleukemiaviruspromoter)、爱泼斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即刻早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子(roussarcomaviruspromoter)、以及人基因启动子(包括但不限于，磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase,pgk)启动子(非限制性实例包括seqidno:5643-5650))、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、泛素c(ubc)启动子、人u6小核蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。在一些情况下，可以使用诱导型启动子，例如但不限于，金属硫蛋白启动子(metallothioninepromoter)、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。[0351]在一些实施方案中，最佳的启动子可以基于其在不存在配体的情况下实现本公开的sre和有效负载的最小表达和在存在配体的情况下实现可检测的表达的能力来进行选择。[0352]额外的启动子元件(例如，增强子)可以用于调控转录起始的频率。这些区域可以位于起始位点的上游或下游10-100个碱基对处。在一些情况下，两个或更多个启动子元件可以用以协同地或独立地激活转录。[0353]在一些实施方案中，本公开的启动子可以是tet-on启动子。转录调控tet系统与dd的组合允许同时控制基因表达和蛋白稳定性。pedone等人(2018)doi:https://doi.org/10.1101/404699描述的任何双teton-dd系统可以用于本公开(其内容通过引用整体并入本文)。[0354]其他调控性特征[0355]在一些实施方案中，本公开的组合物可以包括任选的蛋白酶体衔接子(proteasomeadaptor)。如本文所使用的，术语“蛋白酶体衔接子”是指靶向附加用于降解的有效负载的任何核苷酸/氨基酸序列。在某些方面，衔接子直接靶向用于降解的有效负载，从而规避了对泛素化反应的需要。蛋白酶体衔接子可以与去稳定结构域一起使用，以减少有效负载的基础表达。示例性蛋白酶体衔接子包括：rad23、或hhr23b的ubl结构域；以高亲和力结合至靶蛋白rb和蛋白酶体的s4亚基的hpve7，这允许直接的蛋白酶体靶向，从而绕过泛素化机制；结合至rb和蛋白酶体亚基s6的蛋白癌性锚蛋白重复序列(gankyrin)。[0356]示例性效应器模块构建体[0357]本公开的生物回路可包括至少一个效应器模块，该效应器模块可以包括至少一种源自ca2的sre(称为“ca2sre”)，该ca2sre可操作地连接至至少一种目的有效负载。这些类型的生物回路和效应器模块被称为“ca2生物回路”和“ca2效应器模块”。额外地，ca2效应器模块可以包括额外特征，包括但不限于，信号序列、接头、间隔子、标签、flag、切割位点和ires。本文中教导的或本领域已知的任何示例性sre(例如，dd)、目的有效负载、信号序列、接头、间隔子、标签、flag、切割位点和ires可以组合以创建本公开的ca2效应器模块。[0358]目的有效负载[0359]在一个实施方案中，ca2效应器模块包括目的有效负载。目的有效负载可以是野生型多肽、野生型多肽的片段，和/或包含相对于野生型多肽的一个或多个突变。目的有效负载的非限制性实施例显示在表7中。[0360]表7.目的有效负载[0361][0362]在一些实施方案中，本文中所描述的有效负载可以与嵌合抗原受体共表达。[0363]在一些实施方案中，本文所描述的有效负载可以与抗原特异性t细胞受体(tcr)共表达。[0364]本公开的ca2生物回路和/或效应器模块可以是单顺反子的或多顺反子的，意味着产生一个(单顺反子的)或多于一个(多顺反子的)信息(例如，目的有效负载)。如果产生两个信息，则ca2生物回路或效应器模块被视为双顺反子的。[0365]在一个实施方案中，本公开的至少一个ca2效应器模块是单顺反子的。[0366]在一个实施方案中，本公开的至少一个ca2效应器模块是多顺反子的。[0367]在一个实施方案中，本公开的至少一个ca2效应器模块是双顺反子的。[0368]在一个实施方案中，本公开的ca2生物回路是单顺反子的。[0369]在一个实施方案中，本公开的ca2生物回路是多顺反子的。[0370]在一个实施例中，本公开的ca2生物回路是双顺反子的。[0371]在一些实施方案中，有效负载可以是包含任何所描述的免疫治疗剂和泛素的融合蛋白。在融合蛋白内，泛素可以位于n末端处，而免疫治疗剂可以位于c末端处。在一方面，免疫治疗剂本身可以是融合蛋白，并且泛素可以位于融合的蛋白质之间。有效负载可以包括单个泛素蛋白或泛素蛋白链。泛素蛋白可以通过单个氨基酸连接至免疫治疗剂。单个氨基酸的选择可以取决于融合蛋白的所需半衰期。在一个实施方案中，免疫治疗剂可以是il12。[0372]在一些实施方案中，有效负载可以是全部cd40l或cd40l的部分。在一个实施方案中，有效负载可以是全部cd40l(seqidno.6)。在一些方面，有效负载可以是cd40l的部分，包括：(l)scd40l(wt的113-261)(seqidno.5800)；(ii)cd40l(wt的氨基酸14-261)(seqidno.5802)；或者，(iii)cd40l(wt的氨基酸14-261,(s110-g116)del)(seqidno.5804)。[0373]在一些实施方案中，有效负载可以是与以下相比具有一个或多个突变的cd40l：(i)scd40l(wt的113-261)(seqidno.5800)；(ii)cd40l(wt的氨基酸14-261)(seqidno.5802)；或者，(iii)cd40l(wt的氨基酸14-261,(s110-g116)del)(seqidno.5804)。[0374]在一些实施方案中，有效负载可以是与野生型cd40l相比具有一个或多个突变的cd40l(氨基酸序列提供为seqidno.6)。在一些方面，cd40l包含至少一个突变，例如但不限于：s110g、f111g、e112s、m113g、q114g、k115s、y120g、h125g、y172g、h224g、g226f、g226h、g226w、和g227f。cd40l有效负载可以包含两个突变，突变可以是但不限于：h224g和g226f、h224g和g226h、y172g和g226f、或h125和g227。cd40l有效负载可以包含三个突变，突变可以是但不限于：y120g、h224g和g226w。cd40l有效负载可以包含四个突变。cd40l有效负载可以包含五个突变。cd40l有效负载可以包含六个突变，并且这些突变可以是但不限于：s110g、f111g、e112s、m113g、q114g、和k115s。[0375]ca2cd40l效应器模块[0376]在一些实施方案中，本文所描述的ca2dds可以使用接头附加至有效负载。在一些实施方案中，本公开的效应器模块包括在有效负载与ca2dd之间的接头。有效负载可以包含cd40l(seqidno.6)或其部分、或者相对于seqidno.6的氨基酸序列包含一个或多个突变的cd40l(seqidno.6)或其部分。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260，e106d)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,g63d)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,h122y)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,i59n)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260，l156h)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,l183s)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,l197p)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,s56f)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,s56n)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,w208s)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,y193i)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸2-260,y51t)-接头-cd40l(seqidno.6)。如本文所使用的，“wt的氨基酸2-260”是指野生型ca2(seqidno.5810)的氨基酸位置2-260，并且突变氨基酸在ca2dd中的位置是相对于seqidno.5810的。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，e106d)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，g63d)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，h122y)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，i59n)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，l156h)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，l183s)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，l197p)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，s56f)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，s56n)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，w208s)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，y193i)-接头-cd40l(seqidno.6)。在一些实施方案中，效应器模块包含ca2(wt的氨基酸1-260，y51t)-接头-cd40l(seqidno.6)。如本文所使用的，“wt的氨基酸1-260”是指野生型ca2(seqidno.5810)的氨基酸位置1-260，并且突变氨基酸在ca2dd中的位置是相对于seqidno.5810的。[0377]在一些实施方案中，可以使用表8中描述的任何组分将本文所描述的ca2dd附加至cd40l。表9提供了附加至cd40l有效负载的ca2dd。ca2cd40l效应器模块可以进一步可操作地连接至本文所描述的任何car。表9中提供了与cd19car串联的ca2cd40l构建体。本文所描述的任何dd均可以与表8中的构建体组分组合以制备表9中列出的调控的cd40l构建体。在表9中，“*”代表终止密码子的翻译。[0378]表8.具有car构建体组分的ca2cd40l及ca2cd40l[0379][0380][0381]表9.具有car构建体的ca2cd40l及ca2cd40l[0382][0383][0384][0385][0386][0387][0388][0389][0390][0391][0392]在一些实施方案中，本文所描述的效应器模块可以包括在dd与cd40l之间的一个或多个切割位点。包含切割位点可以将dd的蛋白水解周转从有效负载解耦，从而改变独立于dd的有效负载的表达水平。在一些实施方案中，切割位点的添加可以增加有效负载的表达。在其他方面，切割位点的添加可以减少有效负载的表达。[0393]在一些实施方案中，本文所描述的效应器模块可以包括有效负载，其中有效负载的区域已经由包含g和s的序列取代。作为非限制性实施例，关于氨基酸序列，该区域的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或多于15个氨基酸。有效负载的氨基酸可以由gg、gs、sg、ss、ggg、ggs、gss、gsg、sgg、sgs、ssg、sss、或它们的组合的重复模式替换。[0394]在一些实施方案中，本文所描述的效应器模块可以包括有效负载，其中有效负载的区域已经由包含g和s的序列取代。作为非限制性实施例，关于氨基酸序列，该区域的长度可以是6个氨基酸。有效负载的氨基酸可以由重复一次的ggs替换。[0395]ii.药物组合物和制剂[0396]本教导还包括药物组合物，该药物组合物包含本公开的刺激、ca2生物回路、ca2效应器模块或系统中的一者或多者，以及任选地至少一种药学可接受赋形剂或惰性成分。[0397]如本文所使用的，术语“药物组合物”是指一种或多种本文所描述的ca2生物回路、或组分或其药学可接受盐、任选地与其他化学组分(例如，生理学合适的运载体和赋形剂)的制剂。[0398]术语“赋形剂”或“非活性成分”是指添加至药物组合物以进一步促进化合物施用的惰性或非活性物质。此类惰性成分的非限制性实施例在本文中的制剂部分公开。[0399]在一些实施方案中，组合物向人、人类患者或受试者施用。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指如本文所描述的待递送的任何一种或多种ca2生物回路系统组分。[0400]尽管本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于向人施用的药物组合物，但本领域技术人员将理解此类组合物通常适合于向任何其他动物施用，例如向非人动物(例如，非人哺乳动物)施用。考虑施用该药物组合物的受试者包括但不限于非人哺乳动物，包括：农业动物，例如牛、马、鸡和猪；家养动物，例如猫、狗；或者，研究动物，例如小鼠、大鼠、兔子、狗；以及，非人灵长类动物。[0401]根据本公开的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或多个单一单位剂量来批量地制备、包装和/或销售。如本文所使用地，“单位剂量”是包含预定量活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量和/或该剂量的方便部分，例如，该剂量的二分之一或三分之一。[0402]根据本公开的药物组合物中活性成分、药学可接受赋形剂或惰性成分、和/或任何额外成分的相对量将根据治疗的受试者的身份、身材和/或状况并进一步根据待施用组合物所通过的途径而变化。举例来说，组合物可以包含在0.1％与100％之间(例如，在0.5％与50％之间、在1-30％之间、在5-80％之间)至少80％(w/w)的活性成分。[0403]可以评估疾病的治疗或改善的功效，例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标志物水平或任何其他适用于正在治疗或针对预防的给定疾病的可测量参数。通过测量这些参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。与本公开的组合物的施用有关地，例如对于癌症“有效”表明以临床上适当方式的施用对至少统计上显著分数的患者产生有益效果，例如症状的改善、治愈、疾病负荷降低、肿瘤质量或细胞数量降低、寿命延长、生活质量改善、或其他通常被熟悉治疗特定类型癌症的医生认为是积极的效果。[0404]当疾病状态的一个或多个参数有统计上显著的改善时，或者由于没有恶化或没有出现原本预期的症状，那么治疗或预防效果是明显的。例如，疾病的可测量参数的至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％或更多的有利变化可以指示有效治疗。本公开的给定组合物或制剂的功效也可以使用针对本领域已知的给定疾病的实验动物模型来判断。当使用实验动物模型时，当观察到统计学显著的变化时，就证明了治疗的功效。[0405]制剂[0406]本公开的组合物可以以任何适合递送的形式配制。制剂可以是但不限于：纳米颗粒、聚(乳酸-共聚-乙醇酸共聚物)(poly(lactic-co-glycolicacid)，plga)微球、lipidoids、脂质复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括单糖)、阳离子脂质、及其组合。[0407]在一个实施方案中，制剂是可以包含至少一种脂质的纳米颗粒。脂质可以选自但不限于：dlin-dma、dlin-k-dma、98n12-5、c12-200、dlin-mc3-dma、dlin-kc2-dma、dodma、plga、peg、peg-dmg、和聚乙二醇化脂质。在另一方面，脂质可以是阳离子脂质，例如但不限于：dlin-dma、dlin-d-dma、dlin-mc3-dma、dlin-kc2-dma、和dodma。[0408]对于本文所描述的多核苷酸，制剂可以选自例如国际申请pct/us2012/069610(其内容通过引用整体并入本文)中教导的那些中的任一种。[0409]非活性成分[0410]在一些实施方案中，药物或其他制剂可以包含至少一种赋形剂，该赋形剂为非活性成分。如本文所使用的，术语“非活性成分”是指包括在制剂中的一种或多种非活性试剂。在一些实施方案中，可以用于本公开的制剂中的所有非活性成分、无活性成分或一些无活性成分可以是由美国食品药品监督管理局(foodanddrugadministration，fda)iii.剂量给药、递送和施用部分批准的。[0411]本文所描述的组合物可以通过一种或多种途径和形式递送至细胞或受试者。含有一种或多种本文所描述的ca2效应器模块、sre、有效负载和其他组分的病毒载体可以用于将它们递送至细胞和/或受试者。也可以使用其他形式(例如，mrna、质粒，并作为重组蛋白)。[0412]递送[0413]裸递送(nakeddelivery)[0414]本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)可以以裸的形式递送至细胞、组织、器官和/或生物体。如本文所使用的，术语“裸的(naked)”是指不含促进转染或渗透性的试剂或修饰递送的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)。裸的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)可以使用本领域已知和本文所描述的施用途径递送至细胞、组织、器官和/或生物体。在一些实施方案中，裸递送可以包括在简单缓冲剂(例如，盐水或pbs)中的制剂。[0415]配制的递送[0416]在一些实施方案中，可以使用本文所描述的方法配制本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)。制剂可以包含药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、有效负载的ca2效应器模块(包括其sre或经修饰和/或未修饰的有效负载)。制剂还可以包括但不限于：细胞渗透剂、药学可接受运载体、递送剂、生物溶蚀性(bioerodible)或生物相容性聚合物、溶剂、和/或缓释递送贮库(depot)。本公开的制剂可以使用本领域已知的和本文所描述的施用途径递送至细胞。[0417]也可以配制药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sres或有效负载)，以用于以本领域的多种形式中的任何一种直接递送至器官或组织，这些形式包括但不限于：直接浸泡或沐浴；经由导管；通过凝胶、粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂、和/或滴剂；以及，通过使用基材(例如，用组合物涂覆的或浸渍的织物或可降解材料)等。[0418]递送至细胞[0419]在本公开的另一方面，可以将编码本文所描述的ca2生物回路、ca2效应器模块、sre(例如，ca2dd)、目的有效负载(例如，免疫治疗剂)和组合物的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的载体引入至细胞中。作为非限制性实施例，细胞可以是效应器免疫细胞。[0420]在本公开的一些方面，可以将编码本公开的ca2生物回路、ca2效应器模块、sre(例如，ca2dd)、目的有效负载(例如，免疫治疗剂)和组合物的多核苷酸包装至病毒载体中或整合至病毒基因组中，从而允许多核苷酸瞬时地或稳定地表达。优选的病毒载体是逆转录病毒载体，包括慢病毒载体。为了构建逆转录病毒载体，可以将编码ca2生物回路、ca2效应器模块、ca2sre(例如，ca2dd)或目的有效负载(例如，免疫治疗剂)的多核苷酸分子插入至病毒基因组中某些病毒序列的位置以产生复制缺陷的病毒。然后，将重组病毒载体引入至含有gag、pol和env基因(但不含ltr和包装组分)的包装细胞系。将重组逆转录病毒颗粒分泌至培养基中，然后进行收集，任选地进行浓缩，并且用于基因转移。慢病毒载体是特别优选的，因为它们能够感染分裂细胞和非分裂细胞。[0421]载体也可以通过物理方法(例如，针、电穿孔、声穿孔、加氢穿孔(hyrdoporation))、化学运载体(例如，无机颗粒(例如，磷酸钙、二氧化硅、金)和/或化学方法的非病毒方法转移至细胞。在一些实施方案中，合成或天然的生物可降解剂可以用于递送，例如阳离子脂质、脂质纳米乳剂、纳米颗粒、肽类的载体、或聚合物类的载体。[0422]在一些实施方案中，本文所描述的多肽可以直接递送至细胞。在一个实施方案中，本公开的多肽可以使用合成肽递送，该合成肽包含融合至细胞渗透结构域(cellpenetrationdomain，cld)的内体渗漏结构域(endosomalleakagedomain，eld)。本公开的多肽与eld-cld-合成肽共同引入至细胞中。eld促进被困在内体中的蛋白质逃逸到细胞质中。此类结构域是微生物和病毒的衍生蛋白，并且在本领域中已经进行了描述。cpd允许蛋白质跨质膜的转运，并且在本领域中也已经进行了描述。当与单独使用任一结构域的共转导相比时，eld-cld融合蛋白协同地增加转导效率。在一些实施方案中，可以任选地将富含组氨酸的结构域添加至穿梭构建体，以作为允许货物从内体逃逸至细胞质中的其他方法。该穿梭还可以包括在n末端或c末端的半胱氨酸残基，以生成融合肽的多聚体。当与单个融合肽构建体相比时，通过将半胱氨酸残基添加至肽末端而生成的eld-cld融合肽多聚体显示出更高的转导效率。本发明的多肽还可以附加至适当的定位信号，以将货物引导至适当的亚细胞位置(例如，细胞核)。在一些实施方案中，国际专利公开wo2016161516和wo2017175072(其中每一个的内容通过引用整体并入本文)中教导的elds、clds或融合eld-cld合成肽中的任一种均可以用于本发明。[0423]递送形式和/或载体[0424]本公开的ca2生物回路系统、ca2效应器模块、sre、和/或有效负载可以使用一种或多种形式递送。本公开还提供了包装本文所描述的多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码ca2生物回路、ca2效应器模块、sre(例如，ca2dd)和有效负载、以及它们的组合。本公开的载体还可以用以将包装的多核苷酸递送至细胞、局部组织部位、或受试者。这些载体可以是任何种类，包括dna载体、rna载体、质粒、病毒载体和颗粒。病毒载体技术是众所周知的，并且在sambrook等(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)中进行了描述。可以用作载体的病毒包括但不限于：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associatedviral，aav)载体、单纯疱疹病毒载体(herpessimplexviralvector)、逆转录病毒载体、和溶瘤病毒等。[0425]一般而言，载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列和方便的限制性核酸内切酶位点、以及一种或多种可选择的标志物(例如，抗药性基因)。[0426]在一些实施方案中，重组表达载体可以包含对待引入载体的宿主细胞的类型特异性的调控性序列(例如，转录和翻译起始密码子和终止密码子)。[0427]在一些实施方案中，本文所描述的载体可以包含本文教导的一种或多种有效负载，其中两种或更多种有效负载可以包括在一个ca2效应器模块中。在这种情况下，两个或更多个有效负载同时由相同的刺激调节。在其他实施方案中，本发明的载体可以包含两个或更多个ca2效应器模块，其中每个ca2效应器模块包含不同的有效负载。在这种情况下，两个或更多个ca2效应器模块和有效负载由不同的刺激调节，从而单独地提供对两个或更多个组分的独立调控。[0428]慢病毒载体/颗粒[0429]在一些实施方案中，慢病毒载体/颗粒可以作为递送形式使用。慢病毒是病毒逆转录病毒科的一个亚群，命名是因为在整合至宿主基因组中之前需要病毒rna基因组逆转录为dna。因此，慢病毒载体/颗粒最重要的特征是它们的遗传物质被整合至靶/宿主细胞的基因组中。慢病毒的一些实施例包括人免疫缺陷病毒：hiv-1和hiv-2、猿猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus，siv)、猫免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiencyvirus，fiv)、牛免疫缺陷病毒(bovineimmunodeficiencyvirus，biv)、詹布拉纳病病毒(jembranadiseasevirus，jdv)、马感染性贫血病毒(equineinfectiousanemiavirus，eiav)、马感染性贫血病毒、维斯纳-梅迪(visna-maedi)和山羊关节炎脑炎病毒(caprinearthritisencephalitisvirus，caev)。[0430]通常，构成基因递送载体的慢病毒颗粒自身存在复制缺陷(也称为“自失活”)。凭借通过完整宿主核膜的进入机制，慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞(naldinil等人,ciirr.opin.biotechnol,1998,9:457-463)。重组慢病毒载体/颗粒已经通过多重减弱hiv毒力基因来生成，例如，删除基因env、vif、vpr、vpu、nef和tat，从而使载体生物学安全。相应地，慢病毒载体(例如，源自hiv-1/hiv-2的)可以介导转基因向非分裂细胞的有效递送、整合和长期表达。如本文所使用的，术语“重组”是指含有慢病毒序列和非慢病毒逆转录病毒序列的载体或其他核酸。[0431]慢病毒颗粒可以通过在生产细胞(例如，人hek293t细胞)中共表达病毒包装元件和载体基因组本身来生成。这些元件通常提供在三个或四个单独的质粒中。生产细胞与以下质粒共转染：编码慢病毒组分的质粒，该慢病毒组分包括病毒的核心(即，结构蛋白)和酶组分、以及包膜蛋白(称为包装系统)；以及，编码待转移至靶细胞的包括外源转基因的基因组、载体本身(也称为转移载体)的质粒。通常，质粒或载体包括在生产细胞系(producercellline)中。质粒/载体经由转染、转导或感染引入至生产细胞系中。用于转染、转导或感染的方法是本领域技术人员众所周知的。作为非限制性实施例，包装和转移构建体通常可以通过磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔来与显性可选择标志物(例如，neo、dhfr、gln合成酶或ada)一起引入至生产细胞系中，然后在存在适当药物的情况下进行选择和克隆分离。[0432]生产细胞产生含有外源基因的重组病毒颗粒，例如，本公开的ca2效应器模块。重组病毒颗粒从培养基中回收并通过本领域技术人员使用的标准方法滴定。重组慢病毒载体可以用于感染靶细胞。[0433]可以用于产生高滴度慢病毒颗粒的细胞可以包括但不限于：hek293t细胞、293g细胞、star细胞(relander等人，mol.ther.,2005,11:452-459)、freestyletm293表达系统(thermofisher，waltham，ma)、和其他hek293t类的生产细胞系(例如，stewart等人,humgenether.2011,22(3):357-369；lee等人，biotechnolbioeng,2012,10996):1551-1560；throm等人,blood.2009,113(21):5104-5110；其内容通过引用整体并入本文)。[0434]在一些方面，包膜蛋白可以是来自其他病毒的异源包膜蛋白，例如水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)的g蛋白(vsvg)或杆状病毒(baculoviral)gp64包膜蛋白的g蛋白。vsv-g糖蛋白可以特别选自分类在水疱病毒属中的物种：卡拉加斯病毒(carajasvirus,cjsv)；金迪普拉病毒(chandipuravirus,chpv)；科卡尔病毒(cocalvirus,cocv)；伊斯法罕病毒(isfahanvirus,isfv)；马拉巴病毒(marabavirus,marav)；帛黎病毒(piryvirus,piryv)；阿拉戈斯水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisalagoasvirus,vsav)；印第安纳水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisindianavirus,vsiv)；以及，新泽西水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisnewjeseyvirus,vsnjv)；和/或，临时归类在水疱病毒属中的物种，如草鱼弹状病毒(grasscarprhabdovirus)、比安157575病毒(bean157575)、博特克病毒(botekevirus,btkv)、卡尔查基病毒(calchaquivirus,cqiv)、美洲鳗病毒(eelvirusamerican,cqiv)、格雷洛奇病毒(graylodgevirus,glov)、朱罗纳病毒(juronavirus,jury)、克拉马斯病毒(klamathvirus,klav)、克瓦塔病毒(kwattavirus,kwav)、拉霍亚病毒(lajoyavirus,ljv)、马尔佩斯泉病毒(malpaisspringvirus,mspv)、埃尔岗蝙蝠病毒(mountelgonbatvirus,mebv)、佩里内特病毒(perinetvirus,perv)、梭子鱼鱼苗弹状病毒(pikefryrhabdovirus,pfrv)、波登病毒(portonvirus,porv)、拉迪病毒(radivirus,radiv)、鲤春病毒血症病毒(springviremiaofcarpvirus,svcv)、图帕伊阿病毒(tupaiavirus,tupv)、溃疡病弹状病毒(ulcerativediseaserhabdovirus,udrv)和尤格波格丹诺夫奇病毒(yugbogdanovacvirus,ybv)。gp64或其他杆状病毒包膜蛋白可以源自：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(autographacalifornicanucleopolyhedrovirus,acmnpv)、芹菜夜蛾核型多角体病毒(anagraphafalciferanuclearpolyhedrosisvirus)、家蚕核型多角体病毒(bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus)、云杉卷叶蛾核型多角体病毒(choristoneurafumiferananucleopolyhedrovirus)、黄杉毒蛾单衣壳核型多角体病毒(orgyiapseudotsugatasinglecapsidnuclearpolyhedrosisvirus)、苹浅褐卷蛾核型多角体病毒(epiphyaspostvittananucleopolyhedrovirus)、美国白蛾核型多角体病毒(hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus)、大蜡螟核型多角体病毒(galleriamellonellanuclearpolyhedrosisvirus)、多里病毒(dhorivirus)、索戈托病毒(thogotovirus)、柞蚕核型多角体病毒(antheraeapemyinucleopolyhedrovirus)或贝特肯病毒(batkenvirus)。[0435]慢病毒颗粒中提供的其他元件可以包含：在5'或3'末端处的逆转录病毒ltr(long-terminalrepeat，长末端重复序列)、逆转录病毒输出元件、任选的慢病毒反向应答元件(reverserespondelement，rre)、启动子或其活性部分、和基因座控制区(locuscontrolregion，lcr)或其活性部分。ca2效应器模块连接至载体。[0436]本领域中讨论了用于生成重组慢病毒颗粒的方法，例如，美国专利号:8,846,385；7,745,179；7,629,153；7,575,924；7,179,903；以及，6,808,905；其内容通过引用整体并入本文。[0437]使用的慢病毒载体可以选自但不限于：plvx、plenti、plenti6、pljml、fugw、pwpxl、pwpi、plenticmvpurodest、pljml-egfp、pultra、pinducer20、phiv-egfp、pcw57.1、ptrpe、pelps、prrl和plionil。[0438]慢病毒载体和细胞工程[0439]慢病毒载体用于将转基因引入t细胞(例如，原代人t细胞或jurkat细胞)、以用于临床前研究和临床应用，该慢病毒载体包括最近批准的产品，例如用于复发性/难治性b细胞淋巴瘤的tisagenlecleucelvsv-g假型第三代慢病毒载体提供了高滴度、高转导效率和安全性，并且已经成为t细胞工程化的首选载体。虽然不希望受理论束缚，但t细胞工程化通常涉及通过cd3/cd28抗体的t细胞激活，然后是慢病毒转导，然后是可持续5到30天(例如，9到14天或9到15天)的细胞扩增。一般来说，慢病毒转基因整合可能需要7天或更多天才能在t细胞(例如，原代人t细胞或jurkat细胞)中完全稳定。虽然更长的培养可以增加细胞数量，但更长的培养也可以将t细胞表型变为更加分化的状态。因此，离体培养的持续时间会影响cart细胞的持久性和功效。例如，培养时间较短的细胞可能表现出较少分化的表型，并且可以在临床前模型中非常有功效。[0440]虽然不希望受理论束缚，但t细胞分化的状态可能影响过继转移后t细胞的移植和持久性。ghassemi等人(reducingexvivocultureimprovestheantileukemicactivityofchimericantigenreceptor(car)tcells.cancerimmunolres；6(9)sept.2018；其内容通过引用整体并入本文)描述了原代人t细胞随时间的分化，并且看到早期收获的cart细胞表现出增强的效应器功能和增殖，以及体内增强的效力和持久性。[0441]慢病毒动力学，例如在离体t细胞(例如，原代人t细胞或jurkat细胞)中慢病毒引入的转基因的转导、整合和/或表达动力学可能影响体内抗肿瘤应答的功效和耐久性。某些类型的t细胞可能会产生不同的结果。例如，jurkat细胞系可能无法提供与原代人t细胞一样的动态表达范围。评估这些慢病毒动力学的方法是本领域已知的并且在本文中描述。[0442]在一些实施方案中，为了确定转基因表达动力学，cd3/cd28激活的原代人t细胞可以用携带转基因(例如，调控的转基因或组成型转基因，例如cd19car、il12、荧光蛋白、或本文所描述的任何转基因(例如，有效负载))的慢病毒转导。可以通过本文所描述的和/或本领域已知的方法分析细胞的活力、病毒基因组整合(例如，通过使用定量pcr)、转录物水平(例如，通过使用定量rt-pcr)、和转基因的细胞表面表达(如果适用)(例如，如果转基因是cd19car或包括cd19car，则可以评估cd19car的表面表达)。细胞可以在转导之前和/或转导之后进行分析，例如在转导后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或多于30天进行分析。[0443]在一些实施方案中，cd3/cd28激活的原代人t细胞可以在转导后用cd3/cd28珠(beads)重新激活。细胞可以在转导后5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或多于30天被重新激活。可以通过本文所描述的和/或本领域已知的方法分析细胞的活力、病毒基因组整合(例如，通过使用定量pcr)、转录物水平(例如，通过使用定量rt-pcr)、转基因的细胞表面表达(如果适用)(例如，如果转基因是cd19car或包括cd19car，则可以评估cd19car的表面表达)、拷贝数、和/或mrna水平。[0444]在一些实施方案中，用携带转基因的慢病毒转导的激活的原代人t细胞的细胞活力大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％。作为非限制性实施例，细胞活力大于90％。作为非限制性实施例，细胞活力大于85％。[0445]在一些实施方案中，用携带转基因的慢病毒转导的jurkat细胞的细胞活力大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％。作为非限制性实施例，细胞活力大于90％。作为非限制性实施例，细胞活力大于85％。[0446]在一些实施方案中，转基因整合至细胞的基因组中可以处于或高于饱和点。作为非限制性实施例，饱和点可以是每个细胞3个拷贝。[0447]在一些实施方案中，转基因至基因组中的整合在评估的初始时间点可能很高，然后在培养的其余部分变得稳定之前下降到至较低的整合值。作为非限制性实施例，在早期时间点期间，转基因的每个细胞可以有多达20个拷贝整合至基因组中，然后下降到每个细胞2个拷贝，并且在培养的其余部分保持稳定。[0448]在一些实施方案中，可以评估t细胞的转导能力。来自至少一个供体的t细胞可以用含有转基因的慢病毒、以一定剂量转导，该剂量预计达到饱和水平(例如，如果预期泊松分布，则每个细胞应该含有拷贝的足够的病毒)和超过饱和度5倍的更高的剂量。可以检测每个细胞的拷贝数、细胞的百分比和mfi(或转基因培养基中的浓度)，以确定是否所有细胞都在表达转基因。作为非限制性实施例，来自两个不同供体的t细胞可以用包括转基因的慢病毒转导。转导可以以两个剂量，饱和度和5×饱和度进行，并且表明转导后5-10天，所有组都可能达到或超过预测的饱和整合转基因水平和组间相似的表达强度，但并非所有细胞都在表达转基因。并非所有t细胞都具有相同的转导敏感性，即使来自同一供体也是如此。表达gfp的总细胞比例(高于检测阈值)可能因供体、批次和/或病毒剂量而异。从单个供体表达的gfp的总细胞百分比可能在70％与95％之间。[0449]在一些实施方案中，一定百分比的培养的t细胞(例如，原代人t细胞和/或jurkat细胞)可以表达转基因。表达转基因的培养的t细胞的百分比可以是但不限于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或大于99％。作为非限制性实施例，该百分比可以大于70％。作为非限制性实施例，该百分比可以大于75％。作为非限制性实施例，该百分比可以大于80％。作为非限制性实施例，该百分比可以大于85％。作为非限制性实施例，该百分比可以大于90％。作为非限制性实施例，该百分比可以大于95％。[0450]在一些实施方案中，来自培养物的mrna水平可能在研究的持续时间内下降。这种下降可能不仅限于特定的转基因，而且这种趋势可能会出现在多类表达的蛋白质中。为了增加mrna水平，可以在mrna水平从初始水平减少后重新激活细胞。细胞可以在转导后5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或多于30天被重新激活。作为非限制性实施例，为了增加培养物中的mrna水平，可以在转导后13天用cd3/cd28珠重新激活细胞。[0451]在一些实施方案中，来自培养物的表面表达可能在研究期间下降。例如，表面表达可能在转导后3至13天、3至14天、或3至15天之间下降。为了增加表面表达，细胞可以在表面fluorescenceintensity，mfi)是通过流式细胞术测定的，每组都进行适当的染色。百分比表达也可以通过流式细胞术测定，从而量化荧光高于阈值的细胞百分比。可溶性有效负载可以通过以下量化：在每个标记的时间点收获培养上清液，并运行mesoscalediscovery板测定(msd)，然后对细胞密度进行标准化。[0456]腺相关病毒颗粒[0457]本公开的任何ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块、sre或有效负载的递送可以使用重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedviral，raav)载体来实现。此类载体或病毒颗粒可以设计为利用任何已知的血清型衣壳或血清型衣壳的组合。[0458]aav载体不仅包括单链载体，还包括自互补aav载体(self-complementaryaavvectors，scaav)。scaav载体含有一起退火形成双链载体基因组的dna。通过跳过第二链合成，scaavs允许在细胞中快速表达。[0459]raav载体可以通过本领域的标准方法制造，例如通过在sf9昆虫细胞中或在人细胞(例如，hek293细胞)的悬浮细胞培养物中进行三重转染。[0460]可以将ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块、sre或有效负载编码在一个或多个病毒基因组中，以包装在本文教导的aav衣壳中。[0461]除了至少一个或两个itr(invertedterminalrepeats，反向末端重复序列)之外，此类载体或病毒基因组还可以包括从载体或病毒基因组的表达所必需的某些调控元件。此类调控元件是本领域熟知的，并且包括例如启动子、内含子、间隔子和填充序列等。[0462]本文描述的ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块、sres或有效负载可以在一种或多种aav颗粒中施用。[0463]在一些实施方案中，ca2效应器模块可以在一种或多种aav颗粒中施用。在一些实施方案中，可以在病毒基因组中编码多于一种ca2效应器模块或sre。[0464]逆转录病毒载体/颗粒(g-逆转录病毒载体)[0465]在一些实施方案中，逆转录病毒载体/颗粒可以用于递送本公开的ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块、sre或有效负载。逆转录病毒载体(retroviralvectors，rv)允许转基因永久整合在靶细胞中。除了基于复杂hiv-1/2的慢病毒载体，基于简单γ-逆转录病毒的逆转录病毒载体已经被广泛用于递送治疗基因，并且在临床上证明是一种能够转导范围广泛的细胞类型的、最有效和最强大的基因递送系统。γ逆转录病毒的实施例物种包括鼠白血病病毒(murineleukemiaviruses，mlv)和猫白血病病毒(felineleukemiaviruses，felv)。[0466]在一些实施方案中，源自哺乳动物γ-逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒(mlv))的γ-逆转录病毒载体是重组的。γ逆转录病毒的mlv家族包括单嗜性(ecotropic)、双嗜性、异嗜性和多嗜性亚家族。单嗜性病毒只能使用mcat-1受体感染鼠细胞。单嗜性病毒的实施例是moloneymlv和akv。双嗜性病毒通过pit-2受体感染鼠、人和其他物种。双嗜性病毒的一个实施例是4070a病毒。异嗜性和多嗜性病毒利用相同的(xpr1)受体，但它们的物种嗜性不同。异嗜性病毒(例如，nzb-9-1)感染人和其他物种但不感染鼠物种，而多嗜性病毒(例如，病灶形成病毒(focus-formingviruses，mcf))感染鼠、人和其他物种。[0467]γ-逆转录病毒载体可以通过用几种质粒共转染细胞而在包装细胞中产生，所述质粒包括：编码逆转录病毒结构和酶促(gag-pol)多蛋白；编码包膜(envelope，env)蛋白；以及，编码载体mrna，该载体mrna包括编码待包装在新形成的病毒颗粒中的、本公开组合物的聚核苷酸。[0468]在一些方面，重组γ-逆转录病毒载体用来自其他病毒的包膜蛋白进行假型化。包膜糖蛋白被合并至病毒颗粒的外脂质层中，这可以增加/改变细胞的嗜性。示例性包膜蛋白包括：长臂猿白血病病毒包膜蛋白(gibbonapeleukemiavirusenvelopeprotein，galv)或水疱性口炎病毒g蛋白(vesicularstomatitisvirusgprotein，vsv-g)、或猿猴内源性逆转录病毒包膜蛋白、或麻疹病毒h和f蛋白、或人免疫缺陷病毒gp120包膜蛋白、或科卡尔水泡性病毒(cocalvesiculovirus)包膜蛋白(参见，例如，美国申请公开号：2012/164118；其内容通过引用整体并入本文)。在其他方面，可以遗传修饰包膜糖蛋白、以将靶向/结合配体合并至γ-逆转录病毒载体中，结合配体包括但不限于肽配体、单链抗体和生长因子(waehler等人,nat.rev.genet.2007,8(8):573-587；其内容通过引用整体并入本文)。这些工程化糖蛋白可以将载体重新定位至表达其相应靶向部分的细胞。在其他方面，可以引入“分子桥”以将载体引导至特定细胞。分子桥具有双重特异性：一端可以识别病毒糖蛋白，而另一端可以结合至靶细胞上的分子决定簇。此类分子桥(例如配体-受体、抗生物素蛋白-生物素、以及化学缀合物、单克隆抗体和工程化融合蛋白)可以引导病毒载体附着至用于转导的靶细胞(yang等人,biotechnol.bioeng.,2008,101(2):357-368；和maetzig等人,viruses,2011,3,677-713；其全部内容以引用方式并入本文)。[0469]在一些实施方案中，重组γ-逆转录病毒载体是自灭活的(self-inactivating，sin)γ逆转录病毒载体。载体无法复制。sin载体可能在最初包含增强子/启动子活性的3'u3区域内有缺失。此外，5'u3区域可以用源自巨细胞病毒或rsv的强启动子(包装细胞系中需要的)、或选择的内部启动子、和/或增强子元件替换。内部启动子的选择可以根据本公开的特定目的所需的基因表达的特定要求来进行。[0470]在一些实施方案中，编码ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块、sre的多核苷酸被插入至重组病毒基因组内。重组γ-逆转录病毒载体的病毒mrna的其他成分可以通过插入或去除天然存在的序列(例如，插入ires、插入编码目的多肽或目的抑制性核酸的异源多核苷酸、以及改组来自不同逆转录病毒或病毒的更有效的启动子来代替野生型启动子等)来进行修饰。在一些实施例中，重组γ-逆转录病毒载体可以包含：经修饰包装信号、和/或引物结合位点(primerbingdingsite，pbs)、和/或5'-长末端重复序列(longterminalrepeat，ltr)的u3区域中的5'-增强子/启动子元件、和/或3'-ltr的u3区域中修饰的3'-sin元件。这些修饰可能会增加感染的滴度和能力。[0471]适用于递送本公开的ca2生物回路组分、ca2效应器模块、sres或有效负载的γ逆转录病毒载体可以选自以下中公开的那些：美国专利号8,828,718；7,585,676；7,351,585；美国申请公开号：2007/048285；pct申请公开号：wo2010/113037；wo2014/121005；wo2015/056014；以及，欧洲专利号：ep1757702；ep1757703(以上文件中的每一个的内容通过引用整体并入本文)。[0472]溶瘤病毒载体[0473]在一些实施方案中，可以将本公开的多核苷酸包装至溶瘤病毒中。如本文所使用的，术语“溶瘤病毒”是指优先感染和杀死癌细胞的病毒，例如疫苗病毒。溶瘤病毒可以是天然存在的，或者可以是基因修饰的病毒，例如溶瘤腺病毒(oncolyticadenovirus)和溶瘤疱疹病毒(oncolyticherpesvirus)。[0474]在一些实施方案中，溶瘤疫苗病毒可以包括胸苷激酶(thymidinekinase，tk)-缺陷性、表达粒细胞巨噬细胞(granulocytemacrophage，gm)-集落刺激因子(colonystimulatingfactor，csf)的、有复制能力的足以诱导肿瘤中细胞的溶瘤作用的痘苗病毒载体病毒颗粒；参见例如美国专利号：9,226,977；其内容通过引用整体并入本文。[0475]信使rna(mrna)[0476]在一些实施方案中，可以将本文所述的ca2效应器模块设计为信使rna(mrna)。如本文所使用的，术语“信使rna”(mrna)是指编码目的多肽并且能够在体外、体内、原位或离体翻译以产生所编码的目的多肽的任何多核苷酸。此类mrna分子可具有国际申请号pct/us2013/030062(其内容通过引用整体并入本文)中教导的那些mrna分子中的任一种的结构组分或特征。[0477]在一些实施方案中，可以将ca2效应器模块设计为自扩增rna。如本文所使用的“自扩增rna”是指可以在宿主中复制从而引起rna和由rna编码的蛋白质的量增加的rna分子。该自扩增rna可以具有国际专利申请公开号wo2011005799(其内容通过引用整体并入本文)中教导的那些自扩增rna中的任一种的任何结构特征或组分。[0478]剂量给药(dosing)[0479]本公开提供了方法，该方法包括向有需要的受试者施用任何一种或多种ca2生物回路系统的组分。这些可以使用用于预防或治疗或成像疾病、障碍和/或病症(例如，与癌症或自身免疫病相关的疾病、障碍、和/或病症)的任何有效量和任何有效施用途径来向受试者施用。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用方式以及其活动方式等。[0480]根据本公开的组合物通常以剂量单位形式配制以便于施用和剂量均匀性。然而，应当理解的是，本公开的组合物的总每日使用量可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定。用于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当成像剂量水平将取决于多种因素，该多种因素包括：正在治疗的障碍和障碍的严重程度；所用的具体化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄率；治疗的持续时间；与所用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；以及，医学领域众所周知的类似因素。[0481]在一些实施方案中，本文所描述的组合物可以以不同的剂量使用，以避免t细胞耗竭、防止细胞因子释放综合征并使与免疫疗法相关的毒性最小化。例如，本公开的组合物的低剂量可以用于初始治疗具有高肿瘤负荷的患者，而具有低肿瘤负荷的患者可以用高的且重复的剂量的本文所述组合物治疗以确保最小肿瘤抗原负荷的识别。在另一种情况下，本发明的组合物可以以脉动方式递送以减少强直t细胞信号传递并增强体内持久性。在一些方面，可以在施用高剂量之前通过最初使用低剂量的本发明组合物来使毒性最小化。如果血清标志物(例如铁蛋白、血清c反应蛋白、il6、ifn-γ和tnf-α)升高，则可以修改剂量给药。[0482]在一些实施方案中，神经毒性可以与car或til疗法相关联。这种神经毒性可以是关联的cd19-car。毒性可能是由于过度的t细胞浸润至大脑中导致的。在一些实施方案中，可以通过阻止t细胞通过血脑屏障的通道来减轻神经毒性。这可以通过内源性α-4整合蛋白抑制剂的靶基因缺失来实现，例如泰萨布里/那他珠单抗(tysabri/natalizumab)也可以用于本发明。[0483]本文还提供了向有需要的受试者施用根据本发明的配体的方法。可以使用调节本发明的ca2生物回路的任何有效量和任何有效施用途径来向受试者或细胞施用配体。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用方式和其活动方式等。受试者可以是人、哺乳动物或动物。根据本发明的组合物通常以单位剂量配制以便于施用和剂量均匀性。然而，应当理解的是，本公开的组合物的总每日使用量可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定。在某些实施方案中，根据本发明的配体可以每天一次或多次地、足以递送的剂量水平进行施用，以每天受试者体重计，该剂量水平为约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、或约1mg/kg至约25mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、约50mg/kg至约500mg/kg、约100mg/kg至约1000mg/kg，以获得所需的效果。在一些实施方案中，剂量水平可以是每天受试者体重的1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、100mg/kg、110mg/kg、120mg/kg、130mg/kg、140mg/kg、150mg/kg、160mg/kg、170mg/kg、180mg/kg、190mg/kg或mg/kg，或每天多次，从而获得所需的效果。[0484]本公开提供了用于将本文所述配体中的任一种递送至细胞或组织的方法，该方法包括使细胞或组织与所述配体接触、并且可以在体外、离体或体内完成。在某些实施方案中，可以向细胞以足以递送的计量水平施用根据本发明的配体，该剂量水平为约1nm至约10nm、约5nm至约50nm、约10nm至约100nm、约50nm至约500nm、约100nm至约1000nm、约1μm至约10μm、约5μm至约50μm、约10μm至约100μm、约25μm至约250μm、约50μm至约500μm。在一些实施方案中，可以以选自但不限于以下的剂量向细胞施用配体：0.00064μm、0.0032μm、0.016μm、0.08μm、0.4μm、1μm、2μm、10μm、50μm、75μm、100μm、150μm、175μm、200μm、250μm。[0485]本发明的配体的所需剂量可以仅递送一次、每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。在某些实施方案中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送所需的剂量。当采用多次施用时，可以使用分次剂量给药方案，例如本文所描述的那些。如本文所使用的，“分次剂量”是将“单个单位剂量”或每日总剂量分成两个或更多个剂量，例如，“单个单位剂量”的两次或更多次施用。如本文所使用的，“单个单位剂量”是以一剂/一次/单一途径/单一接触点施用的任何治疗剂的剂量，即单个施用事件。本公开的配体的所需剂量可以作为“脉冲剂量”或作为“连续流”施用。如本文所使用的，“脉冲剂量”是在一段时间内以设定频率施用的任何治疗剂的一系列单个单位剂量。如本文所使用的，“连续流”是在单一途径/单一接触点中连续施用一段时间的治疗剂的剂量，即连续施用事件。总每日剂量，即在24小时内给予或开出的量，可以通过这些方法中的任何一种施用，或作为这些方法的组合施用，或通过适合于药物施用的任何其他方法施用。[0486]施用[0487]在一些实施方案中，用于免疫疗法的组合物可以向细胞离体施用，随后向受试者施用。可以使用本领域已知的多种方法对免疫细胞进行离体分离和扩增。例如，美国专利号6,805,861和6,531,451(这些文件中的每一个的内容通过引用整体并入本文)中描述了分离细胞毒t细胞的方法。美国专利号7,435,596(其内容通过引用整体并入本文)中描述了nk细胞的分离。[0488]在一些实施方案中，根据细胞的性质，可以将细胞以多种方式引入至宿主生物(例如，哺乳动物)中，该多种方式包括注射、输液(transfusion)、输注、局部滴注或植入。在一些方面，可以在肿瘤的位点处引入本文所描述的细胞。使用的细胞数量将取决于多种情况、引入目的、细胞寿命、待使用的方案，例如施用次数或细胞增殖能力等。细胞可以是在生理学可接受的培养基中的。[0489]在一些实施方案中，本文所描述的细胞可以以多剂量向患有疾病或病症的受试者施用。施用通常会实现癌症或临床病症的一种或多种症状的改善、和/或治疗或预防癌症或临床病症或其症状。[0490]在一些实施方案中，用于免疫疗法的组合物可以在体内施用。在一些实施方案中，可以向受试者体内递送包含ca2生物回路、ca2效应器分子、sre、目的有效负载(例如，免疫治疗剂)和本文所描述的组合物的本公开的多肽。免疫治疗剂的体内递送在本领域中有充分的描述。例如，欧洲专利号ep0930892a1(其内容通过引用并入本文)中描述了细胞因子的递送方法。[0491]递送途径[0492]本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sres(例如，ca2dd)、有效负载(例如，免疫治疗剂))、载体和细胞可以通过任何途径施用以实现治疗有效的结果。这些途径包括但不限于：肠内(进入肠道)、胃肠内、硬膜上(epidural)(进入硬脑膜)、口服(通过口腔)、经皮、硬膜外(peridural)、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮(应用到皮肤上)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(皮肤下)、鼻内施用(通过鼻子)、静脉内(进入静脉)、静脉内推注、静脉滴注、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内(输注或注射到腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼睛)、海绵体内注射(进入病理腔)、腔内(intracavitary)(进入阴茎根部)、阴道内施用、宫内、羊膜外施用、经皮(通过完整皮肤的扩散以用于全身分布)、经粘膜(通过粘膜的扩散)、经阴道、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼滴入(到结膜上)、在滴耳剂中、耳道(在耳朵内或通过耳朵)、颊(朝向脸颊)、结膜、皮肤、牙齿(对一颗或多颗牙齿)、电渗、子宫颈内(endocervical)、窦内(endosinusial)、气管内、体外(extracorporcal)、血液透析、浸润、间质、腹内、羊膜内、关节内、胆管内、支气管内、滑囊内(intrabursal)、软骨内(在软骨内)、尾部内(intracaudal)(在马尾(caudaequine)内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内(dentalintracornal)、冠状动脉内(在冠状动脉内)、海绵体内(intracorporuscavernosum)(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、管内(在腺管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬脑膜内或下方)、表皮内(至表皮)、食道内(至食道)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠远端内)、病灶内(在局部病变内或直接引入到局部病变)、管腔内(在管的腔内)、淋巴管内(在淋巴管内)、髓内(在骨的骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、心肌内(在心肌内)、眼内(在眼内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包膜内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或其支气管内)、窦内(intrasinal)(在鼻窦或眶周窦内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑膜腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、脑脊髓膜内(intrathecal)(在任何水平的脑脊髓轴的脑脊液内)、胸内(在胸腔内)、小管内(在器官的小管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在中耳内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子电渗疗法(通过电流，可溶性盐的离子迁移到身体组织中)、冲洗(沐浴或冲洗开放的伤口或体腔)、喉(laryngeal)(直接在喉部)、鼻饲(通过鼻子并到胃中)、封闭敷料技术(局部途径施用，然后用阻塞该区域的敷料覆盖)、眼科(ophthalmic)(到外眼)、口咽(直接到口腔和咽部)、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外(peridural)、神经周、牙周、直肠、呼吸道(在呼吸道内通过口服或鼻吸入用于局部或全身作用)、眼球后(在脑桥后面或在眼球后面)、心肌内(进入心肌)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下(submucosal)、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(通过气管壁)、经鼓室(transtympanic)(穿过或通过鼓室)、输尿管(到输尿管)、尿道(到尿道)、阴道、骶管阻滞(caudalblock)、诊断、神经阻滞、胆道灌注、心脏灌注、光分离置换法(photopheresis)或脊髓。[0493]肠胃外和可注射施用[0494]在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)可以肠胃外施用。用于口服及肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型可以包括：本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇脂肪酸酯、及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物可以包括辅料，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、和/或香料。在用于肠胃外施用的某些实施方案中，组合物与增溶剂(例如，醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物、和/或它们的组合)混合。在其他实施方案中，表面活性剂(例如，羟丙基纤维素)包括在内。[0495]可注射制剂，例如，无菌可注射含水或含油混悬剂可以根据已知技术使用合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂配制。无菌可注射制剂可以是在无毒的肠外可接受稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液剂、混悬剂和/或乳剂，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。在可接受媒介物(vehicles)和溶剂中，可以采用水、林格溶液(ringer’ssolution)、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。无菌的固定油通常作为溶剂或悬浮介质采用。为此，可以采用任何温和的固定油，包括合成的单甘油三酯或双甘油三酯。脂肪酸(例如，油酸)可以用于制备可注射剂。[0496]可注射制剂可以通过例如通过细菌保留过滤器过滤和/或通过加入无菌固体组合物形式的灭菌剂进行灭菌，所述无菌固体组合物可在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。[0497]为了延长活性成分的作用，通常需要减缓皮下或肌肉注射中活性成分的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶体或非晶材料的液体混悬剂来实现。活性成分的吸收速率取决于溶解速率，而溶解速率又可以取决于晶体尺寸和晶形。替代地，肠外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中来实现。可注射贮库形式通过在生物可降解聚合物(例如，聚乳酸-聚乙交酯)中形成药物的微囊化基质而制成。根据药物与聚合物的比率以及所用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其他可生物降解聚合物的实施例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。贮库可注射制剂通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。[0498]眼或耳施用[0499]在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效分子)可以以适合于眼科和/或耳科施用的制剂进行制备、包装和/或销售。此类制剂可以例如是滴眼剂和/或滴耳剂的形式，包括例如活性成分在水性和/或油性液体赋形剂中的0.1/1.0％(w/w)溶液和/或悬浮液。此类滴剂还可以包含缓冲剂、盐和/或本文所描述的任何其他成分中的一种或多种。其他有用的眼科施用制剂包括包含微晶形式的和/或在脂质体制剂中的活性成分的那些制剂。视网膜下插入物也可以用作施用形式。[0500]可检测试剂和标识[0501]刺激、ca2生物回路系统和组分、ca2效应器模块(包括sre和有效负载)可以与一种或多种放射性试剂或可检测试剂相关联或结合。[0502]这些试剂包括：各种有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光材料、发光材料(例如，鲁米诺(luminol))、生物发光材料(例如，荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白)、化学发光材料、放射性材料(例如，18f、67ga、81mkr、82rb、111in、123i、133xe、201tl、125i、35s、14c、3h或99mtc(例如，作为高锝酸盐(过锝酸盐(vii)，tco4-))、和造影剂(例如，金(例如，金纳米颗粒)、钆(例如，螯合的gd)、铁氧化物(例如，超顺磁性铁氧化物(superparamagneticironoxide，spio)、单晶铁氧化物纳米颗粒(monocrystallinenanoparticles，mion)和超小超顺磁性铁氧化物(ultrasmallsuperparamagneticironoxide，uspio))、锰螯合物(例如，mn-dpdp)、硫酸钡、碘化造影剂(碘海醇(iohexol))、微泡或全氟化碳)。[0503]在一些实施方案中，可检测试剂可以是在激活时变得可检测的不可检测前体(例如，荧光四嗪-荧光团构建体(例如，四嗪-bodipyfl、四嗪-俄勒冈绿(oregongreen)488或四嗪-bodipytmr-x)或酶可激活荧光剂(例如，(visenmedical)))。可以使用酶标识组合物的体外测定包括但不限于：酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)、免疫沉淀测定、免疫荧光、酶免疫测定(enzymeimmunoassays，eia)、放射免疫测定(radioimmunoassays，ria)和蛋白印迹分析。[0504]试剂盒[0505]本公开包括用于方便和/或有效地实施本公开的方法的多种试剂盒。通常，试剂盒将包含足够量和/或数量的成分以允许使用者进行对受试者的一次或多次治疗和/或进行一次或多次实验。[0506]在一个实施方案中，本公开提供了用于在体外或体内抑制基因的试剂盒，其包含本公开的ca2生物回路，任选地与任何其他合适的活性剂组合。[0507]试剂盒还可以包括包装和说明书和/或递送剂，以形成制剂组合物。递送剂可以包含缓冲溶液(例如，盐水)。[0508]在另外的实施方案中，提供了测定筛选试剂盒。该试剂盒包括用于筛选测定的容器。测定的使用说明和关于筛选方法的信息包括在试剂盒中。[0509]iv.应用[0510]可以利用本公开的ca2生物回路，ca2效应器模块，sres，刺激，组合物或包含刺激、ca2生物回路、ca2效应器模块中的一者或多者的系统进行多种应用，包括但不限于：治疗、诊断和预后、生物工程、生物加工、生物工厂、研究试剂、代谢组学、基因表达、酶替代等。[0511]治疗用途[0512]癌症免疫疗法[0513]癌症免疫疗法旨在诱导或恢复免疫系统对癌症的反应性。免疫疗法研究中的重大进展导致了各种策略的发展，这些策略大致可分为主动免疫疗法和被动免疫疗法。一般来说，可以利用这些策略来直接杀死癌细胞或抵消免疫抑制性肿瘤微环境。主动免疫疗法旨在诱导内源性、持久的肿瘤抗原特异性免疫应答。该应答可以通过免疫应答调节剂(例如，细胞因子)的非特异性刺激来进一步增强。相比之下，被动免疫疗法包括向宿主施用效应器免疫分子(例如，肿瘤抗原特异性细胞毒性t细胞或抗体)的方法。这种方法是短暂的，并需要多个应用程序。[0514]尽管取得了重大进展，但当前免疫疗法策略的功效受到相关毒性的限制。这些通常与免疫疗法相关联的窄治疗窗口有关，部分原因是需要将疗法剂量推至潜在致命毒性的边缘以获得具有临床意义的治疗效果。此外，由于过继转移的免疫细胞在患者体内通常不可预测地持续增殖，因此剂量在体内扩增。[0515]涉及免疫疗法的主要风险是由对肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen，taa)进行应答的正常组织表达的t细胞激活引起的on-target但offtumor副作用。利用表达t细胞受体的t细胞对抗特异性taa的临床试验报告了对免疫疗法进行应答的皮疹、结肠炎和听力损失。[0516]免疫疗法还可以产生在肿瘤细胞对免疫疗法进行应答而被杀死时出现的on-tumor毒性。副作用包括肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征和相关的巨噬细胞激活综合征。重要的是，这些副作用可能在肿瘤的破坏期间发生，因此即使是成功的on-tumor免疫疗法也可能导致毒性。因此，非常需要调控性控制免疫疗法的方法，因为这些方法具有降低毒性和使功效最大化的潜力。[0517]本公开提供了用于癌症免疫疗法的系统、组合物、免疫治疗剂和方法。这些组合物在免疫疗法中提供基因表达和功能的调节性调控。本公开还提供了ca2生物回路系统、ca2效应器模块、刺激应答元件(sre)和有效负载，以及编码上述任一项的多核苷酸。一方面，本文所描述的系统、组合物、免疫治疗剂和其他组分可以通过单独添加的刺激来控制，这为调控癌症免疫疗法提供了显著的灵活性。此外，本公开的系统、组合物和方法还可以与治疗剂(例如化疗剂、小分子、基因疗法和抗体)组合。[0518]本文所述的系统和组合物的可调性质具有改善免疫疗法效力和功效持续时间的潜力。使用本公开的组合物使过继转移细胞的生物活性可逆地沉默，这允许在不会不可挽回地杀死和终止疗法的情况下使细胞疗法的潜力最大化。[0519]本公开提供了用于在向患者施用之后免疫疗法的微调的方法。这进而又改善了免疫疗法的安全性和功效，并增加了可能受益于免疫疗法的受试者群体。[0520]在一个实施方案中，调节任何试剂的表达水平与活性的ca2生物回路系统、ca2效应器模块、sres和组分可以用于免疫疗法。作为非限制性实施例，免疫治疗剂可以是抗体及其片段和变体、癌症特异性t细胞受体(tcr)及其变体、抗肿瘤特异性嵌合抗原受体(car)、嵌合转换受体、共抑制剂受体或配体的抑制剂、共刺激受体和配体的激动剂、细胞因子、趋化因子、细胞因子受体、趋化因子受体、可溶性生长因子、代谢因子、自杀基因、归巢受体或任何在细胞和受试者中诱导免疫应答的试剂。[0521]在一些实施方案中，用于诱导免疫应答的组合物可以包含ca2效应器模块。在一些实施方案中，ca2效应器模块可以包含可操作地连接到至少一个有效负载的刺激应答元件(sre)。一方面，该有效负载可以是免疫治疗剂。[0522]在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路系统、ca2效应器模块和组合物涉及免疫治疗剂的蛋白质(有效负载)功能抗肿瘤免疫应答的翻译后调控。[0523]1.过继细胞转移(过继免疫疗法)[0524]在一些实施方案中，遗传修饰以表达至少一种ca2生物回路系统、ca2效应器模块、sre、和/或目的有效负载(例如，免疫治疗剂)的细胞可以用于过继细胞疗法(adoptivecelltherapy,act)。如本文所使用的，过继细胞转移是指具有直接抗癌活性的免疫细胞(来自自体宿主、同种异体宿主或基因修饰的宿主)的施用。act在对抗恶性和感染性疾病的临床应用中显示出前景。例如，遗传改造以识别cd19的t细胞已经用于治疗滤泡性b细胞淋巴瘤(kochenderfer等人,blood,2010,116:4099-4102；和kochenderfer与rosenberg,natrevclinoncol.,2013,10(5):267-276)，而使用遗传修饰的自体淋巴细胞以表达抗肿瘤t细胞受体的act已经被用于治疗转移性黑色素瘤(rosenberg与dudley,curr.opin.immunol.2009,21:233-240)。[0525]根据本公开，ca2生物回路和系统可以用于细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的开发和实施。可以用于细胞疗法的某些效应器模块在国际公开号wo2017/180587(其内容通过引用整体并入本文)的图7-12中给出。ca2生物回路、ca2效应器模块及其sre和有效负载可以用于细胞疗法以实现car疗法、用于tils的操纵或调控、用于同种异体细胞疗法、用于与其他治疗线(例如，放射、细胞因子)的组合t细胞疗法，用以编码工程化dtcr或经修饰tcr，或用以增强除tcr外的t细胞(例如，通过引入细胞因子基因，用于检查点抑制剂pd1、ctla4的基因)。[0526]本文提供了用于在过继细胞疗法中使用的方法。该方法包括：预处理有需要的受试者；用本公开的sre、ca2生物回路和组合物调整免疫细胞；向受试者施用；表达本文所描述组合物的工程化免疫细胞；以及，工程化细胞在受试者体内的成功移植。[0527]在一些实施方案中，本公开的sre、ca2生物回路和组合物可以用于使与过继细胞疗法相关联的预处理方案最小化。如本文所使用的，“预处理”是指向受试者施用以改善过继细胞疗法的结果的任何治疗方案。预处理策略包括但不限于全身照射和/或淋巴细胞清除化疗。没有预处理的过继疗法临床试验未能证明任何临床益处，这表明其在act中的重要性。然而，预处理与显著毒性相关联并限制了适合于act的受试者队列。在一些情况下，可以使用本公开的sre对act的免疫细胞进行工程化，以表达作为有效负载的细胞因子(例如，il12和il15)，从而减少对预处理的需要(pengram等(2012)blood119(18):4133-41；其内容通过引用整体并入)。[0528]在一些实施方案中，用于act的免疫细胞可以是树突细胞、t细胞(例如，cd8 t细胞和cd4 t细胞)、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、淋巴因子激活的杀伤(lymphokineactivatedkiller，lak)细胞、记忆t细胞、调节性t细胞(treg)、辅助性t细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞、及其任何组合。在其他实施方案中，用于act的免疫刺激细胞可以从胚胎干细胞(embryonicstemcell，esc)和诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，ipsc)生成。在一些实施方案中，自体或同种异体的免疫细胞用于act。[0529]在一些实施方案中，用于act的细胞可以是工程化的以表达car的t细胞，该car包含对目的肿瘤细胞上的抗原特异性的抗原结合结构域。在其他实施方案中，用于act的细胞可以是工程化的以表达car的nk细胞，该car包含对目的肿瘤细胞上的抗原特异性的抗原结合结构域。除了用于免疫疗法的遗传修饰的t细胞(例如，cart细胞)的过继转移之外，替代类型的、单独或与cart细胞组合地表达白细胞的car，可以用于过继免疫疗法。在一个实施例中，t细胞和nk细胞的混合物可以用于act。根据本公开，t细胞和nk细胞中cars的表达水平由结合至dd的小分子调节和控制，该dd可操作地连接至ca2效应器模块中的car。[0530]在一些实施方案中，本公开的cars可以置于t细胞中t细胞受体α常数(tcellreceptoralphaconstant，trac)基因座的转录控制下，以在增强t细胞效力的情况下实现均匀的car表达。可以使用crispr/cas9、锌指核酸酶(zincfingernucleases，zfn)、talen，然后插入car构建体，来破坏trac基因座。eyquemj.等人(2017)nature.543(7643):113-117(其内容通过引用整体并入本文)中描述了指向trac基因座的工程化car构建体的方法。[0531]在一些实施方案中，工程化以表达本组合物的nk细胞可以用于act。nk细胞激活在靶细胞中诱导穿孔素/颗粒酶依赖性细胞凋亡。nk细胞激活还诱导细胞因子分泌(例如，ifnγ、tnf-α和gm-csf)。这些细胞因子增强了巨噬细胞的吞噬功能及其抗菌活性，并经由抗原呈递细胞(例如，树突细胞(dc))的抗原呈递上调来加强适应性免疫应答(由vivier等人,nat.immunol.,2008,9(5):503-510综述)。[0532]遗传修饰的其他实施例可以包括嵌合抗原受体(cars)的引入和抑制性nk细胞受体(例如，nkg2a)的下调。[0533]也可以将nk细胞遗传地重编程以在与肿瘤细胞相互作用时规避nk细胞抑制信号。例如，使用crispr、zfn或talen来遗传修饰nk细胞以使其抑制性受体沉默，这可能增强nk细胞的抗肿瘤能力。[0534]可以使用本领域已知的多种方法离体分离和扩增免疫细胞。例如，美国专利号6,805,861和6,531,451、美国专利公开号us20160348072a1以及国际专利公开号wo2016168595a1(这些文件中的每一个的内容通过引用整体并入本文)中描述了分离和扩增细胞毒性t细胞的方法。美国专利公开号us20150152387a1、美国专利号7,435,596以及oyer,j.l.(2016).cytotherapy.18(5):653-63(这些文件中的每一个的内容通过引用整体并入本文)中描述了nk细胞的分离和扩增。具体而言，人原代nk细胞可以在存在饲养细胞(例如，已经遗传修饰以表达膜结合il15、il21、il12和4-1bbl的骨髓细胞系)的情况下扩增。[0535]在一些情况下，可以针对act富集免疫细胞亚群。国际专利公开号wo2015039100a1中教导了用于免疫细胞富集的方法。在另一个实施例中，对b和t淋巴细胞衰减标志物(lymphocyteattenuatormarker，btla)呈阳性的t细胞可以用于富集抗癌反应性的t细胞，如美国专利号9,512,401中所描述的(以上文件中的每一个的内容通过引用整体并入本文)。[0536]在一些实施方案中，用于act的免疫细胞可以耗尽选择的亚群以增强t细胞扩增。例如，可以使用美国专利公开号us20160298081a1(其内容通过引用整体并入本文)中教导的方法去除免疫细胞中的foxp3 t淋巴细胞以使抗肿瘤免疫应答最小化。[0537]在一些实施方案中，用于act的t细胞的激活和扩增由对细胞表面上瞬时表达的嵌合抗原受体(car)的抗原刺激来实现。国际专利号wo2017015427(其内容通过引用整体并入本文)中教导了此类激活方法。[0538]在一些实施方案中，免疫细胞可以由与抗原呈递细胞(antigenpresentingcells，apc)相关联的抗原激活。在一些实施方案中，apc可以是抗原特异性或非特异性的树突细胞、巨噬细胞或b细胞。apc在它们的器官中可以是自体的或同源的。在一些实施方案中，apc可以是人工抗原呈递细胞(artificialantigenpresentingcells，aapc)，例如基于细胞的aapc或无细胞aapc。基于细胞的aapcs可以选自遗传修饰的同种异体细胞(例如，人红白血病细胞)或异种细胞(例如，鼠成纤维细胞和果蝇细胞)。替代地，apc可以是无细胞的，其中抗原或共刺激结构域呈递在合成表面上(例如，乳胶珠、聚苯乙烯珠、脂质囊泡或外来体)。[0539]在一些实施方案中，本文所描述的细胞，特别是t细胞可以使用人工细胞平台进行扩增。在一个实施方案中，成熟的t细胞可以使用由seetcsetal.2017.natmethods.14,521-530(其内容通过引用整体并入本文)中描述的人工胸腺类器官(artificialthymicorganoids，ato)生成。ato基于表达δ样经典缺口配体(canonicalnotchligand,dll1)的基质细胞系。在这种方法中，基质细胞通过离心与造血干细胞和祖细胞聚集，并部署在气液界面处的细胞培养插入物上以生成类器官培养物。ato衍生的t细胞表现出初始表型、多样化t细胞受体(tcr)的所有组分(repertoire)和tcr依赖性功能。[0540]在一些实施方案中，过继细胞疗法通过自体转移进行，其中细胞源自需要治疗的受试者，并且细胞在分离和加工后向同一受试者施用。在其他情况下，act可以涉及同种异体转移，其中细胞是从供体受试者分离和/或制备的，而不是最终接受细胞疗法的接受受试者。供体和接受受试者可以在遗传上相同或相似，或者可以表达相同的hla类别或亚型。[0541]在一些实施方案中，引入用于act的免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)的多种免疫治疗剂可以由相同的ca2生物回路系统控制。在其他实施方案中，引入用于act的免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)的多种免疫治疗剂可以由不同的生物回路系统控制。在另一个实施例中，自杀基因和car构建体可以连接至两个单独的效应器模块。[0542]在使用本文所描述的sre、ca2生物回路和组合物进行遗传调整后，细胞向有需要的受试者施用。用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，在gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238、rosenberg的美国专利号4,690,915、rosenberg(2011)natrevclinoncol.8(10):577-85中描述了过继t细胞疗法方法。参见例如themelietal.(2013)natbiotechnol.31(10):928-933；tsukaharaetal.(2013)biochembiophysrescommun438(1):84-9；davilaetal.(2013)plosone8(4):e61338；这些文件中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0543]在一些实施方案中，用于act的免疫细胞可以修饰为表达一种或多种促进免疫细胞激活、浸润、扩增、存活和抗肿瘤功能的免疫治疗剂。免疫治疗剂可以是：对不同靶分子特异的第二car或tcr；细胞因子或细胞因子受体；将抑制信号转化为刺激信号的嵌合开关受体；引导过继转移细胞至靶位点(例如，肿瘤组织)的归巢受体；优化免疫细胞代谢的试剂；或者，当过继细胞转移后观察到严重事件或当不再需要转移的免疫细胞时杀死激活的t细胞的安全开关基因(例如，自杀基因)。[0544]在一些实施方案中，可以遗传地操作用于过继细胞转移的免疫细胞，以改善它们的持久性、细胞毒性、肿瘤靶向能力和体内归巢至疾病位点的能力，总体目标是进一步改善它们的杀死癌症患者的肿瘤的能力。一个实施例是将本文所描述的包含细胞因子(例如，γ-细胞因子(il2和il15))的ca2效应器模块引入至免疫细胞中，以促进免疫细胞增殖和存活。细胞因子基因(例如，γ-细胞因子il2和il15)转导至细胞中将能够在不添加外源性细胞因子的情况下繁殖免疫细胞，并且表达nk细胞的细胞因子增强了肿瘤细胞毒性。[0545]在一些实施方案中，可以利用ca2生物回路、sre或ca2效应器模块以防止t细胞耗竭。如本文所使用的，“t细胞耗竭”是指由慢性t细胞激活引起的t细胞功能的逐步和渐进性损失。t细胞耗竭是限制抗病毒和抗肿瘤免疫疗法疗效的主要因素。耗竭的t细胞具有低的增殖和产生细胞因子能力，同时具有高凋亡率和多种抑制性受体的高表面表达。t细胞激活导致的耗竭可能发生在存在抗原或不存在抗原的情况下。[0546]在一些实施方案中，可以利用在嵌合抗原受体-t细胞疗法(car-t)的情况下，ca2生物回路及其组分以防止t细胞耗竭。在这种情况下，在一些情况下，耗竭可能由细胞表面上car的scfv寡聚化引起，这导致car的细胞内结构域的持续激活。作为非限制性实施例，本公开的car可以包括不能寡聚化的scfv。作为另一个非限制性实施例，还可以选择在抗原暴露后迅速内化和再表达的cars，以防止细胞表面上的慢性scfv寡聚化。在一个实施方案中，可以将scfv的框架区域可以修饰为防止组成型car信号传递(longteal,2014.cacerresearch.74(19)s1；其内容通过引用整体并入)。本公开的调节性ca2生物回路系统还可以用于调控t细胞表面上car的表面表达，以防止慢性t细胞激活。本文所描述的car也可以工程化为使耗竭最小化。作为非限制性实施例，可以将41-bb信号传递结构域合并至car设计中，以减轻t细胞耗竭。在一些实施方案中，可以由利用longha等人公开的任何策略以防止耗竭(longahetal.(2015)naturemedicine21,581-590；其内容通过引用整体并入本文)。[0547]在一些实施方案中，可以利用本公开的ca2生物回路的调节性性质来用强直car信号传递逆转观察到的人t细胞耗竭。使用本公开的组合物使过继转移细胞的生物活性可逆地沉默可以用于逆转强直信号传递，这进而可以重振t细胞。耗竭的逆转可以通过与耗竭相关联的多种抑制性受体的下调来测量。[0548]在一些实施方案中，可以对t细胞代谢途径进行修饰，以减少t细胞对耗竭的易感性。代谢途径可以包括但不限于：糖酵解(glycolysis)、尿素循环、柠檬酸循环、β氧化、脂肪酸生物合成、戊糖磷酸途径(pentosephosphatepathway)、核苷酸生物合成、和糖原代谢途径。作为非限制性实施例，可以利用降低糖酵解速率的有效负载来限制或防止t细胞耗竭(longetal.journalforimmunotherapyofcancer2013,1(suppl1):p21；其内容通过引用整体并入)。在一个实施方案中，本公开的t细胞可以与糖酵解的抑制剂(例如，2-脱氧葡萄糖和雷帕霉素)组合使用。[0549]在一些实施方案中，可以将用于免疫疗法的、本公开的ca2效应器模块处于t细胞中的t细胞受体α基因座常数(tcellreceptoralphalocusconstant,trac)基因座的转录控制之下。eyquem等人已经表明，来自trac基因座的car的表达防止了t细胞耗竭和由过度t细胞激活造成的t细胞加速分化(eyquemj.etal(2017)nature.543(7643):113-117；其内容通过引用整体并入本文)。[0550]在一些实施方案中，本文所描述的有效负载可以连同靶向与t细胞耗竭相关联的t细胞表面标志物的抗体或片段一起使用。可以使用的与t细胞耗竭相关联的t细胞表面标志物，该t细胞表面标志物包括但不限于：ctla-1、pd-1、tgit、lag-3、2b4、btla、tim3、vista和cd96。[0551]在一个实施方案中，本文所描述的有效负载可以是cd276car(具有cd28、4-ibb和cd3ζ细胞内结构域)，cd276car未显示出与早期t细胞耗竭相关联的标志物的上调(参见国际专利公开第wo2017044699号；其内容通过引用整体并入)。[0552]在一些实施方案中，可以利用本公开的组合物以改变受试者中的til(tumorinfiltratinglymphocyte，肿瘤浸润淋巴细胞)群。在一个实施方案中，可以利用本文所描述的有效负载中的任一种以改变cd4阳性细胞与cd8阳性群的比率。在一些实施方案中，til可以离体分选并工程化为表达本文所描述的任何细胞因子。本文所描述的有效负载可以用于扩大til的cd4和/或cd8群，以增强til介导的免疫应答。[0553]2.癌症疫苗[0554]在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路、ca2效应器模块、目的有效负载(例如，免疫治疗剂)、载体、细胞和组合物可以连同癌症疫苗一起使用。[0555]在一些实施方案中，癌症疫苗可以包含源自肿瘤相关抗原(taa)的肽和/或蛋白质。可以利用此类策略以在受试者中引起免疫应答，该免疫应答在某些情况下可能是细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答。也可以对用于癌症疫苗的肽进行修饰以匹配受试者的突变谱。例如，具有与需要疗法的受试者中发现的突变相匹配的突变的egfr衍生肽已经成功用于肺癌患者(lifetal.(2016)oncoimmunology.oct7；5(12):e1238539；其内容通过引用整体并入本文)。[0556]在一个实施方案中，本公开的癌症疫苗可以是源自taa的超激动剂变构肽配体(alteredpeptideligand,apl)。这些是与天然肽序列相差一个或多个氨基酸的突变肽配体，它们比天然表位更有效地激活特异性ctl克隆。这些变构可以允许肽更好地结合至限制性i类mhc分子，或者更有利地与给定的肿瘤特异性ctl子集的tcr相互作用。apl可以使用美国专利公开号us20160317633a1(其内容通过引用整体并入本文)中教导的方法来选择。[0557]3.联合治疗[0558]在一些实施方案中，需要组合本文所描述的组合物、载体和细胞以用于向受试者施用。本文所描述的包含不同免疫治疗剂的组合物可以组合使用以增强免疫疗法。[0559]在一些实施方案中，需要将本文所描述的组合物与佐剂组合，这可以增强抗原特异性免疫应答的效力和寿命。在联合疗法中用作免疫刺激剂的佐剂包括生物分子或递送抗原的递送运载体(carriers)。作为非限制性实施例，本公开的组合物可以与生物佐剂(例如细胞因子、toll样受体、细菌毒素、和/或皂苷)组合。在其他实施方案中，本公开的组合物可以与递送运载体组合。示例性递送运载体包括聚合物微球、免疫刺激复合物、乳液(水包油或油包水)、铝盐、脂质体或病毒体。[0560]在一些实施方案中，修饰为以表达本文所描述的ca2生物回路、ca2效应器模块、sre和有效负载的效应器免疫细胞可以与本文所描述的生物佐剂组合。car与细胞因子和配体的双重调控，将靶介导激活的动力学控制与内在细胞t细胞扩增分离。这种双重调控也使对患者预处理方案的需求最小化。[0561]在一些实施方案中，被修饰以表达一种或多种抗原特异性tcr或car的效应器免疫细胞可以与本文所描述的包含转化免疫抑制性肿瘤微环境的免疫治疗剂的组合物组合。[0562]一方面，可以组合被修饰以表达对同一细胞上的不同靶分子特异性的car的效应器免疫细胞。另一方面，被修饰以表达相同car构建体的不同免疫细胞(例如nk细胞和t细胞)可以组合用于肿瘤治疗，例如，被修饰以表达cd19car的t细胞可以与被修饰以表达相同cd19car的nk细胞组合，以治疗b细胞恶性肿瘤。[0563]在其他实施方案中，被修饰以表达car的免疫细胞可以与检查点阻断剂组合。[0564]在一些实施方案中，被修饰以表达本文所描述的ca2生物回路、ca2效应器模块、sre和有效负载的效应器免疫细胞可以与本文所描述的癌症疫苗组合。[0565]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括本公开的组合物与在治疗癌症、传染病和其他免疫缺陷性障碍中有效的其他试剂(例如，抗癌剂)的组合。如本文所使用的，术语“抗癌剂”是指能够负面影响受试者的癌症的任何试剂，例如通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、降低肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展或延长患癌受试者寿命。[0566]在一些实施方案中，抗癌剂或疗法可以是化学治疗剂、或放疗、免疫治疗剂、手术、或与本公开组合来改善治疗疗效的任何其他治疗剂。[0567]在一个实施方案中，使用国际专利申请号wo2016164580(其内容通过引用整体并入本文)中教导的方法，将包含cd19car的ca2效应器模块可以与氨基嘧啶衍生物(例如，伯基特(burkitt’s)酪氨酸受体激酶(btk)抑制剂)组合使用。[0568]在一些实施方案中，本公开的组合物可以与除本文所描述的本发明疗法之外的免疫治疗(例如对肿瘤细胞表面上的一些靶分子特异性的抗体)组合使用。[0569]示例性化学疗法包括但不限于：阿西维辛(acivicin)；阿柔比星(aclarubicin)；盐酸阿可达佐(acodazolehydrochloride)；阿克罗宁(acronine)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；六甲蜜胺(altretamine)；二霉素(ambomycin)；醋酸阿美蒽醌(ametantroneacetate)；安丫啶(amsacrine)；阿纳托唑(anastrozole)；安曲霉素(anthramycin)；天冬酰胺酶(asparaginase)；阿司匹林(asperrin)，舒林酸(sulindac)，姜黄素(curcumin)，烷化剂类(alkylatingagents)，该烷化剂类包括：氮芥类(nitrogenmustards，例如二氯甲基二乙胺(mechlor-ethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil))，亚硝脲类(nitrosoureas，例如卡莫司汀(carmustine)(bcu)、洛莫司汀(lomustine)(ccnu)和司莫司汀(semustine)(甲基-ccu))，乙撑亚胺/甲基蜜胺类(thylenimines/methylmelamine)(例如，三乙撑蜜胺(thriethylenemelamine，tem)、三乙inhibitors)、甲基化抑制剂(methylationinhibitors)、蛋白酶体抑制剂(proteasomeinhibitors)、单克隆抗体(monoclonalantibodies)、氧化剂、抗氧化剂、端粒酶抑制剂(telomeraseinhibitors)、bh3模拟物(bh3mimetics)、泛素连接酶抑制剂(ubiquitinligaseinhibitors)、stat抑制剂和受体酪氨酸激酶抑制剂(例如，以格列卫(gleevac或glivac)销售的甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)和现以特罗凯(tarveca)销售的埃罗替尼(erlotinib)(一种egf受体抑制剂))；抗病毒剂(anti-virals)，例如磷酸奥司他韦(oseltamivirphosphate)、两性霉素b(amphotericinb)和帕丽珠单抗(palivizumab)；sdi1模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1(senescencederivedinhibitor1)；斯帕磷酸(sparfosicacid)；斯卡霉素d(spicamycind)；螺莫司汀(spiromustine)；斯耐潘定(splenopentin)；斯邦他汀1(spongistatin1)；角鲨胺(squalamine)；斯替匹酰胺(stipiamide)；溶基质素抑制剂(stromelysininhibitors)；硫诺辛(sulfinosine)；超活性血管活性肠肽拮抗剂(superactivevasoactiveintestinalpeptideantagonist)；维拉雷锁(velaresol)；藜芦胺(veramine)；维尔啶(verdins)；维替泊芬(verteporfin)；长春瑞滨(vinorelbine)；维卡亭(vinxaltine)；维他新(vitaxin)；伏氯唑(vorozole)；扎诺特隆(zanoterone)；折尼铂(zeniplatin)；亚苄维c(zilascorb)和净司他丁斯酯(zinostatinstimalamer)；pi3kβ小分子抑制剂，gsk2636771；泛-pi3k抑制剂(bkm120)；braf抑制剂，维莫非尼(vemurafenib，佐博伏(zelboraf))和达拉非尼(dabrafenib，泰菲乐(tafinlar))；或者，上述的任何类似物或衍生物、和变体。[0570]放射治疗剂和因素包括诱导dna损伤的辐射和波，例如γ-辐射、x-射线、uv-辐射、微波、电子发射和放射性同位素等。疗法可以通过用上面描述的形式的辐射照射局部肿瘤位点来实现。很可能的是，所有这些因素都会广泛影响dna、dna的前体、dna的复制和修复以及染色体的组装和维护的损伤。x射线的剂量范围从长时间(30至4周)每天50至200伦琴的剂量到2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并取决于同位素的半衰期、所发出辐射的强度和类型、以及肿瘤性细胞(neoplasticcells)的摄入。[0571]在一些实施方案中，化学治疗剂可以是免疫调节剂(immunomodulatoryagent)，例如来那度胺(lenalidomide,len)。最近的研究表明，来那度胺可以增强经car修饰的t细胞的抗肿瘤功能(otahaletal.,oncoimmunology,2015,5(4):e1115940)。抗肿瘤抗体的一些实施例包括托珠单抗(tocilizumab)、司妥昔单抗(siltuximab)。[0572]可与本公开的组合物组合使用的其他试剂还可以包括但不限于：影响细胞表面受体及其配体(例如，fas/fas配体、dr4或dr5/trail和gap连接物(junctions))的上调的试剂；细胞抑制剂和分化剂；细胞粘附抑制剂，例如粘着斑激酶(focaladhesionkinase,fak)抑制剂和洛伐他汀(lovastatin)；或者，增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂(例如，抗体c225)的敏感性的试剂。[0573]这种组合可以包括同时或单独地施用本公开的组合物和其他试剂。替代地，本免疫疗法可以在其他试剂/疗法之前或之后间隔数分钟、数天、数周至数月进行。[0574]4.疾病[0575]本公开提供了一种减少有需要的受试者的肿瘤体积或负荷的方法，该方法包括将本文所描述的组合物引入受试者。[0576]本公开还提供了用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的、被遗传修饰以表达至少一种本文所描述的ca2效应器模块的效应器免疫细胞。[0577]癌症[0578]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)来治疗各种癌症。如本文所使用的，术语“癌症”是指以间变性细胞(anaplasticcell)增殖为特征的各种恶性肿瘤中的任一种，所述间变性细胞倾向于侵入周围组织并转移至新的身体位点；并且还指以此类恶性肿瘤生长为特征的病理状况。癌症可以是肿瘤或血液系统恶性肿瘤，并且包括但不限于所有类型的淋巴瘤/白血病、癌(carcinomas)和肉瘤(sarcomas)，例如在肛门、膀胱、胆管、骨、脑、乳房、子宫颈、结肠/直肠、子宫内膜、食道、眼、胆囊、头颈、肝、肾、喉、肺、纵隔(胸腔)、口腔、卵巢、胰腺、阴茎、前列腺、皮肤、小肠、胃、脊髓、尾骨、睾丸、甲状腺和子宫中发现的那些癌症或肿瘤。[0579]可以用本公开的组合物治疗的癌类型包括但不限于：乳头状瘤/癌(papilloma/carcinoma)、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、内胚窦瘤(endodermalsinustumor)、畸胎瘤(teratoma)、腺瘤/腺癌(adenoma/adenocarcinoma)、黑素瘤(melanoma)、纤维瘤(fibroma)、脂肪瘤(lipoma)、平滑肌瘤(leiomyoma)、横纹肌瘤(rhabdomyoma)、间皮瘤(mesothelioma)、血管瘤(angioma)、骨瘤(osteoma)、软骨瘤(chondroma)、神经胶质瘤(glioma)、淋巴瘤/白血病(lymphoma/leukemia)、鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma)、小细胞癌(smallcellcarcinoma)、大细胞未分化癌(largecellundifferentiatedcarcinomas)、基底细胞癌(basalcellcarcinoma)和鼻窦未分化癌(sinonasalundifferentiatedcarcinoma)。[0580]可以用本公开的组合物治疗的肉瘤类型包括但不限于：软组织肉瘤，例如肺泡软组织肉瘤(alveolarsoftpartsarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、皮肤纤维肉瘤(dermatofibrosarcoma)、硬纤维肿瘤(desmoidtumor)、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤(desmoplasticsmallroundcelltumor)、骨外软骨肉瘤(extraskeletalchondrosarcoma)、骨外骨肉瘤(extraskeletalosteosarcoma)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、血管外皮细胞瘤(hemangiopericytoma)、血管内皮瘤(hemangiosarcoma)、卡波氏肉瘤(kaposi'ssarcoma)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、淋巴肉瘤(lymphosarcoma)、恶性纤维组织细胞瘤(malignantfibroushistiocytoma)、神经纤维肉瘤(neurofibrosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、滑膜肉瘤(synovialsarcoma)和阿金斯肿瘤(askin'stumor)、尤因氏肉瘤(ewing'ssarcoma)(原始神经外胚层肿瘤(primitiveneuroectodermaltumor))、恶性血管内皮瘤(malignanthemangioendothelioma)、恶性神经鞘瘤(malignantschwannoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)和软骨肉瘤(chondrosarcoma)。[0581]作为非限制性实施例，可以治疗的癌可以是急性粒细胞性白血病(acutegranulocyticleukemia)、急性淋巴细胞性白血病(acutelymphocyticleukemia)、急性髓系白血病(acutemyelogenousleukemia)、腺癌(adenocarcinoma)、腺肉瘤(adenosarcoma)、肾上腺癌(adrenalcancer)、肾上腺皮质癌(adrenocorticalcarcinoma)、肛门癌(analcancer)、间变性星形细胞瘤(anaplasticastrocytoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、阑尾癌(appendixcancer)、星形细胞瘤(astrocytoma)、基底细胞癌(basalcellcarcinoma)、b细胞淋巴瘤(b-celllymphoma)、胆管癌(bileductcancer)、膀胱癌(bladdercancer)、骨癌(bonecancer)、肠癌(bowelcancer)、脑癌(braincancer)、脑干胶质瘤(brainstemglioma)、脑肿瘤(braintumor)、乳腺癌(breastcancer)、类癌肿瘤(carcinoidtumors)、子宫颈癌(cervicalcancer)、胆管癌(cholangiocarcinoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia)、慢性粒细胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia)、结肠癌(coloncancer)、结直肠癌(colorectalcancer)、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、皮肤淋巴瘤(cutaneouslymphoma)、皮肤黑素瘤(cutaneousmelanoma)、弥漫性星形细胞瘤(diffuseastrocytoma)、导管原位癌(ductalcarcinomainsitu)、子宫内膜癌(endometrialcancer)、室管膜瘤(ependymoma)、上皮样肉瘤(epithelioidsarcoma)、食管癌(esophagealcancer)、尤因氏肉瘤(ewingsarcoma)、肝外胆管癌(extrahepaticbileductcancer)、眼癌(eyecancer)、输卵管癌(fallopiantubecancer)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、胆囊癌(gallbladdercancer)、胃癌(gastriccancer)、胃肠癌(gastrointestinalcancer)、胃肠类癌(gastrointestinalcarcinoidcancer)、胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromaltumors)、一般性肿瘤(general)、生殖细胞肿瘤(germcelltumor)、多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme)、胶质瘤(glioma)、毛细胞白血病(hairycellleukemia)、头颈癌(headandneckcancer)、血管内皮瘤(hemangioendothelioma)、霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma)、霍奇金氏病(hodgkin'sdisease)、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin'slymphoma)、下咽癌(hypopharyngealcancer)、浸润性导管癌(infiltratingductalcarcinoma)、浸润性小叶癌(infiltratinglobularcarcinoma)、炎性乳腺癌(inflammatorybreastcancer)、肠癌(intestinalcancer)、肝内胆管癌(intrahepaticbileductcancer)、浸润性乳腺癌(invasive/infiltratingbreastcancer)、胰岛细胞癌(isletcellcancer)、颌骨癌(jawcancer)、卡波氏肉瘤(kaposisarcoma)、肾癌(kidneycancer)、喉癌(laryngealcancer)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、转移性脑膜癌(leptomeningealmetastases)、白血病(leukemia)、唇癌(lipcancer)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、肝癌(livercancer)、小叶原位癌(lobularcarcinomainsitu)、低级别星形细胞瘤(low-gradeastrocytoma)、肺癌(lungcancer)、淋巴结癌(lymphnodecancer)、淋巴瘤(lymphoma)、男性乳腺癌(malebreastcancer)、髓样癌(medullarycarcinoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、黑色素瘤(melanoma)、脑膜瘤(meningioma)、默克尔细胞癌(merkelcellcarcinoma)、间充质软骨肉瘤(mesenchymalchondrosarcoma)、间充质瘤(mesenchymous)、间皮瘤(mesothelioma)、转移性乳腺癌(metastaticbreastcancer)、转移性黑色素瘤(metastaticmelanoma)、转移性鳞状颈癌(metastaticsquamousneckcancer)、混合胶质瘤(mixedgliomas)、口腔癌(mouthcancer)、粘液癌(mucinouscarcinoma)、粘膜黑色素瘤(mucosalmelanoma)、多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)、鼻腔癌(nasalcavitycancer)、鼻咽癌(nasopharyngealcancer)、颈癌(neckcancer)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、神经内分泌肿瘤(neuroendocrinetumors)、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkinlymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma)、非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer)、燕麦细胞癌(oatcellcancer)、眼癌(ocularcancer)、眼癌黑素瘤(ocularmelanoma)、少突胶质细胞瘤(oligodendroglioma)、口腔癌(oralcancer)、口腔癌(oralcavitycancer)、口咽癌(oropharyngealcancer)、成骨肉瘤(osteogenicsarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、卵巢癌(ovariancancer)、卵巢上皮癌(ovarianepithelialcancer)、卵巢生殖细胞肿瘤(ovariangermcelltumor)、卵巢原发性腹膜癌(ovarianprimaryperitonealcarcinoma)、卵巢性索间质瘤(ovariansexcordstromaltumor)、佩吉特氏病(paget'sdisease)、胰腺癌(pancreaticcancer)、乳头状癌(papillarycarcinoma)、鼻窦癌(paranasalsinuscancer)、甲状旁腺癌(parathyroidcancer)、盆腔癌(pelviccancer)、阴茎癌(penilecancer)、外周神经癌(peripheralnervecancer)、腹膜癌(peritonealcancer)、咽癌(pharyngealcancer)、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)、毛细胞星形细胞瘤(pilocyticastrocytoma)、松果体区肿瘤(pinealregiontumor)、松果体瘤(pineoblastoma)、垂体癌(pituitaryglandcancer)、原发性中枢神经系统淋巴瘤(primarycentralnervoussystemlymphoma)、前列腺癌(prostatecancer)、直肠癌(rectalcancer)、肾细胞癌(renalcellcancer)、肾盂癌(renalpelviscancer)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、唾液腺癌(salivaryglandcancer)、肉瘤(sarcoma)、肉瘤、骨瘤、肉瘤、软组织瘤、肉瘤、子宫瘤、鼻窦癌(sinuscancer)、皮肤癌(skincancer)、小细胞肺癌(smallcelllungcancer)、小肠癌(smallintestinecancer)、软组织肉瘤(softtissuesarcoma)、脊柱癌(spinalcancer)、脊柱癌(spinalcolumncancer)、脊髓癌(spinalcordcancer)、脊柱肿瘤(spinaltumor)、鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma)、胃癌(stomachcancer)、滑膜肉瘤(synovialsarcoma)、t细胞淋巴瘤(t-celllymphoma)、睾丸癌(testicularcancer)、喉癌(throatcancer)、胸腺瘤/胸腺癌(thymoma/thymiccarcinoma)、甲状腺癌(thyroidcancer)、舌癌(tonguecancer)、扁桃体癌(tonsilcancer)、移行细胞癌(transitionalcellcancer)、移行细胞癌(transitionalcellcancer)、移行细胞癌(transitionalcellcancer)、三阴性乳腺癌(triple-negativebreastcancer)、输卵管癌(tubalcancer)、管状癌(tubularcarcinoma)、输尿管癌(ureteralcancer)、输尿管癌(ureteralcancer)、尿道癌(urethralcancer)、子宫腺癌(uterineadenocarcinoma)、子宫癌(uterinecancer)、子宫肉瘤(uterinesarcoma)、阴道癌(vaginalcancer)和外阴癌(vulvarcancer)。[0582]感染性疾病[0583]在一些实施方案中，本文所描述的ca2生物回路可以用于感染性疾病的治疗。可以将本公开的ca2生物回路引入至适合于过继细胞转移的细胞(例如巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和/或t细胞)中。由本公开的ca2生物回路治疗的感染性疾病可以是由病毒、细菌、真菌和/或寄生虫引起的疾病。本公开的il15-il15ra有效负载可以用于增加免疫细胞增殖和/或用于治疗感染性疾病的免疫细胞的持久性。[0584]本文中“感染性疾病”是指由感染哺乳动物细胞，优选人细胞并导致疾病病症的任何病原体(pathogenoragent)引起的疾病。病原体的实施例包括细菌、酵母、真菌、原生动物、支原体、病毒、朊病毒和寄生虫。实施例包括涉及以下的那些病原体：(a)病毒性疾病，例如由腺病毒、疱疹病毒(例如，hsv-i、hsv-ii、cmv或vzv)、痘病毒(例如，天花或牛痘等正痘病毒)或感染性软疣病毒)、小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒或肠病毒)、正粘病毒(例如，流感病毒)、副粘病毒(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,rsv))、冠状病毒(例如，sars)、乳多空病毒(例如，乳头瘤病毒，例如引起生殖器疣、普通疣或足底疣的那些病毒)、嗜肝dna病毒(hepadnavirus)(例如，乙型肝炎病毒)、黄病毒属(flavivirus)(例如，丙型肝炎病毒或登革病毒(denguevirus))、或逆转录病毒(例如，慢病毒(如，hiv))引起的感染导致的疾病；(b)细菌性疾病，例如由例如埃希菌属(escherichia)、肠杆菌属(enterobacter)、沙门氏菌属(salmonella)、葡萄球菌属(staphylococcus)、志贺菌属(shigella)、李斯特菌属(listeria)、气杆菌属(aerobacter)、螺杆菌属(helicobacter)、克雷伯菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、假单胞菌属(pseudomonas)、链球菌属(streptococcus)、衣原体属(chlamydia)、支原体属(mycoplasma)、肺炎球菌属(pneumococcus)、奈瑟菌属(neisseria)、梭状芽孢杆菌属(clostridium)、芽孢杆菌属(bacillus)、棒状杆菌属(corynebacterium)、分枝杆菌属(mycobacterium)、弯曲杆菌属(campylobacter)、弧菌属(vibrio)、沙雷氏菌属(serratia)、普罗威登斯菌属(providencia)、色杆菌属(chromobacterium)、布鲁氏菌属(brucella)、耶尔森菌属(yersinia)、嗜血杆菌属(haemophilus)或鲍特菌属(bordetella)的细菌引起的感染导致的疾病；(c)其他感染性疾病，例如衣原体、真菌疾病(包括但不限于念珠菌病、曲菌病、组织胞浆菌病(histoplasmosis)、隐球菌脑膜炎(cryptococcalmeningitis))，寄生虫疾病(包括但不限于疟疾、卡氏肺孢子虫肺炎(pneumocystiscarniipneumonia)、利什曼病、隐孢子虫病、弓形虫病和锥体虫感染(trypanosomeinfection))、以及导致人类疾病的朊病毒(例如，克雅氏病(creutzfeldt-jakobdisease,cjd)、变异型克雅氏病(vcjd)、格斯特曼-斯特劳斯勒-舍因克综合征(gerstmann-straissler-scheinkersyndrome)、致命性家族性失眠症(fatalfamilialinsomnia)和库鲁病(kuru))。[0585]联合治疗[0586]本公开还涉及本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)与其他药物和/或其他治疗方法(例如，已知药物和/或已知治疗方法，例如目前用于治疗这些障碍的那些药物和/或治疗方法)组合，以用于治疗一种或多种形式的癌症的用途。例如，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)也可以连同一种或多种额外的抗癌治疗(例如，生物疗法、化学疗法和放疗)一起施用。因此，治疗可以包括例如伊马替尼(格列卫)、全反式视黄酸(all-trans-retinoicacid)、单克隆抗体治疗(吉妥珠单抗(gemtuzumab)、奥佐米星(ozogamicin))、化学疗法(例如，苯丁酸氮芥、强的松、强的松龙、长春新碱、阿糖胞苷、氯法拉滨(clofarabine)、法尼基转移酶抑制剂(farnesyltransferaseinhibitor)、地西他滨(decitabine)、mdr1抑制剂、利妥昔单抗(rituximab)、干扰素-α、蒽环类药物(例如，柔红霉素(daunorubicin)或伊达比星)、l-天冬酰胺酶、多柔比星、环磷酰胺、多柔比星、博来霉素、氟达拉滨、依托泊苷、喷司他丁或克拉屈滨)、骨髓移植、干细胞移植、放射疗法、抗代谢药物(甲氨蝶呤和6-巯基嘌呤)、或国际公开号wo2017/180587(其内容通过引用整体并入本文)的表5中教导的抗体中的任一种、或它们的组合。[0587]与放射的组合[0588]放射疗法(radiationtherapy)(也称为放疗(radiotherapy)、x射线疗法或放射(irradiation))是使用电离辐射来杀死癌细胞和缩小肿瘤。放射疗法可以通过外粒子束放疗(externalbeamradiotherapy，ebrt)体外施用或通过近距离放射疗法(brachytherapy)体内施用。放射疗法的效果是局部的且局限于正在治疗的区域。放射疗法可以用于治疗几乎所有类型的实体瘤，包括脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌或软组织肉瘤。放射也用于治疗白血病和淋巴瘤。[0589]与化学疗法的组合[0590]化学疗法是用可以破坏癌细胞的药物治疗癌症。在目前的使用中，术语“化学疗法”通常是指通常影响快速分裂细胞的细胞毒性药物，与靶向疗法相反。化学疗法药物以各种可能的方式干扰细胞分裂，例如dna的复制或新形成的染色体的分离。大多数形式的化学疗法靶向所有快速分裂细胞，且不是对癌细胞特异性的，尽管某些程度的特异性可能来自许多癌细胞无法修复dna损伤，而正常细胞通常可以。[0591]大多数化学疗法方案是组合给予的。示例性化学治疗剂包括但不限于：5-fu增强剂、9-ac、ag2037、ag3340、聚蛋白多糖酶抑制剂(aggrecanaseinhibitor)、氨鲁米特、安丫啶(m-amsa)、天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、巴马司他(batimastat，bb94)、bay12-9566、bch-4556、双萘二甲酰亚胺(bis-naphtalimide)、白消安、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、卡莫司坦(carmustaine) 聚苯丙生(polifeprosan)、cdk4/cdk2抑制剂、氯霉素(chlorombucil)、ci-994、顺铂、克拉屈滨、cs-682、盐酸阿糖胞苷、d2163、达克星霉素(dactinomycin)、盐酸柔红霉素、脂质体阿糖胞苷(depocyt)、dexifosamide、多西他赛、多拉斯坦(dolastain)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星、dx8951f、e7070、egfr、表柔比星(epirubicin)、促红细胞生成素(erythropoietin)、雌莫司汀磷酸钠、依托泊苷(vp16-213)、法尼基转移酶抑制剂、fk317、夫拉平度(flavopiridol)、氟脲苷(floxuridine)、氟达拉滨、氟尿嘧啶(5-u)、氟他胺、弗拉吉林(fragyline)、吉西他滨、六甲蜜胺(hmm)、羟基脲(hydroxyurea,hydroxycarbamide)、异环磷酰胺、干扰素alfa-2a、干扰素alfa-2b、白细胞介素-2、伊立替康(irinotecan)、isi641、云芝多糖(krestin)、lemonaldp2202、醋酸亮丙瑞林(lhrh释放因子类似物)、左旋咪唑(levamisole)、ligla(γ-亚麻酸锂)、碘粒子(lodineseeds)、洛美曲索(lometexol)、洛莫司汀(ccnu)、马立马司他(marimistat)、氮芥(mechlorethamine)hcl(nitrogenmustard，氮芥)、醋酸甲地孕酮、megaminegla、巯嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、米托胍腙(mitoguazone，甲基-gag；甲基乙二醛双脒腙(methylglyoxalbis-guanylhydrazone)；mgbg)、米托坦(mitotane，o.p'-ddd)、米托蒽醌、盐酸米托蒽醌、mmi270、mmp、mta/ly231514、奥曲肽(octreotide)、odn698、ok-432、口服铂、口服新型紫杉醇(taxoid)、紫杉醇(taxol.rtm.)、parp抑制剂、pd183805、喷司他丁(2'脱氧助间型霉素)、pkc412、普卡霉素、盐酸丙卡巴肼、psc833、雷利曲塞(ralitrexed)、ras法尼基转移酶抑制剂、ras致癌基因抑制剂、司莫司汀(甲基-ccnu)、链脲菌素(streptozocin)、苏拉明(suramin)、枸橼酸他莫昔芬(tamoxifencitrate)、紫杉醇类似物、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(vm-26)、硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康(topotecan)、酪氨酸激酶、uft(喃氟啶(tegafur)/尿嘧啶(uracil))、戊柔比星(valrubicin)、硫酸长春花碱、硫酸长春地辛、vx-710、vx-853、ym116、zd0101、zd0473/anormed，zd1839，zd9331。[0592]免疫肿瘤学和细胞疗法[0593]癌症免疫学领域的最新进展已经允许开发多种方法来帮助免疫系统控制癌症。此类免疫疗法方法包括通过单克隆抗体或通过体外工程化的t细胞(例如，含有嵌合抗原受体或工程化t细胞受体)的过继转移来靶向癌症抗原。[0594]在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)可以用于调整或改变或开发免疫系统以靶向一种或多种癌症。这种方法也可以与其他此类生物学方法一起考虑，例如免疫应答修饰疗法(例如，施用干扰素、白细胞介素、集落刺激因子)，其他单克隆抗体、疫苗、基因疗法和非特异性免疫调节剂也有望作为抗癌疗法与本公开的组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)组合。[0595]癌症免疫疗法是指设计为诱导患者自身免疫系统对抗癌症的多种治疗策略。在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)设计为免疫肿瘤治疗剂。[0596]细胞疗法[0597]存在多种类型的细胞免疫疗法，包括肿瘤浸润淋巴细胞(til)疗法、带有嵌合抗原受体(car)的遗传工程化t细胞、以及重组tcr技术。[0598]根据本公开，ca2生物回路和系统可以用于细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的开发和实施。在细胞疗法中有用的某些效应器模块在国际公开号wo2017/180587(其内容通过引用整体并入本文)的图8-13中给出。ca2生物回路、ca2效应器模块及其sres和有效负载可以用于细胞疗法，以实现tcr移除-tcr基因破坏、tcr工程化，从而调控在apc平台中用于刺激t细胞的、作为工具以增强体外apc刺激的表位标记受体，在体外抗原刺激中、在tcr/car组合中、在til的操作或调控中、在同种异体细胞疗法中、与其他治疗线(例如，放射、细胞因子)的组合t细胞疗法中改善t细胞扩增方法，编码工程化tcr或经修饰tcr，或者增强除tcr外的t细胞(例如，通过引入细胞因子基因，用于检查点抑制剂pd1、ctla4的基因)。[0599]在一些实施方案中，在细胞疗法的支持下获得了改善的应答率。[0600]可以通过有效负载的调控或微调(例如，t细胞、nk细胞或其他免疫相关细胞中的受体或途径组分)来实现细胞群的扩增和持久性。在一些实施方案中，将ca2生物回路、ca2生物回路的组分、sres或ca2效应器模块设计成在空间和/或时间上控制增强t细胞或nk细胞应答的蛋白表达。在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应器模块设计成在空间和/或时间上控制抑制t细胞或nk细胞应答的蛋白表达。[0601]在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应器模块设计成重塑肿瘤微环境，以扩展直接细胞杀伤以外的生物回路或药物组合物的效用。[0602]在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应器模块设计成减少、缓解或消除car细胞因子风暴。在一些实施方案中，此类减少、缓解和/或消除发生在实体瘤或肿瘤微环境中。[0603]在一些实施方案中，ca2效应器模块可以编码一种或多种细胞因子。[0604]在一方面，本公开的ca2效应器模块可以是ca2dd-cd40l多肽。调控性dd-cd40l多肽可以直接用作免疫治疗剂，或转导至效应器免疫细胞(t细胞和til细胞)中以生成具有更大体内扩增和存活能力的、用于过继细胞转移的修饰t细胞。使用调控的ca2dd-cd40l来修改肿瘤微环境并增加目前对肿瘤抗原靶向疗法而言难治的实体瘤的持久性，可以使当前过继细胞疗法中对苛刻预处理方案的需求最小化。在一些实施方案中，car表达t细胞可以用dd调控的cd40l进行装甲以在没有全身毒性的情况下减轻免疫抑制。[0605]免疫系统可以用于治疗癌症以外的疾病。可以在免疫疗法中利用ca2生物回路、ca2生物回路组分、sre或ca2效应器模块以治疗疾病，该疾病包括但不限于自身免疫性疾病、过敏、移植物抗宿主疾病、以及可能导致免疫缺陷的疾病和障碍(例如，获得性免疫缺陷综合症(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids))。[0606]在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是嵌合抗原受体(car)，当其被转导至免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)中时，可以将免疫细胞重新导向至表达由car的细胞外靶向部分识别的分子的靶标(例如，肿瘤细胞)。[0607]如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体(car)”是指模拟t细胞表面上的tcr的合成受体。一般来说，car由细胞外靶向结构域、跨膜结构域/区和细胞内信号传递/激活结构域组成。在标准car受体中，以下组分被线性构建为单个融合蛋白：细胞外靶向结构域、跨膜结构域和细胞内信号传递/激活结构域。细胞外区域包含识别特异性肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子的靶向结构域/部分(例如，scfv)。细胞内区域可以含有tcr复合物的信号传递结构域(例如，cd3ζ的信号区域)、和/或一个或多个共刺激信号传递结构域(例如，来自cd28、4-1bb(cd137)和ox-40(cd134)的那些信号传递结构域)。例如，“第一代car”仅仅具有cd3ζ信号传递结构域，而第二代car具有cd3ζ信号结构域加上一个共刺激信号传递结构域，第三代car具有cd3ζ信号传递结构域加上两个或更多个共刺激信号传递结构域。当由t细胞表达时，car赋予t细胞由car的细胞外靶向部分确定的抗原特异性。还需要添加一个或多个元件(例如，归巢基因和自杀基因)以开发更有效且更安全的car架构，从而产生所谓的第四代car。[0608]在一些实施方案中，细胞外靶向结构域通过铰链(也称为空间结构域或间隔子)和跨膜区域接合至细胞内信号传递结构域。由于靶向部分结合的靶蛋白的大小以及靶向结构域本身的大小和亲和力，可能需要改变铰链以优化car表达细胞对癌细胞的效力。在靶向部分的识别以及结合至靶细胞后，细胞内信号传递结构域引起用于cart细胞的激活信号，该信号由来自一个或多个细胞内共刺激结构域的“第二信号”进一步放大。一旦激活cart细胞，就可以破坏靶细胞。[0609]根据本公开，本公开的有效负载可以是第一代car、或第二代car、或第三代car、或第四代car。包含car构建体的代表性效应器模块实施方案在国际公开号wo2017/180587(其内容通过引用整体并入本文)的图13-18中示出。[0610]根据本公开，car的细胞外靶向部分可以是以高特异性和亲和力识别并结合至给定靶分子(例如，肿瘤细胞上的新抗原)的任何试剂。靶向部分可以是特异性结合至肿瘤细胞上的靶分子的抗体及其变体，或基于其结合至肿瘤细胞上的靶分子的能力而选自随机序列库的肽适体，或可以结合至肿瘤细胞上的靶分子的变体或其片段，或来自天然t细胞受体(tcr)的抗原识别结构域(例如，识别hiv感染细胞的cd4细胞外结构域)，或外来识别组分(例如，引起识别带有细胞因子受体的靶细胞的连接的细胞因子)，或受体的天然配体。[0611]在一些实施方案中，car构建体的靶向部分可以是靶分子的天然配体，或其能够结合靶分子的变体和/或片段。在一些方面，car的靶向部分可以是靶分子的受体。[0612]在一些实施方案中，car的靶向部分可以识别肿瘤特异性抗原(recognizeatumorspecificantigen，tsa)，例如其表达仅限于肿瘤细胞的癌症新抗原。a、n-乙酰氨基葡萄糖转移酶、neo-pap、nf-kb(核因子-κb)、神经丝(neurofilament)、nse(neuron-specificenolase，神经元特异性烯醇化酶)、notch受体、numa、n-ras、ny-br-1、ny-co-1、ny-eso-1、抑癌蛋白(oncostatin)m、os-9、oy-tes1、p53突变体、pl90minorbcr-abl、pl5(58)、pl85erbb2、pl80erbb-3、page(prostateassociatedgene，前列腺相关基因)、pap(prostaticacidphosphatase，前列腺酸性磷酸酶)、pax3、pax5、pdgfr(plateletderivedgrowthfactorreceptor，血小板衍生生长因子受体)、参与哌啶和吡咯烷利用(cytochromep450involvedinpiperidineandpyrrolidineutilization，pipa)的细胞色素p450、pml-rarα融合蛋白、pr-3(蛋白酶3)、psa(prostatespecificantigene前列腺特异性抗原)、psm、psma(prostatestemce11antigen，前列腺干细胞抗原)、prame(preferentia11yexpressedantigenofmelanoma，优先表达的黑素瘤抗原)、ptprk、rage(renaltumorantigen，肾肿瘤抗原)、raf(a-raf、b-raf和c-raf)、ras、受体酪氨酸激酶、rcas1、rgss、ror1(receptortyrosinekinase-likeorphanreceptor1，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)、ru1、ru2、sage、sart-1、sart-3、scp-1、sdccag16、sp-17(spennprotein17，精子蛋白17)、src-家族、ssx(synovialsarcomaxbreakpoint，滑膜肉瘤x断点)-1、ssx-2(hom-mel-40)、ssx-3、ssx-4、ssx-5、stat-3、stat-5、stat-6、stead、stn、生存素(survivin)、syk-zap70、ta-90(mac-2bindingprotein\cyclophilinc-associatedprotein，mac-2结合蛋白\亲环蛋白c相关蛋白)、taal6、tacstd1((tumorassociatedcalciumsignaltransducer1，肿瘤相关钙信号转导器1)、tacstd2、tag-72-4、tage、tarp(tcellreceptorgammaalternatereadingframeprotein，t细胞受体γ替代解读框架蛋白)、tel/aml1融合蛋白、tem1、tem8(内皮唾酸蛋白(endosialin)或cd248)、tgfβ、tie2、tlp、tmprss2ets融合基因、tnf-受体(tnf-α受体、tnf-β受体、或tnf-γ受体)、转铁蛋白受体、tps、trp-1(tyrosinerelatedprotein1，酪氨酸相关蛋白1)、trp-2、trp-2/int2、tsp-180、vegf受体、wnt、wt-1(威尔姆氏(wilm’s)肿瘤抗原)和xage。[0614]作为非限制性实施例，本公开的靶向部分可以是识别肿瘤特异性抗原(tsa)的scfv抗体，例如特异性识别并结合至人间皮素的抗体ss、ssi和hnl的scfv(美国专利号9,359,447)、gd2的抗体的scfv(美国专利号9,315,585)、cd19抗原结合结构域(美国专利号9,328,156)；nkg2d配体结合结构域(美国专利号9,273,283；美国专利公开号：us20160311906a1)；美国专利号9,272,002的包含seqidno.11和12的氨基酸序列的人抗间皮素scfv；抗csi结合剂(美国专利公开号：us20160075784)；抗bcma结合结构域(国际专利公开号：wo2016/014565)；美国专利号9,102,761中seqidno.:20的抗cd19scfv抗体；国际专利公开号：2016/025880的具有seqidno:59和79的氨基酸序列的gfrα4抗原结合片段；国际专利公开号：wo2016014535的具有seqidno.:47、44、48、49、50、39、40、41、42、43、45、46、51、73、70、74、75、76、65、66、67、68、69、71、72、77、195、86、83、87、88、89、78、79、80、81、82、84、85、90和196的氨基酸序列的抗cll-1(c-typelectin-likemolecule1，c型凝集素样分子1)结合结构域；国际专利公开号：wo2016014576的具有seqidno:39-46的氨基酸序列的cd33结合结构域；gpc3(glypican-3)结合结构域(国际专利公开号：wo2016036973的seqidno.:2和seqidno.:4)；gfrα4(糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol,gpi)-连接的gdnf家族α受体4细胞表面受体)结合结构域(国际专利公开号：w02016025880)；国际专利公开号：wo20160258896的具有seqidno.:480、483、485、478、158、159、160、157、217、218、219、216、276、277、278和275的氨基酸序列的cd123结合结构域；抗-ror1抗体或其片段(国际专利公开号：wo2016016344)；对gpc-3特异性的scfv(国际专利公开号：wo2016049459的seqidno.:1和24)；cspg4的scfv(国际专利公开号：w02015080981的seqidno.:2)；叶酸受体α的scfv(美国专利公开号：us20170002072a1)；这些专利文件中的每一个的内容通过引用整体并入本文。[0615]car融合多肽的细胞内结构域在结合至其靶分子后，将信号传输至效应器免疫细胞，从而激活效应器免疫细胞的至少一种正常效应器功能，该正常效应器功能包括溶细胞活性(cytolyticactivity)(例如，细胞因子分泌)或辅助细胞活性。因此，细胞内结构域包括t细胞受体(tcr)的“细胞内信号传递结构域”。在一些实施方案中，本公开的细胞内信号传递结构域可以含有称为免疫受体酪氨酸类的激活基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，itam)的信号传递基序。在一些实施方案中，本公开的细胞内区域进一步包含一个或多个共刺激信号传递结构域，其向效应器免疫细胞提供额外信号。这些共刺激信号传递结构域与信号传递结构域组合，这可以进一步改善car工程化的免疫细胞(例如，cart细胞)的扩增、激活、记忆、持久性和肿瘤根除效率。在一些情况下，共刺激信号传递区域含有一种或多种细胞内信号传递和/或共刺激分子的1、2、3或4个细胞质结构域。[0616]在本公开的一个实施方案中，本公开的car是cd19特异性car。在本公开的上下文中，ca2效应器模块可以包含可操作地连接至cd19car融合构建体的ca2dd。[0617]在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)可以用于调整或改变或开发免疫系统，从而靶向一种或多种自身反应性免疫组分(例如，自身抗体和自身反应性免疫细胞)，以减轻自身免疫性疾病。在一些实施方案中，可以利用本公开的sre来调控或调节基于嵌合自身抗体受体(chimericautoantibodyreceptor，caar)的t细胞疗法，以便优化其在治疗自身免疫性疾病中的效用(ellebrechtc.t.etal.,science.2016.jul8；353(6295):179-84；其内容通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，将ca2生物回路、sres或ca2效应器模块设计为调整treg以减轻自身免疫性障碍。[0618]在一些实施方案中，可以利用ca2生物回路、sres或ca2效应器模块来进行免疫疗法类的治疗，以减轻或缓解移植物抗宿主病(graftvs.hostdisease，gvhd)。gvhd是指干细胞或骨髓移植后，同种异体供体免疫细胞对宿主组织起反应的病症。在一些实施方案中，将ca2生物回路、sres或ca2效应器模块设计为调整用于治疗gvhd的treg。在一个实施方案中，含有编码tnf-α的ca2效应器模块的ca2生物回路可以用于调整treg以使gvhd最小化(pierini,a.etal.,blood.2016.aug11；128(6):866-71；其内容通过引用整体并入本文)。[0619]在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应器模块设计成比本领域中的其他生物回路或开关具有显著更低的免疫原性。[0620]如本文所使用的，“显著更低的免疫原性”是指可检测的免疫原性降低。在另一个实施方案中，该术语是指免疫原性呈倍数降低。在另一个实施方案中，该术语是指在满足可以施用有效量的ca2生物回路、sre或ca2效应器模块可以在而不引发可检测的免疫反应的条件下的降低。在另一个实施方案中，该术语是指在满足可以重复施用ca2生物回路、sre或ca2效应器模块而不引起免疫应答的条件下的降低。在另一个实施方案中，降低是在满足可以重复施用ca2生物回路、sre或ca2效应器模块而不引起免疫应答的条件下的降低。[0621]在另一个实施方案中，ca2生物回路、sre或ca2效应器模块的免疫原性比其未经修饰对应物或参考化合物小2倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了3倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了5倍。在另一个实施方2中，免疫原性降低了7倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了10倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了15倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了一个倍数。在另一个实施方案中，免疫原性降低了50倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了100倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了200倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了500倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了1000倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了2000倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低了另一个倍数差异。[0622]确定免疫原性的方法是本领域众所周知的，并且包括例如测量细胞因子(例如，il12、ifnα、tnf-α、rantes、mip-1α或β、il6、ifn-β或il8)的分泌、测量dc激活标志物(例如，cd83、hla-dr、cd80和cd86)的表达、或测量作为适应性免疫应答的佐剂的能力。[0623]疾病和毒素[0624]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种感染性疾病。如本文所使用的，术语“感染性疾病”是指由生物体(例如，细菌、病毒、真菌或寄生虫)引起的任何障碍。[0625]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种毒素。毒素的非限制性实施例包括蓖麻毒素(ricin)、炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、志贺毒素(shigatoxin)和志贺样毒素(shiga-liketoxin)、肉毒菌毒素(botulinumtoxins)。[0626]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种热带疾病。热带疾病的非限制性实施例包括基孔肯雅热(chikungunyafever)、登革热(denguefever)、恰加斯病(chagasdisease)、狂犬病(rabies)、疟疾、埃博拉病毒(ebolavirus)、马尔堡病毒(marburgvirus)、西尼罗河病毒(westnilevirus)、黄热病(yellowfever)、日本脑炎病毒(japaneseencephalitisvirus)、圣路易斯脑炎病毒(st.louisencephalitisvirus)。[0627]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种食源性疾病和肠胃炎(gastroenteritis)。食源性疾病和肠胃炎的非限制性实施例包括轮状病毒(rotavirus)、诺瓦克病毒(norwalkvirus)(诺如病毒(norovirus))、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、溶组织内阿米巴(entamoebahistolytica)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、金黄色葡萄球菌肠毒素b(enterotoxinbofstaphylococcusaureus)、甲型肝炎病毒(hepatitisavirus,hav)、戊型肝炎(hepatitise)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、沙门氏菌(salmonella)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)和沙门氏菌(salmonella)。[0628]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种感染性病原体(infectiousagents)。感染性病原体的非限coronavirus,mers-cov)、栖息微球菌属(micrococcussedentarius)、动弯杆菌属(mobiluncussp.)、软疣病毒属(molluscipoxvirus)、卡他莫拉菌属(moraxellacatarrhalis)、麻疹风疹病毒(morbilli-rubeolavirus)、腮腺炎病毒(mumpsvirus)、麻风分支杆菌(mycobacteriumleprae)、肺结核分支杆菌属(mycobacteriumtuberculosis)、溃疡分支杆菌属(mycobacteriumulcerans)、生殖支原体(mycoplasmagenitalium)、支原体属(mycoplasmasp.)、内罗病毒属(nairovirus)、淋病奈瑟菌属(neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌属(neisseriameningitidis)、诺卡氏菌属(nocardia)、诺瓦克病毒(norwalkvirus)、诺如病毒(norovirus)、鄂木斯克出血热病毒(omskhemorrhagicfevervirus)、乳头状瘤病毒(papillomavirus)、副流感病毒1-3(parainfluenzaviruses1-3)、副痘病毒属(parapoxvirus)、细小病毒b19(parvovirusb19)、消化链球菌属(peptostreptococccussp.)、疟原虫属(plasmodiumsp.)、脊髓灰质炎病毒i、ii和iii(poliovirusestypesi,ii,andiii)、变形杆菌属(proteussp.)、铜绿假单胞菌属(pseudomonasaeruginosa)、类鼻疽假单胞菌属(pseudomonaspseudomallei)、假单胞菌属(pseudomonassp.)、狂犬病病毒(rabiesvirus)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)、蓖麻毒素(ricintoxin)、澳洲立克次体属(rickettsiaaustralis)、康氏立克次体属(rickettsiaconori)、弗诺立克次体属(rickettsiahonei)、普氏立克次体属(rickettsiaprowazekii)、罗斯河病毒(rossrivervirus)、轮状病毒(rotavirus)、风疹病毒(rubellavirus)、圣路易斯脑炎(saintlouisencephalitis)、伤寒沙门氏菌属(salmonellatyphi)、疥螨属(sarcoptesscabiei)、sars相关冠状病毒(sars-associatedcoronavirus，sars-cov)、沙雷氏菌属(serratiasp.)、志贺毒素和志贺样毒素、志贺菌属(shigellasp.)、辛诺柏病毒(sinnombrevirus)、雪靴野兔病毒(snowshoeharevirus)、金黄色葡萄球菌属(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌属(staphylococcusepidermidis)、念珠状链杆菌属(streptobacillusmoniliformis)、肺炎链球菌属(streptococcuspneumoniae)、无乳链球菌属(streptococcusagalactiae)、无乳链球菌属(streptococcusagalactiae)、a-h组链球菌属(streptococcusgroupa-h)、肺炎链球菌属(streptococcuspneumoniae)、化脓性链球菌属(streptococcuspyogenes)、苍白密螺旋体苍白亚种(treponemapallidumsubsp.pallidum)、品他苍白密螺旋种(treponemapallidumvar.carateum)、苍白密螺旋体地方亚种(treponemapallidumvar.endemicum)、惠普尔氧障体属(tropherymawhippelii)、解脲支原体(ureaplasmaurealyticum)、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus)、天花病毒(variolavirus)、霍乱弧菌属(vibriocholerae)、西尼罗河病毒(westnilevirus)、黄热病病毒(yellowfevervirus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌属(yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)和寨卡病毒(zikavirus)。[0629]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种罕见疾病。如本文所使用的，术语“罕见疾病”是指影响一小部分群体的任何疾病。[0630]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种自身免疫疾病和自身免疫相关疾病。如本文所使用的，术语“自身免疫疾病”是指身体产生攻击其自身组织的抗体的疾病。作为非限制性实施例，自身免疫疾病可以是急性播散性脑脊髓炎(acutedisseminatedencephalomyelitis,adem)、急性坏死性出血性脑白质炎(acutenecrotizinghemorrhagicleukoencephalitis)、艾迪生病(addison’sdisease)、无丙种球蛋白血症(agammaglobulinemia)、斑秃(alopeciaareata)、淀粉样变性(amyloidosis)、强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、抗gbm/抗tbm肾炎(anti-gbm/anti-tbmnephritis)、抗磷脂综合征(antiphospholipidsyndrome,aps)、自身免疫性血管性水肿(autoimmuneangioedema)、自身免疫性再生障碍性贫血(autoimmuneaplasticanemia)、自身免疫性自主神经功能障碍(autoimmunedysautonomia)、自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis)、自身免疫性高脂血症(autoimmunehyperlipidemia)、自身免疫性免疫缺陷(autoimmuneimmunodeficiency)、自身免疫性内耳病(autoimmuneinnereardisease,aied)、自身免疫性心肌炎(autoimmunemyocarditis)、自身免疫性卵巢炎(autoimmuneoophoritis)、自身免疫性胰腺炎(autoimmunepancreatitis)、自身免疫性视网膜病变(autoimmuneretinopathy)、自身免疫性血小板减少性紫癜(autoimmunethrombocytopenicpurpura,atp)、自身免疫性甲状腺疾病(autoimmunethyroiddisease)、自身免疫性荨麻疹(autoimmuneurticaria)、轴突和神经元神经病(axonal&neuronalneuropathies)、巴洛病(balodisease)、白塞病(behcet’sdisease)、大疱性类天疱疮(bullouspemphigoid)、心肌病(cardiomyopathy)、卡斯尔门病(castlemandisease)、乳糜泻(celiacdisease)、恰加斯病、慢性疲劳综合征(chronicfatiguesyndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronicinflammatorydemyelinatingpolyneuropathy,cidp)、慢性复发性多灶性造骨髓炎(chronicrecurrentmultifocalosteomyelitis,crmo)、查格-施特劳斯综合征(churg-strausssyndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮(cicatricialpemphigoid/benignmucosalpemphigoid)、克罗恩氏病(crohn’sdisease)、柯刚氏综合征(coganssyndrome)、冷凝集素病(coldagglutinindisease)、先天性心脏阻滞(congenitalheartblock)、柯萨奇心肌炎(coxsackiemyocarditis)、crest病(crestdisease)、原发性混合型冷球蛋白血症(essentialmixedcryoglobulinemia)、脱髓鞘神经病(demyelinatingneuropathies)、疱疹样皮炎(dermatitisherpetiformis)、皮肌炎(dermatomyositis)、德维克氏病(devic’sdisease)(视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica))、盘状狼疮(discoidlupus)、德雷斯勒综合症(dressler’ssyndrome)、子宫内膜异位症(endometriosis)、嗜酸性食管炎(eosinophilicesophagitis)、嗜酸性筋膜炎(eosinophilicfasciitis)、结节性红斑(erythemanodosum)、实验性过敏性脑脊髓炎(experimentalallergicencephalomyelitis)、埃文斯综合征(evanssyndrome)、纤维肌痛(fibromyalgia)、纤维化性肺泡炎(fibrosingalveolitis)、巨细胞动脉炎(giantcellarteritis)(颞动脉炎(temporalarteritis))、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、古德帕斯丘综合征(goodpasture’ssyndrome)、肉芽肿伴多血管炎(granulomatosiswithpolyangiitis,gpa)(以前称为韦格纳肉芽肿(wegener’sgranulomatosis))、格雷夫斯病(graves’disease)、格林-巴利综合征(guillain-barresyndrome)、桥本脑炎(hashimoto’sencephalitis)、桥本甲状腺炎(hashimoto’sthyroiditis)、溶血性贫血(hemolyticanemia)、亨诺-许兰紫癜(henoch-schonleinpurpura)、妊娠疱疹(herpesgestationis)、低丙球蛋白血症(hypogammaglobulinemia)、syndrome)、横贯性脊髓炎(transversemyelitis)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、未分化结缔组织病(undifferentiatedconnectivetissuedisease,uctd)、葡萄膜炎(uveitis)、血管炎(vasculitis)、水疱性大疱性皮肤病(vesiculobullousdermatosis)、白斑病(vitiligo)和韦格纳肉芽肿病(wegener’sgranulomatosis)(现称为肉芽肿伴多血管(granulomatosiswithpolyangiitis,gpa))。[0631]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种肾脏疾病。[0632]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种心血管疾病。作为非限制性实施例，心血管疾病可以是缺血性心脏病(也称为冠状动脉疾病)、脑血管疾病(中风)、外周血管疾病、心力衰竭、风湿性心脏病和先天性心脏病。[0633]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sres或有效负载)治疗各种抗体缺乏症。作为非限制性实施例，抗体缺乏症可以是x-连锁无丙种球蛋白血症(x-linkedagammaglobulinemia,xla)、常染色体隐性无丙种球蛋白血症(autosomalrecessiveagammaglobulinemia,ara)、常见变异免疫缺陷(commonvariableimmunedeficiency,cvid)、igg(iggl、igg2、igg3和igg4)亚类缺陷、选择性iga缺乏症、特异性抗体缺乏症(specificantibodydeficiency,sad)，暂时性婴儿低丙种球蛋白血症(transienthypogammaglobulinemiaofinfancy)、抗体缺乏症伴免疫球蛋白正常或升高(antibodydeficiencywithnormalorelevatedimmunoglobulins)、选择性igm缺乏症、免疫缺陷症伴胸腺瘤(古德氏综合征(good’ssyndrome))、转钴胺素ii缺乏症(transcobalaminiideficiency)、疣、低丙种球蛋白血症、感染、骨髓粒细胞缺乏症(myelokathexis,whim)综合征、药物诱导的抗体缺乏症、κ链缺乏症(kappachaindeficiency)、重链缺乏症、减数分裂后分离(post-meioticsegregation,pms2)障碍和未指定低丙种球蛋白血症。[0634]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种眼病。作为非限制性实施例，眼病可以是甲状腺眼病(thyroideyedisease,ted)、格雷夫斯氏病(graves'disease，gd)和眼眶病(orbitopathy)、视网膜变性、白内障(cataract)、视神经萎缩、黄斑变性(maculardegeneration)、利伯先天性黑蒙(lebercongenitalamaurosis)、视网膜变性、锥杆营养失调(cone-roddystrophy)、乌谢尔综合征(ushersyndrome)、豹皮综合征(leopardsyndrome)、畏光(photophobia)和光厌恶(photoaversion)。[0635]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种神经疾病。[0636]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种心理障碍。[0637]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、的ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种肺病。作为非限制性实施例，肺病可以是石棉沉滞症(asbestosis)、哮喘、支气管扩张、支气管炎、慢性咳嗽、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease,copd)、哮吼(croup)、囊性纤维化(cysticfibrosis)、汉坦病毒、特发性肺纤维化、百日咳、胸膜炎(pleurisy)、肺炎、肺栓塞、肺动脉高压、结节病、睡眠呼吸暂停(sleepapnea)、肺活量测定法(spirometry)、婴儿猝死综合征(suddeninfantdeathsyndrome,sids)、肺结核、阿拉基综合征(alagillesyndrome)、自身免疫性肝炎、胆道闭锁(biliaryatresia)、肝硬化、ercp(endoscopicretrogradecholangiopancreatography，内窥镜逆行胰胆管造影术)和血色沉着病。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis)、卟啉症(porphyria)、原发性胆汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis)、原发性硬化性胆管炎(primarysclerosingcholangitis)。[0638]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种骨病。作为非限制性实施例，骨病可以是骨质疏松症、神经纤维瘤病、成骨不全症(osteogenesisimperfect,oi)、佝偻病、骨肉瘤、软骨发育不全、骨折(fracture)、骨髓炎、尤因氏骨瘤(ewingtumorofbone)、骨软化症、髋关节发育不良(hipdysplasia)、骨佩吉特病(pagetdiseaseofbone)、大理石骨病(marblebonedisease)、骨软骨瘤、骨癌、骨病、骨软骨炎、骨瘤(osteoma)、骨纤维异常增殖症(fibrousdysplasia)、锁骨颅骨发育不良(cleidocranialdysostosis)、破骨细胞瘤(osteoclastoma)、骨囊肿(bonecyst)、代谢性骨病、蜡油样骨病(melorheostosis)、骨痂(callus)、卡菲综合征(caffeysyndrome)和下颌骨发育不良(mandibulofacialdysostosis)。[0639]可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)治疗各种血液疾病。作为一个非限制性实施例，血液疾病可以是贫血和ckd(对于医疗保健专业人员)、再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes)、深静脉血栓形成(deepveinthrombosis)、血色沉着病、血友病、亨诺-许兰紫癜、特发性血小板减少性紫癜、缺铁性贫血(iron-deficiencyanemia)、恶性贫血(perniciousanemia)、肺栓塞、镰状细胞性贫血(sicklecellanemia)、镰状细胞性状和其他血红蛋白病(sicklecelltraitandotherhemoglobinopathies)、地中海贫血(thalassemia)、血栓性血小板减少性紫癜、维勒布兰德病(vonwillebranddisease)。[0640]中枢神经系统(centralnervoussystem，cns)[0641]在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)可以用于调整或改变或开发中枢神经系统中的蛋白质，包括脑脊液(cerebrospinal,csf)蛋白。[0642]在一些实施例中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应器模块(包括其sre或有效负载)可以用于向中枢神经系统提供调节性ert(enzymereplacementtherapy，酶替代疗法)产品。许多溶酶体贮积病(lysosomalstoragedisease,lsd)涉及中枢神经系统症状，例如智力低下、癫痫发作、严重的神经变性、行为异常和精神运动缺陷。用于lsd的ert是现代分子医学中真正的成功案例之一。ert的成功应用依赖于受控的溶酶体蛋白(例如，酶)和向中枢神经系统细胞的递送。[0643]代谢肽和激素[0644]在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路和/或其任何组分可以用于调控天然或合成的肽。天然存在的肽可以包括但不限于肽激素、利钠肽、食物肽、以及衍生物和前体。[0645]本公开的ca2生物回路和/或其任何组分也可以用于激素或其他肽药物的脉冲释放。[0646]患者分层(patientstratification)[0647]在一个实施方案中，还可以根据由患者的免疫细胞呈递的免疫原性肽对患者进行分层，并且可以利用其作为确定可以对本公开的组合物在治疗上有益的合适患者组群的参数。[0648]转基因生物体[0649]在一些实施方案中，本公开提供了表达编码本公开多肽的核酸的转基因生物体。如本文所使用的，术语“转基因生物体”是指含有人工转移的外源性遗传材料的任何非人实体。这种方法提供了在定义的细胞、组织或全部生物体中临时调控有效负载的能力。此类方法可以用于为某些疾病状态创建转基因模型，或用于研究胚胎发育。[0650]本文所描述的转基因生物体可以包括啮齿动物、鱼、爬行动物以及无脊椎动物。在优选的实施方案中，此类转基因生物体可以选自啮齿动物科，包括小鼠和大鼠。[0651]调节性调控(tunableregulations)[0652]也可以采用本公开的ca2生物回路和/或其任何组分以调控另一个ca2效应器模块(例如，包含poi的重组构建体)的表达。在一些实施方案中，ca2生物回路和/或ca2效应器模块可以包含蛋白酶(protease)(也称为肽酶或蛋白酶(proteinase))。当两种组分共同引入至细胞、组织或生物体中时，调节性蛋白酶可以将无活性构建体切割成活性构建体。[0653]在其他实施例中，还可以利用包含蛋白酶的ca2生物回路和/或ca2效应器模块以调控蛋白质加工，包括初始蛋白质产物的切割以产生更小的活性蛋白质或肽。[0654]在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路和/或其任何组分可以包含在蛋白质加工和修饰中起作用的任何因子。蛋白质翻译后修饰可包括但不限于：通过酶添加疏水性基团(例如，豆蔻酰基化(myristoylation)、棕榈酰化(palmitoylation)、异戊二烯化(isoprenylation)、异戊二烯化(prenylation)、法尼基化、香叶酰香叶酰化(geranylgeranylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)和糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,gpi)锚)；用于增强功能的辅助因子的附着(例如，脂化、黄素、磷酸泛酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)和血红素c)；小化学基团的添加(例如，酰化、甲酰化、烷基化、磷酸化、甲基化、精氨酸化(arginylation)、聚谷氨酰化(polyglutamylation)、聚甘氨酰化(polyglycylation)、丁酰化、糖基化、丙酰化、s-谷胱甘肽化、s-亚硝基化、s-磺酰化、琥珀酰化、硫酸化和乙酰化)；其他蛋白质和/或肽的连接(例如，isg化(isgylation)、sumo化(sumoylation)、泛素化、类泛素化修饰(neddylation)和pupylation)；氨基酸的化学修饰；以及，结构性变化。[0655]生物工厂(biofactories)[0656]可以采用本公开的ca2生物回路和/或其任何组分以调控生物工厂中的蛋白质生产水平。如本文所使用的，术语“生物工厂”是指遗传修饰的或未遗传修饰的细胞、组织、器官或生物体，其可以产生具有多种应用(包括治疗目的)的蛋白质(抑制剂、酶、抗体、抗原等)或具有工业价值的初级或次级产品。在一些实施例中，细胞可以是原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。[0657]在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路可以用于调控靶组织(例如，肝脏和肾脏)中产生的药物蛋白。肝脏是产生分泌蛋白的器官，该分泌蛋白包括主要血浆蛋白、止血和纤维蛋白溶解因子(factorsinhemostasisandfibrinolysis)、运载体蛋白、激素、激素原(prohormone)和载脂蛋白(apolipoprotein)、或各种通常受到严格调控的短寿命代谢肽和酶、或其他非肝脏蛋白。在上下文中，肝脏充当基因表达工厂(生物工厂)的角色，从而提供用于治疗疾病(例如代谢疾病)的蛋白质。[0658]在其他实施方案中，本公开的ca2生物回路可以用于调控用于工业加工的蛋白质。[0659]肝脏靶向[0660]肝脏是产生蛋白质并涉及血液凝固和许多代谢功能的重要器官。多种疾病都会影响肝脏，以肝脏为靶点的疾病治疗一直是一种很有前景的方法，尤其是肝脏-靶向基因疗法。可以采用本公开的ca2生物回路和/或其任何组分以调控肝脏靶向基因疗法和基因转移。[0661]可以靶向至肝脏并构建至用于调控的本ca2生物回路的蛋白质可以包括以下中的蛋白质：肝癌，例如肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)、纤维板层(fibrolamellar)hcc、胆管癌、血管肉瘤和继发性肝癌；由缺陷基因引起的遗传性障碍，例如血色沉着病、威尔逊病(wilsondisease)、酪氨酸血症(tyrosinemia)、α1抗胰蛋白酶缺乏症(alpha1antitrypsindeficiency)、糖原贮积病(glycogenstoragedisease)；由酶缺乏引起的代谢障碍，如吉尔伯特氏综合征(gilbert'ssyndrome)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症(lysosomalacidlipasedeficiency,lald)和戈谢病(gaucherdisease)；自身免疫性肝炎；脂肪肝疾病；以及，病毒性肝炎(a、b和c)。在一些实施例中，本发明的ca2生物回路可以用以指导用于肝细胞癌(hcc)的il12，并指导用于糖尿病神经病变的il10。[0662]微流体[0663]在一些实施方案中，可以在微流体装置中采用含有本公开的ca2生物回路和/或其任何组分的细胞。如本文所使用的，“微流体装置”是指在人工制造的微系统内对皮升至纳升级体积的流体的操纵。可以采用包含本公开的ca2生物回路的微流体装置来研究细胞培养模型、细胞微环境、细胞分泌物、趋化性、细胞凋亡、血管功能、神经元细胞生长、胚胎发育、单细胞代谢组学、基因表达、药物研究、细胞分离、干细胞生物学、生物反应器、三维细胞培养和组织工程。[0664]用于进行治疗的工具和试剂[0665]本公开提供了可以用于生成治疗剂(例如但不限于用于减少有需要的受试者的肿瘤体积或负担的免疫治疗剂)的工具和试剂。产生治疗剂涉及相当多的变量，例如有效负载的结构、细胞类型、基因转移方法、离体扩增的方法和时间、预处理、以及受试者体内肿瘤负荷的量和类型。可以使用本文所描述的工具和试剂优化这些参数。[0666]细胞系[0667]本公开提供已经用本公开的组合物遗传修饰的哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于人胚胎肾细胞系293、成纤维细胞系nih3t3、人结肠直肠癌细胞系hct116、卵巢癌细胞系skov-3、永生化t细胞系(例如，jurkat细胞和suptl细胞)、淋巴瘤细胞系raji细胞、nalm-6细胞、k562细胞、hela细胞、pc12细胞、hl-60细胞和nk细胞系(例如，nkl、nk92、nk962和yts)等。在一些情况下，细胞不是永生化细胞系，而是从个体获得的细胞并且在本文中称为原代细胞。例如，细胞是从个体获得的t淋巴细胞。其他实施例包括但不限于从个体获得的细胞毒性细胞、干细胞、外周血单核细胞或祖细胞。[0668]跟踪sre、生物回路和细胞系[0669]在一些实施方案中，可能需要跟踪本公开的组合物或由本文所述的组合物修饰的细胞。跟踪可以通过使用如本文所使用的、能够对输入应答来创建可检测信号的任何蛋白质的有效负载(例如，报告子部分(reportermoiety))来实现。实施例包括碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase)、β-葡萄糖醛酸酶、过氧化物酶、β-内酰胺酶、催化抗体、生物发光蛋白(例如，荧光素酶)和荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(gfp))。[0670]报告子部分可以用于在添加与sre对应的配体后监测sre的应答。在其他情况下，报告子部分可以用于在体外、体内或离体跟踪细胞存活、持久性、细胞生长、和/或定位。[0671]在一些实施方案中，优选的报告子部分可以是荧光素酶蛋白。[0672]分子伴侣(chaperone)[0673]在一些实施方案中，本公开的ca2效应器模块可以包括一种或多种分子伴侣以调控有效负载的表达。用于本公开的分子伴侣可以是细胞分子伴侣或称为药理学分子伴侣的小分子。细胞分子伴侣是指作用是稳定未折叠的客户蛋白(clientprotein)、或展开用于跨膜易位或降解的客户蛋白、和/或协助客户蛋白的正确折叠和组装的一大群不相关的蛋白质家族。分子伴侣还与蛋白稳态网络(例如，蛋白酶体系统和自噬)的其他组分合作，以促进蛋白质清除。分子伴侣家族的实施例包括：小的热休克蛋白，例如hsp25；热休克蛋白60家族蛋白，例如cpn60和groel；热休克蛋白70家族蛋白，例如dnak和bip；热休克蛋白90家族蛋白；热休克蛋白100家族蛋白，例如cip；凝集素分子伴侣，例如钙联蛋白(calnexin)和钙网蛋白(calreticulin)；以及，折叠分子伴侣，例如蛋白二硫化物异构酶(proteindisulfideisomerase,pdi)、肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidylprolylci-transisomerase,ppi)和erp57。在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是细胞分子伴侣(cellularprotein)。在不存在稳定sre的刺激的情况下，细胞分子伴侣可以结合至sre，因此无法与其客户蛋白相互作用。在存在对sre特异性的刺激的情况下，sre是稳定化的，并且分子伴侣可以与客户蛋白相互作用。在一些实施方案中，可以将本公开的有效负载附加至分子伴侣，使得有效负载的稳定性或不稳定性可以被增强。在其他实施方案中，本公开的sre可以由一种或多种分子伴侣组成。[0674]可以用于本公开的分子伴侣还可包括药理学分子伴侣，该药理学分子伴侣利用小分子来促进细胞蛋白的正确折叠和稳定。细胞蛋白的突变可以引起蛋白质错误折叠和/或聚集，最终导致蛋白质降解。已经将药理学分子伴侣设计为结合至错误折叠的靶蛋白，促进其正确折叠，从而防止其降解。在一些实施方案中，本公开的sre可以包含一种或多种错误折叠的蛋白质，并且对sre特异性的刺激可以包括一种或多种药理学分子伴侣，使得ca2效应器模块仅在存在药理学分子伴侣的情况下是稳定化的。[0675]动物模型[0676]本公开的组合物的效用和功效可以在体内动物模型(优选小鼠模型)中进行测试。使用的小鼠模型可以是同基因小鼠模型，其中小鼠细胞用本公开的组合物修饰并且在具有相同遗传背景的小鼠中进行测试。实施例包括pmel-1和4t1小鼠模型。替代地，也可以在此类研究中采用将人细胞(例如，肿瘤细胞和免疫细胞)引入至免疫缺陷小鼠中的异种移植模型。使用的免疫缺陷小鼠可以是：cbyj.cg-foxn1nu/j；b6.129s7-rag1tm1mom/j；b6.129s7-rag1tm1mom/j；b6.cb17-prkdcscid/szj；nod.129s7(b6)-rag1tm1mom/j；nod.cg-rag1tm1momprf1tm1sdz/sz；nod.cb17-prkdcscid/szj；nod.cg-prkdcscidb2mtm1unc/j；nod-scidil2rgnull；nude(nu)小鼠；scid小鼠；nod小鼠；rag1/rag2小鼠；nod-scid小鼠；il2rgnull小鼠；b2mnull小鼠；nod-scidil2rnull小鼠；nod-scid-b2mnull小鼠；米色小鼠(beigemouse)；以及，hla转基因小鼠。[0677]细胞测定[0678]在一些实施方案中，可以使用细胞测定来评估本公开的组合物作为免疫治疗剂的有效性。可以根据本领域已知的、用于鉴定蛋白质和/或定量蛋白质水平的任何方法来确定本文所述组合物的表达水平和/或同一性。在一些实施方案中，此类方法可以包括蛋白印迹、流式细胞术和免疫测定。[0679]本文提供了用于功能性表征表达本发明的sre、ca2生物回路和组合物的细胞的方法。在一些实施方案中，功能性表征在原代免疫细胞或永生化免疫细胞系中进行，并且可以通过细胞表面标志物的表达来确定。用于t细胞的细胞表面标志物的实施例包括但不限于：cd3、cd4、cd8、cd14、cd20、cd11b、cd16、cd45和hla-dr、cd69、cd28、cd44、ifnγ。用于t细胞耗竭的标志物包括：pd1、tim3、btla、cd160、2b4、cd39和lag3。用于抗原呈递细胞的细胞表面标志物的实施例包括但不限于：mhci类、mhcii类、cd40、cd45、b7-1、b7-2、ifnγ受体和il2受体、icam-1和/或fcγ受体。用于树突细胞的细胞表面标志物的实施例包括但不限于：mhci类、mhcii类、b7-2、cd18、cd29、cd31、cd43、cd44、cd45、cd54、cd58、cd83、cd86、cmrf-44、cmrf-56、以及dcir和/或dectin-1等；而在某些情况下也没有cd2、cd3、cd4、cd8、cd14、cd15、cd16、cd19、cd20、cd56和/或cd57。用于nk细胞的细胞表面标志物的实施例包括但不限于：ccl3、ccl4、ccl5、ccr4、cxcr4、cxcr3、nkg2d、cd71、cd69、ccr5、磷酸jak/stat、磷酸erk、磷酸p38/mapk、磷酸akt、磷酸stat3、粒溶素、颗粒酶b、颗粒酶k、il10、il22、ifng、lap、穿孔素和tnfa。[0680]t细胞耗竭[0681]在一些实施方案中，可以采用ca2生物回路、sres或ca2效应器模块以防止t细胞耗竭。如本文所使用的，“t细胞耗竭”是指由慢性t细胞激活造成的t细胞功能的逐步和渐进性丧失。t细胞耗竭是限制抗病毒和抗肿瘤免疫疗法功效的主要因素。耗竭的t细胞具有低增殖和细胞因子产生能力，同时具有高凋亡率和多种抑制性受体的高表面表达。t细胞激活引起的耗竭可能发生在存在抗原的情况下或不存在抗原的情况下。[0682]细胞[0683]根据本公开，提供了遗传修饰以表达本公开的至少一种ca2生物回路、sre(例如，ca2dd)、ca2效应器模块和免疫治疗剂的细胞。本公开的细胞可以包括但不限于免疫细胞、干细胞和肿瘤细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是效应器免疫细胞，包括但不限于：t细胞，例如cd8 t细胞和cd4 t细胞(例如，thl、th2、thl7、foxp3 细胞)；记忆t细胞，例如t记忆干细胞；中枢t记忆细胞；以及，效应器记忆t细胞；终末分化效应器t细胞；自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞(treg)和树突细胞(dc)；其他可以引发效应器功能的免疫细胞；或它们的混合物。t细胞可以是tαβ细idno.5810的氨基酸序列的一个或多个突变；和b.可操作地连接至第一sre的第一有效负载，其中(i)第一有效负载包括cd40l(seqidno.6)或其部分；或(ii)第一有效负载包括含有相对于seqidno.6的氨基酸序列的一个或多个突变的cd40l(seqidno.6)或其部分；ii)编码一种或多种额外多肽的第二多核苷酸，所述一种或多种额外多肽包括选自由以下组成的组的免疫治疗剂：t细胞受体(tcr)及其变体、或嵌合抗原受体(car)；其中在不存在第一刺激的情况下，第一sre的drd中的一个或多个突变中的至少一个突变使drd和第一有效负载去稳定，并且其中在存在第一刺激的情况下，第一有效负载是稳定化的，并且第二多肽独立于第一有效负载而被表达。[0691]在各种实施方案中，工程化细胞的有效负载可以包括：i)包括至少一个突变的cd40l(seqidno.6)或其部分；或ii)包括至少两个突变的cd40l(seqidno.6)或其部分，任选地，其中该至少两个突变选自：(i)h224g和g226f；(ii)h224g和g226h；(iii)y172g和g226f；(iv)h125和g227；(v)y120g、h224g和g226w；和vi)s110g、f111g、e112s、m113g、q114g和k115s。上面提供的具有第二免疫治疗剂、调控的第一免疫治疗剂(例如，cd40l)、以及包括第二免疫治疗剂的一个或多个额外多肽的示例性工程化细胞可以连接至包括第二drd的第二sre，并且在一些实施例中，第二drd与连接至第一有效负载的第一sre中的drd相同或不同，并且第二drd和第二多肽在不存在第一或第二刺激的情况下都是去稳定的，并且其中第二drd和第二多肽在存在第一或第二刺激的情况下是稳定化的。在一些实施方案中，工程化细胞包括可操作地连接至第一drd的第一有效负载(例如，cd40l)并且将第二免疫治疗剂(例如，car或tcr)引入至工程化细胞中，使得第二免疫治疗剂(例如，car或tcr)独立于第一有效负载而被表达，并且编码第二免疫治疗剂的多核苷酸可以稳定地整合至工程化细胞的基因组中，使得第二免疫治疗剂使用工程化细胞中的诱导型启动子来组成型表达或以诱导方式表达。在各种实施方案中，工程化细胞选自：cd8 t细胞、cd4 t细胞、辅助t细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、记忆t细胞、调节性t(treg)细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞、树突细胞、淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞、人胚胎干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、或其混合物。[0692]在一个实施方案中，本公开的cart细胞(包括tcrt细胞)可以是“武装(armed)”cart细胞，其用包括car的ca2效应器模块和包括细胞因子的ca2效应器模块进行转化。诱导型或组成型分泌活性细胞因子进一步武装cart细胞以改善功效和持久性。在这种情况下，这种cart细胞也被称为“装甲cart细胞”。“装甲”分子可以基于肿瘤微环境和先天性及适应性免疫系统的其他要素来选择。在一些实施方案中，该分子可以是刺激因子(例如，il2、il12、il15、il18、i型ifn、cd40l和4-1bbl)，它们已经被证明在面对敌对肿瘤微环境时通过不同的机制进一步增强cart细胞的功效和持久性(yekuetal,biochemsoctrans.,2016,44(2):412-418)。[0693]在一些实施方案中，本公开的免疫细胞可以是被修饰以表达本文教导的抗原特异性t细胞受体(tcr)或抗原特异性嵌合抗原受体(car)的nk细胞。[0694]nk细胞可以从外周血单核细胞(pbmc)分离或衍生自人胚胎干(es)细胞和诱导性多能干细胞(ipsc)。从pbmc中分离出的原代nk细胞可以被进一步扩增以用于过继免疫疗法。用于扩增nk细胞的策略和方案可以包括白细胞介素2(il2)刺激和使用自体饲养细胞，或使用遗传修饰的同种异体饲养细胞。在一些方面，nk细胞可以用刺激配体(包括il15、il21、il2、41bbl、il12、il18、mica、2b4、lfa-1和bcm1/slamf2)的组合来选择性扩增(例如，美国专利公开号us20150190471)。[0695]表达包括car和/或其他免疫治疗剂的ca2效应器模块的免疫细胞可作为癌症免疫疗法使用。免疫疗法包括作为活性成分表达car和/或其他免疫治疗剂的细胞，并且还可以包括合适的赋形剂。赋形剂的实施例可以包括上述药学上可接受的赋形剂，包括各种细胞培养基和等渗氯化钠。[0696]在一些实施方案中，本公开的细胞可以是被遗传修饰以表达本公开的组合物的树突细胞。此类细胞可以作为癌症疫苗使用。[0697]v.定义[0698]在本说明书的不同地方，本公开的组合物的特征或功能以组或范围公开。本公开特别旨在包括这些组和范围的成员的每一个和每一个单独的子组合。以下是术语定义的非限制性列表。[0699]活性：如本文所使用的，术语“活性”是指事情正在发生或正在完成的情况。本文所描述的组合物可以具有活性并且该活性可以涉及一种或多种生物事件。在一些实施方案中，生物事件可以包括细胞信号传递事件。在一些实施方案中，生物事件可以包括蛋白质与一种或多种相应蛋白质、受体、小分子或本文所描述的任何生物回路组分的相互作用相关的细胞信号事件。[0700]过继细胞疗法(act)：如本文所使用的，术语“过继细胞疗法”或“过继细胞转移”是指涉及细胞转移至患者体内的细胞疗法，其中细胞可以源自患者或源自另一个体，并且在传输回患者体内之前被工程化(改变)。治疗细胞可以源自免疫系统，例如效应器免疫细胞：cd4 t细胞；cd8 t细胞、自然杀伤细胞(nk细胞)；以及，源自切除肿瘤的b细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(til)。最常传输的细胞是体外扩增或操作后的自体抗肿瘤t细胞。例如，可以遗传地工程化自体外周血淋巴细胞以通过表达t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)来识别特异性肿瘤抗原。[0701]试剂：如本文所使用的，术语“试剂”是指生物、药物或化学化合物。非限制性实施例包括简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、受体和可溶性因子。[0702]激动剂：如本文所使用的，术语“激动剂”是指可以与受体组合来产生细胞应答的化合物。激动剂可以是直接结合至受体的配体。替代地，激动剂可以通过例如以下方式与受体非直接结合：(a)与直接结合至受体的另一种分子形成复合物；或(b)以其他方式导致另一种化合物的修饰，使得该另一种化合物直接结合至受体。激动剂可以称为特定受体或受体家族的激动剂，例如共刺激受体的激动剂。[0703]拮抗剂：如本文所使用的，术语“拮抗剂”是指抑制或降低其结合的靶标的生物活性的任何试剂。[0704]抗原：如本文所使用的，术语“抗原”定义为当其被引入至受试者中或由受试者产生时激发免疫应答的分子，例如由癌症发展本身产生的肿瘤抗原。该免疫应答可以涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞(例如，细胞毒性t淋巴细胞和t辅助细胞)的激活，或两者兼而有之。抗原可以源自生物体、蛋白质/抗原的亚基、杀死或灭活的全细胞或裂解物。在本公开的上下文中，术语“目的抗原”或“所需的抗原”是指与本公开的抗体和/或本文所描述的其片段、突变体、变体和/或改变体免疫特异性结合或相互作用的本文提供的那些蛋白质或其他生物分子。在一些实施方案中，目的抗原可以包括本文所描述的任何多肽或有效负载或蛋白质，或其片段或部分。[0705]大约：如本文所使用的，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与说明的参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中明显看出(除了该数字将超过可能值的100的情况)，术语“大约”或“约”是指落在说明的参考值的任一方向上(大于或小于)的25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更少之内的值的范围。[0706]与...相关联：如本文所使用的，术语“与...相关联”、“缀合的”、“连接的”、“附着的”和“拴系的”，当就两个或更多个部分使用时，意味着这些部分或直接或通过一个或多个用作连接剂的额外部分彼此物理关联或连接以形成足够稳定的结构，使得这些部分在使用该结构的条件下(例如，生理条件下)保持物理关联。“关联”不必严格通过直接共价化学键合。它还可能表明离子键合或氢键合或基于杂交的连接足够稳定，使得“关联”实体保持物理关联。[0707]自体的：如本文所使用的，术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料，随后该材料被重新引入至该个体中。[0708]条形码：如本文所使用的，术语“条形码”是指将一个多核苷酸或氨基酸与另一个区分开的多核苷酸或氨基酸序列。[0709]癌症：如本文所使用的，术语“癌症”是指以体内异常细胞不受控制的生长为特征的多种疾病的广泛组。不受调控的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，这些恶性肿瘤侵入邻近组织，最终通过淋巴系统或血流转移至身体的远处部位。[0710]共刺激分子：如本文所使用的，根据其在免疫t细胞激活中的含义，是指一组免疫细胞表面受体/配体，它们在t细胞与apc之间接合并在t细胞中生成刺激信号，该刺激信号与由t细胞受体(tcr)识别apc上的抗原/mhc复合物(pmhc)引起的t细胞中的刺激性信号结合。[0711]细胞因子：如本文所使用的，术语“细胞因子”是指具有多效功能的小可溶性因子家族，其由可以影响和调控免疫系统功能的许多细胞类型产生。[0712]递送：如本文所使用的，术语“递送”是指递送化合物、物质、实体、部分、货物或有效负载的行为或方式。“递送剂”是指至少部分地促进一种或多种物质(包括但不限于本公开的化合物和/或组合物)体内递送至细胞、受试者或其他生物系统细胞的任何试剂。[0713]去稳定的：如本文所使用的，术语“去稳定的(destable)”、“使...去稳定”、“去稳定区域”或“去稳定结构域”是指比相同区域或分子的起始、参考、野生型或天然形式更不稳定的区域或分子。[0714]去稳定结构域(dd):如本文所使用的，术语“去稳定结构域”是指可以可操作地连接至目的有效负载(poi)的蛋白质或其区域或结构域。在不存在dd结合配体的情况下，dd使可操作地连接的poi去稳定，使得poi在细胞内迅速降解。在存在dd结合配体的情况下，可操作地连接的poi是稳定化的，并且蛋白质功能恢复。如本文所使用的，术语“去稳定结构域”和“药物应答性结构域”(drd)是可互换的。[0715]工程化的：如本文所使用的，当本公开的实施方案被设计为具有与起始点、野生型或天然分子不同的特征或特性(无论是结构的还是化学的)时，这些实施方案是“工程化的”。[0716]表达：如本文所使用的，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一种或多种：(1)从dna序列产生rna模板(例如，通过转录)；(2)rna转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成、和/或3'末端加工)；(3)将rna翻译成多肽或蛋白质；(4)多肽或蛋白质的折叠；以及，(5)多肽或蛋白质的翻译后修饰。[0717]特征：如本文所使用的，“特征”是指特点、特性或独特元素。[0718]制剂：如本文所使用的，“制剂”至少包括本公开的化合物和/或组合物以及递送剂。[0719]片段：如本文所使用的，“片段”是指部分。例如，蛋白质片段可以包括通过消化全长蛋白质获得的多肽。在一些实施方案中，蛋白质片段包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250或更多个氨基酸。在一些实施方案中，抗体的片段包括抗体的部分。[0720]功能性：如本文所使用的，“功能性”生物分子是具有一定结构和形式的生物实体，在该结构和形式中该“功能性”生物分子表现出表征它的特性和/或活性。[0721]免疫细胞：如本文所使用的，术语“免疫细胞”是指源自骨髓中的造血干细胞的免疫系统的任何细胞，其产生两个主要谱系：骨髓祖细胞(其产生骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、巨核细胞和粒细胞)和淋巴祖细胞(其产生淋巴细胞，例如t细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞)。示例性免疫系统细胞包括cd4 t细胞、cd8 t细胞、cd4-cd8-双阴性t细胞、tγδ细胞、tαβ细胞、调节性t细胞、自然杀伤细胞和树突细胞。巨噬细胞和树突细胞可以称为“抗原呈递细胞”或“apcs”，它们是在与肽络合的apc表面上的主要组织相容性复合物(mhc)受体与t细胞表面上的tcr相互作用时可以激活t细胞的特殊的细胞。[0722]免疫疗法：如本文所使用的，术语“免疫疗法”是指通过诱导或恢复免疫系统对疾病的反应性来治疗疾病的一种类型。[0723]免疫治疗剂：如本文所使用的，术语“免疫治疗剂”是指能够通过诱导或恢复免疫系统对疾病的反应性来治疗疾病的生物的、药物的或化学的化合物。[0724]体外：如本文所使用的，术语“体外”是指在人工环境中发生的事件，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿中等，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内。[0725]体内：如本文所使用的，术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。[0726]接头：如本文所使用的，接头是指连接两个或更多个结构域、部分或实体的部分。在一个实施方案中，接头可包括10个或更多个原子。在进一步的实施方案中，接头可以包括一组原子，例如，10-1,000个原子，并且可以包括原子或组，例如但不限于碳、氨基、烷氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。在一些实施方案中，接头可包括一种或多种核酸，该核酸包括一种或多种核苷酸。在一些实施方案中，接头可包括氨基酸、肽、多肽或蛋白质。在一些实施方案中，由接头结合的部分可以包括但不限于原子、化学基团、核苷、核苷酸、核碱基、糖、核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、蛋白质复合物、有效负载(例如，治疗剂)或标志物(包括但不限于化学、荧光、放射性或生物发光的标志物)。接头可以用于任何有用的目的，例如用于形成多聚体或缀合物，以及用于施用如本文所描述的有效负载。可以合并至接头中的化学基团的实施例包括但不限于烷基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，其中每一个可任选地被取代，如本文所描述。接头的实施例包括但不限于：不饱和烷烃、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单元，例如二甘醇、二丙二醇、三甘醇、三丙二醇、四甘醇或四甘醇)和葡聚糖聚合物，其他实施例包括但不限于接头内的可切割部分，例如二硫键(-s-s-)或偶氮键(-n＝n-)，它们可以使用还原剂或光解作用进行切割。选择型切割性键的非限制性实施例包括：可以例如通过使用三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，tcep)或其他还原剂和/或光解作用进行切割的酰胺键、以及可以通过例如酸性或碱性水解进行切割的酯键。[0727]检查点/因子：如本文所使用的，检查点因子是作用于处理接合处的任何部分或分子。例如，检查点蛋白、配体或受体可以起到延缓或加速细胞周期的作用。[0728]代谢物：代谢物是由细胞内天然存在的酶催化的代谢反应的中间产物。该术语通常用于描述小分子、较大生物分子的片段或经加工产品。[0729]经修饰：如本文所使用的，术语“经修饰”是指与亲本、或参考分子、或实体相比，分子或实体的变化的状态或结构。分子可以通过多种方式进行修饰，包括化学上、结构上和功能上的修饰。在一些实施方案中，本公开的化合物和/或组合物通过引入非天然氨基酸来进行修饰。[0730]突变：如本文所使用的，术语“突变”是指变化和/或改变。在一些实施方案中，突变可以是蛋白质(包括肽和多肽)和/或核酸(包括多核酸)的变化和/或改变。在一些实施方案中，突变包括蛋白质和/或核酸序列的变化和/或改变。此类变化和/或改变可以包括一个或多个氨基酸(在蛋白质和/或肽的情况下)和/或核苷酸(在核酸和/或多聚核酸(例如，多核苷酸)的情况下)的添加、取代和/或缺失)。在一些实施方案中，其中突变包括氨基酸、和/或核苷酸的添加和/或取代，此类添加和/或取代可以包括1个或多个氨基酸和/或核苷酸残基，并且可以包括经修饰氨基酸和/或核苷酸。所产生的突变、变化或改变的构建体、分子或序列在本文中可以称为突变体。[0731]新抗原(neoantigen)：如本文所使用的，术语“新抗原”是指存在于肿瘤细胞中而不存在于正常细胞中，且不诱导胸腺中其同源抗原特异性t细胞的缺失(即，中枢耐受)的肿瘤抗原。这些肿瘤新抗原可以提供类似于病原体的“外来”信号，以诱导癌症免疫疗法所需的有效免疫应答。新抗原可以仅限于特定的肿瘤。新抗原是具有错义突变的肽/蛋白质(错义新抗原)，或者是具有来自新型可读框(novelopenreadingframes，neoorf)的长的、全新的氨基酸序列的新肽。在某些肿瘤中，neoorf可以通过框架外插入或缺失(由于dna错配修复缺陷导致微卫星不稳定)、基因融合、终止密码子通读突变或不正确剪接rna的翻译来生成(例如，saeterdaletal.,procnatlacadsciusa,2001,98:13255-13260)。[0732]脱靶：如本文所使用的，“脱靶”是指对任何一种或多种靶标、基因、细胞转录物、细胞和/或组织的任何非预期效果。[0733]可操作地连接：如本文所使用的，短语“可操作地连接”是指两个或更多个分子、构建体、转录物、实体或部分等之间的功能性连接。[0734]有效负载或目的有效负载(poi):本文中使用的术语“有效负载”和“目的有效负载(poi)”可以互换使用。目的有效负载(poi)是指与去稳定结构域(dd)可操作地连接的任何andc.g.wermuth(eds.),wiley-vch,2008和bergeetah,journalofpharmaceuticalscience,66,1-19(1977)(这些文件中的每一个通过引用整体并入本文)中可以找到合适的盐的列表。药学上可接受的溶剂化物：如本文所使用的，术语“药学上可接受的溶剂化物”是指化合物的结晶形式，其中合适溶剂的分子被合并至晶格中。例如，溶剂化物可以通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备。合适溶剂的实施例是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、n-甲基吡咯烷酮(n-methylpyrrolidinone，nmp)、二甲亚砜(dimethylsulfoxide，dmso)、n，n'-二甲基甲酰胺(n,n'-dimethylformamide，dmf)、n，n'-二甲基乙酰胺(n,n,n'-dimethylacetamide，dmac)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(1,3-dimethyl-2-imidazolidinone，dmeu)、l,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(lh)-嘧啶酮(1,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-(1h)-pyrimidinone，dmpu)、乙腈(acetonitrile，acn)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮和苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂化物被称为“水合物”。在一些实施方案中，合并至溶剂化物中的溶剂是施用该溶剂化物(例如，在药物组合物的单位剂型中)的生物体在生理上可耐受的类型或水平。[0737]稳定的：如本文所使用的，“稳定的”是指足够稳定以从反应混合物中分离得到有用纯度、并且优选能够配制成有效的治疗剂的化合物或实体。[0738]稳定化的：如本文所使用的，术语“使……稳定”(动词)、“稳定化的”、“稳定化区域”意味着使稳定或变得稳定。在一些实施方案中，稳定性是相对于绝对值测量的。在一些实施方案中，稳定性是相对于次要状态、或状态、或参考化合物、或实体测量的。[0739]标准car：如本文所使用的，术语“标准car”是指嵌合抗原受体的标准设计。包括将细胞外scfv片段、跨膜结构域、以及一个或多个细胞内结构域的car融合蛋白的组分线性构建为单一融合蛋白。[0740]刺激应答元件(sre)：如本文所使用的，术语“刺激应答元件(sre)”是接合、附着、连接至或关联至效应器模块的一个或多个有效负载的效应器模块的组分，并且在某些情况下，负责效应器模块对一种或多种刺激的应答性质。如本文所使用的，sre对刺激的“应答”性质可以以对刺激的共价或非共价相互作用、直接或间接关联、或结构反应或化学反应为特征。此外，任何sre对刺激的反应可以是程度上或种类上的问题。应答可以是部分应答。该应答可以是可逆应答。应答可能最终导致调控的信号或输出。该输出信号可以是与刺激相对的性质，例如产生1与100之间的调整效应或倍数增加或减少，例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。sre的一个非限制性实施例是去稳定结构域(dd)。[0741]受试者：如本文所使用的，术语“受试者”或“患者”是指可以向其施用根据本公开的组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)和/或植物。[0742]t细胞：t细胞是一种产生t细胞受体(tcr)的免疫细胞。t细胞可以是天然的(未暴露于抗原；与tcm相比，cd62l、ccr7、cd28、cd3、cd127和cd45ra的表达增加，cd45ro的表达减少)、记忆t细胞(tm)(抗原处理过的(antigen-experienced)和长期存活的)和效应器细胞(抗原处理过的、细胞毒性的)。tm可以进一步分为中央记忆t细胞亚群(tcm，与天然t细胞相比，cd62l、ccr7、cd28、cd127、cd45ro和cd95的表达增加，cd54ra的表达减少)和效应器记忆t细胞亚群(tem，与天然t细胞或tcm相比，cd62l、ccr7、cd28、cd45ra的表达减少，cd127的表达增加)。效应器t细胞(te)是指与tcm相比cd62l、ccr7、cd28的表达减少、并且对颗粒酶和穿孔素呈阳性的抗原处理过的cd8 细胞毒性t淋巴细胞。其他示例性t细胞包括调节性t细胞，例如cd4 、cd25 (foxp3 )调节性t细胞和tregl7细胞，以及tr1、th3、cd8 cd28-和qa-1限制性t细胞。[0743]t细胞受体：t细胞受体(tcr)是指具有可变抗原结合结构域、恒定结构域、跨膜区和短胞质尾区的免疫球蛋白超家族成员，其能够特异性结合至与mhc受体结合的抗原肽。tcr可以在细胞表面上或以可溶形式存在，并通常由具有α和β链(也分别称为tcrα和tcrβ)、或γ和δ链(也分别称为tcrγ和tcrδ)的异源二聚体组成。tcr链(例如，α链、β链)的细胞外部分含有两个免疫球蛋白结构域：位于n末端处的可变结构域(例如，α链可变结构域或vα、β链可变结构域或vβ)，以及与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如，α链恒定结构域或cα、和β链恒定结构域或cβ)。与免疫球蛋白类似，可变结构域含有由框架区域(fr)分隔的互补决定区(complementarydeterminingregion,cdr)。tcr通常与cd3复合物关联以形成tcr复合物。如本文所使用的，术语“tcr复合物”是指通过cd3与tcr的关联形成的复合物。例如，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同源二聚体、tcrα链和tcrβ链组成。替代地，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同源二聚体、tcrγ链和tcrδ链组成。如本文所使用的，“tcr复合物的组分”是指tcr链(即，tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ)，cd3链(即cd3γ、cd3δ、cd3ε或cd3ζ)，或由两条或更多条tcr链或cd3链形成的复合物(例如，tcrα和tcrβ的复合物，tcrγ和tcrδ的复合物，cd3ε和cd3δ的复合物，cd3γ和cd3ε的复合物，或tcrα、tcrβ、cd3γ、cd3δ和两条cd3ε链的亚tcr复合物)。[0744]治疗有效量：如本文所使用的，术语“治疗有效量”意味着待递送试剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)在向患有或易感感染、疾病、障碍和/或病症的受试者施用时足以治疗、诊断、预防所述感染、疾病、障碍和/或病症，改善所述感染、疾病、障碍和/或病症的症状，和/或推迟所述感染、疾病、障碍和/或病症的发作的量。在一些实施方案中，治疗有效量以单剂量提供。在一些实施方案中，治疗有效量以包括多个剂量的剂量方案施用。本领域技术人员将理解的是，在一些实施方案中，如果单位剂型包括作为该剂量方案的部分施用时有效的量，则可以认为该单位剂型包括治疗有效量的特定试剂或实体。[0745]治疗或处理：如本文所使用的，术语“治疗”或“处理”表示用于获得有益或期望的结果(包括且优选有益或期望的临床结果)的方法。此类有益或期望的临床结果包括但不限于以下一项或多项：降低(或破坏)癌细胞或其他患病细胞的增殖、降低癌症中存在的癌细胞的转移、缩小肿瘤的大小、减少疾病引起的症状、增加患病者的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延缓疾病的进展和/或延长个体的生存期。[0746]调节(tune)：如本文所使用的，术语“调节”意味着对刺激应答或朝着特定结果调整、平衡或适应某一事物。在一个非限制性实施例中，本公开的sre和/或dd利用对特定刺激和/或环境应答来调整、平衡或适应它们所附加、附着或关联的组合物的功能或结构。[0747]等效物和范围[0748]本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定根据本文描述的本公开的具体实施方案的许多等效物。本公开的范围不旨在限于上述描述，而是如所附权利要求中所阐述的。[0749]在权利要求中，除非有相反的指示或以其他方式从上下文中明显看出，否则诸如“一”、“一个”和“该”的冠词可以意味着一个或多个。除非有相反的指示或以其他方式从上下文中明显看出，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、用于或以其他方式相关于给定的产品或过程，则认为一个组的一个或多个成员之间包括“或”的声明或描述得到满足。本公开包括以下实施方案：组的一个成员恰好存在于、用于或以其他方式相关于给定的产品或过程。本公开包括以下实施方案：多于一个或整个组成员存在于、用于或以其他方式相关于给定的产品或过程。[0750]还应注意，术语“包括”旨在是开放的，并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。因此，当本文使用术语“包括”时，也涵盖和公开了术语“由……组成”。[0751]在给出范围的情况下，端点包括在内。此外，应当理解的是，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中明显看出，否则表示为范围的值可以假定本公开的不同实施方案中所述范围内的任何特定值或子范围，至范围下限的十分之一单位，除非上下文另有明确规定。[0752]此外，应当理解的是，落入现有技术内的本公开的任何特定实施方案可以明确地从任何一项或多项权利要求中排除。由于此类实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，因此即使在本文中没有明确阐述排除，它们也可以被排除。本公开的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)可以出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在有关。[0753]应当理解，已经使用的词语是描述性词语而不是限制性词语，并且在更广泛的方面不脱离本公开的真实范围和精神的情况下可以在所附权利要求的范围内做出改变。[0754]虽然本公开已经关于几个所描述的实施方案以一定的长度和一些特殊性进行了描述，但并不旨在将其限制在任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案内，而是应该是参考所附权利要求进行解释，以便根据现有技术提供对这些权利要求的最广泛可能的解释，并因此有效地涵盖本公开的预期范围。本公开通过以下非限制性实施例进行进一步说明。[0755]实施例[0756]实施例1.t细胞中cd40l的体外调控[0757]生成由碳酸酐酶dd调控的cd40l构建体，并将其克隆至慢病毒载体中。将纯化的t细胞解冻并与acd3acd28免疫磁珠一起培养(以3个珠子对1个t细胞的比率)。[0758]第二天在t细胞中转导构建体。添加病毒后48小时，使用50mm乙酰唑胺或媒介物对照(dmso)测试配体依赖性调控。添加配体后24小时，将t细胞进行用于cd40l表达的染色并使用facs进行分析。在存在乙酰唑胺的情况下，与媒介物对照和表达无插入物的空载体的t细胞相比，ot-001990表现出cd40l表达的增加。在cd4 和cd8 t细胞中测量对乙酰唑胺剂量增加应答的cd40l表达。细胞用乙酰唑胺处理24小时，并使用facs测量cd40l表达。结果以表10中的中值荧光强度和表11中cd40l阳性细胞的百分比示出。[0759]表10.cd40lmfi[0760]乙酰唑胺(μm)cd4 cd8 0.011121050.051231040.21851360.84813073.184038012.5278315995037282184[0761]表11.cd40l阳性细胞百分比[0762]乙酰唑胺(μm)cd4 cd8 0.014.130.590.055.440.440.210.31.480.845.625.23.169.341.212.590.377.25091.180.7[0763]如表10和表11所示，在cd4 t细胞和cd8 t细胞中均观察到配体依赖性调控，然而，cd4 细胞中的绝对mfi值和cd40l阳性细胞百分比更高。在人可达到的配体水平内实现了cd40l稳定所需的乙酰唑胺的量。[0764]实施例2.t细胞中体外cd40l的时程调控[0765]生成由碳酸酐酶dd调控的cd40l构建体，并将其克隆至慢病毒载体中。将纯化的t细胞解冻并与acd3acd28免疫磁珠一起培养(以3个珠子对1个t细胞的比率)。[0766]将构建体转导在t细胞中，并用50mm乙酰唑胺或媒介物对照(dmso)给药48小时。还评估了空载体(ev)和组成型cd40l(ot-001661；氨基酸seqidno.6067和核酸seqidno.6068)的对照。在2、4、6、8、24和48小时时固定细胞，然后对t细胞进行用于cd40l表达的染色并使用facs进行分析。结果以表12中的中值荧光强度和表13中cd40l阳性细胞的百分比示出。[0767]表12.cd40lmfi[0768][0769]表13.cd40l阳性细胞百分比[0770][0771]在存在乙酰唑胺的情况下，与媒介物对照和表达无插入物的空载体的t细胞相比，ot-001990表现出cd40l表达的增加。在cd4 和cd8 t细胞中测量对乙酰唑胺剂量增加应答的cd40l表达。如表12和表13所示，在cd4 t细胞和cd8 t细胞中均观察到配体依赖性调控。cd4 细胞中的绝对mfi值和cd40l阳性细胞百分比更高。表达在24小时时达到峰值，最高剂量表达高于组成型水平。[0772]实施例3.通过ca2对t细胞中cd40l的调控[0773]为了测试调控，用ca2调控的cd40l(ot-001990)和cd40l的对照(ot-001661)慢病毒地转导激活的t细胞。两天后，如表14中所描述的，用媒介物或50mm配体处理细胞24小时，然后分析它们的cd40l表面表达。cd4 和cd8 细胞以及总细胞的结果如下所示。表中，“acz”为乙酰唑胺。[0774]表14:表达cd40l的细胞的百分比[0775][0776]用去稳定结构域调控的表达显著增强了超过内源性水平的cd40l表达。ca2去稳定结构域显示出接近组成型表达的水平，配体剂量接近临床相关水平。[0777]实施例4.通过ca2衍生的去稳定结构域对cd40l的调控[0778]使用以下构建体测试了多种碳酸酐酶dd对cd40l的调控：ot-001990、ot-002072、ot-002073、ot-001968、ot-001969、ot-001970、ot-001971、ot-002074、ot-002075、ot-002076、ot-002077。her293t细胞用构建体瞬时转染。用10mm乙酰唑胺处理细胞24小时，并使用流式细胞术测量cd40l的细胞表面表达。结果在表15中示出，其中sr表示稳定率。[0779]表15:表达cd40l的细胞的百分比[0780]构建体dmso乙酰唑胺srot-00199012.441.83.37ot-00196813.447.63.55ot-00207712.223.61.93ot-00207415.533.52.16ot-00207514352.50ot-0020761432.32.31[0781]测试的所有构建体都显示出配体依赖性稳定，稳定性比大于1。ot-001990和ot-001968表现出最高的稳定比值。当在hek293t细胞中测试以下构建体时，观察到cd40l的类似配体依赖性稳定：ot-002072、ot-002073、ot-001968、ot-001969、ot-001970和ot-001971。[0782]在t细胞中进行剂量应答研究。用表16中所示的构建体转导细胞。在转导后第4天和第9天进行乙酰唑胺剂量应答研究。实验一式两份地进行(本文称为“重复1”和“重复2”)。结果作为通过流式细胞术分析的cd40l的中值荧光强度提供在表16和表17中。[0783]表16：剂量应答研究-第4天[0784][0785]表17：剂量应答研究-第9天[0786][0787]表16和表17中的结果表明，当用乙酰唑胺处理时，基于碳酸酐酶dd的cd40l调控在调控cd40l表达方面是有效的。与cd8阳性细胞相比，cd4阳性细胞显示出cd40l表达增加更多，这可能是由于cd4细胞中的内源性cd40l表达。[0788]健康供体人t细胞被激活、用ot-001990的表达cd40l的慢病毒载体(lv)进行转导、并使用acd3acd28免疫磁珠进行扩增。t细胞在扩增后第9天冷冻。在第3天、第8天、解冻后和解冻后用acd3和acd28重新刺激24小时后，将乙酰唑胺添加至细胞。在添加配体后24小时，对t细胞进行用于cd40l表达的染色。结果在表18中示出。[0789]表18.在ot-001990t细胞中cd40l的表达[0790]乙酰唑胺(剂量μm)第4天第9天解冻后解冻后 刺激0.012821789950.053103191759540.23813391809990.8111964119814063.123811486273231412.555172970525435550542731436884860[0791]如表18所示，在解冻后重新刺激的细胞中观察到调控，但在没有重新刺激的细胞中没有观察到调控。这些数据表明cd40l的调控对t细胞激活状态敏感。[0792]健康供体人t细胞被激活、用表达cd40l的慢病毒载体(lv)转导、扩增并冷冻。同种异体人单核细胞分化为单核细胞衍生的树突细胞(modc)并同样地冷冻。用置于培养物中48小时的、新鲜解冻的细胞建立体外培养物。收集上清液并通过中尺度发现(mesoscalediscovery,msd)分析白细胞介素12(il12)。结果在表19中示出。在表19中，乙酰唑胺表示为“acz”。[0793]表19：il12表达[0794]描述pg/mlil-12modc 空载体0.18modc 空载体(刺激)5.84modc ot-001990dmso0.52modc ot-001990 刺激0.84modc ot-00199050μmacz0.40modc ot-00199050μmacz 刺激472.28[0795]类似于cd40l调控，由cd40l表达t细胞的il12表达对t细胞激活状态敏感。[0796]实施例5.ca2cd40l-cart细胞的调控[0797]为了在car的背景下测量由本公开的生物回路调节的cd40l表达的效果，将表达本文所描述的任何ca2cd40l-car构建体的t细胞与单核细胞衍生的树突细胞(dc)共培养。[0798]通过将1×104dc添加至具有1×105nalm6和1×105car t细胞的培养物中来建立体外培养物。在培养物中添加细胞的同时添加50mm乙酰唑胺。24小时后收集上清液并通过msd测定分析ifng和il-12。组成性表达cd40l有效负载的ot-001661(seqidno.6067；由seqidno.6068编码)作为对照使用。结果提供在表20中。[0799]表20:ifn和il12水平[0800][0801]除dc ot-001990外，所有组的上清液中的il12分泌增加。在dc ot-001407 nalm6、dc ot-001605 nalm6、dc ot-002156媒介物 nalm6、和dc ot-002156 50mm乙酰唑胺 nalm6上清液中观察到可检测的ifnγ水平。用ot-002156观察到ifnγ的配体依赖性调控。这些数据表明，car驱动的t细胞激活在体外诱导自体dc产生cd40l依赖性il-12。[0802]实施例6.用cd40l减少脱落[0803]为了测量作为用接头序列替换切割位点的结果的cd40l表达和脱落的影响，hek293t细胞用cd40l对照(ot-001661)、ca2调控的cd40l(ot-001990)或ca2调控的cd40l-shed(ot-002172)进行瞬时转染，并用媒介物(dmso)或10mm乙酰唑胺(acz)处理24小时，然后通过elisa分析细胞培养基中的可溶性cd40l。如表21所示，当切割位点被接头序列替换时，观察到减少的脱落(reducedshedding)。[0804]表21:可溶性cd40l(scd40l)[0805][0806][0807]额外地，将ot-001990和ot-02172转染至稳定转导的jurkat细胞中，然后用一定剂量的乙酰唑胺(acz)处理细胞24小时，阳性cd40l 细胞百分比和mfi在表22中示出。[0808]表22：24小时后，阳性cd40l细胞百分比和mfi[0809][0810]虽然本公开已经关于几个所描述的实施方案以一定的长度和一些特殊性进行了描述，但并不旨在将其限制于任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案，而是应该是参考所附权利要求进行解释，以便根据现有技术提供对这些权利要求的最广泛可能的解释，并因此有效地涵盖本公开的预期范围。[0811]本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，章节标题、材料、方法和实施例仅是说明性的而不旨在是限制性的。当前第1页12当前第1页12
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