一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法

1.本发明属于端粒酶活性检测领域，特别涉及一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法。


背景技术：

2.端粒存在于染色体末端，是一个形似“帽子”的结构，它会随着正常细胞的有丝分裂过程逐渐变短，与细胞的衰老和凋亡息息相关。而端粒酶是一种可以维持染色体长度的逆转录酶，它会在染色体的末端持续的添加(ttaggg)n碱基序列，使端粒在有丝分裂过程中维持长度。端粒酶普遍存在于人体的细胞中，但是在大多数的细胞中端粒酶是不具备活性的，除了造血细胞、生殖细胞以及干细胞。一旦体细胞中的端粒酶活性异常，通常与癌肿和肿瘤疾病的发生有关，因此端粒酶成为癌症等疾病的重要靶标分子。目前人们开发了多种对端粒酶活性进行检测的方法，希望解决癌症早期诊断和治疗方面存在的问题。如传统的端粒扩增法具有高的特异性，但也有扩增错误、耗时较长，样品量大等问题。最近新开发的荧光光谱，表面增强拉曼光谱，电化学分析等方法新颖，但仍存在探针易猝灭，信号响应差以及仪器昂贵等局限性。
3.本课题组致力于纳米孔对端粒酶活性的高效检测，力求操作的简单可行，便于集成化。固态纳米孔是一种由无机材料制成的单分子分析传感器，与生物纳米孔相比，固态纳米孔具有较高的物理和化学稳定性，表面改性能力以及独特的机械强度和纳米精度，大大开拓了纳米孔传感平台在实际中的应用。鉴于传统纳米孔传感中，实现酶等特异性识别，多借助于纳米孔通道内分子修饰，该方法具有一定的优势，但修饰过程中难免引起纳米孔芯片损坏，同时酶的修饰效率低，且修饰后的纳米孔用途单一。本课题组于2021年2月申请的公开号为cn112795565a、名称为“检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法”的专利文件，公开了一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法。该发明所述的检测探针是在金纳米球和表面覆盖的标记巯基dna引物，该引物以au-s键连接，实现金球表面dna序列的高密度覆盖。当端粒酶加入后，以引物为模板，进行端粒延伸。在端粒延伸的动力学过程中，不同长度的dna覆盖在金纳米球表面。该酶促反应的产物在固态纳米孔中具有明显的信号差异，实现了固态纳米孔对端粒酶活性的实时高灵敏监测。上述发明将dna线性长度的变化转化为dna-金纳米球的复合结构在纳米孔中的体积变化，实现了信号放大，同时可对端粒酶活性进行动态监测。


技术实现要素：

4.为了进一步提高端粒酶活性检测的灵敏度和可靠性、降低采用纳米孔检测端粒酶活性的成本，并提供一种在检测过程中结构更加稳定可控的检测探针，在上述公开专利cn112795565a技术方案的基础上，本课题组对端粒酶活性的直接检测进行了进一步的优化设计，本发明以dna自组装的金纳米二聚体为检测探针，其中两个金球之间的dna连接链与端粒酶引物序列(tp)杂交互补。当端粒酶加入后，以引物为模板进行端粒延伸，从而引发二
聚体的解离；金纳米二聚体和单体在纳米孔中具有更高的信噪比，易于信号识别，且克服了传感检测中纳米孔尺寸及修饰等限制；同时两种组装形式如同on-off开关，不受dna、其他酶干扰因素的影响，更高效直观的实现端粒酶活性的检测，同时该发明具有更低的样本检出限，且检测过程操作简单，充分体现了纳米孔的高灵敏、高通量的优势。
5.本发明所采用的技术方案是：
6.第一方面，本发明提供一种检测探针，用于端粒酶活性高灵敏度检测，所述检测探针包括：以两个金纳米颗粒(aunps)载体、分别修饰金纳米颗粒的双嵌段dna1和双嵌段dna2、作为端粒酶作用位点的端粒酶引物序列tp；
7.所述双嵌段dna1和双嵌段dna2均包括锚定链和连接链，所述双嵌段dna1和双嵌段dna2的锚定链均为polya序列，所述锚定链用于锚定所述金纳米颗粒，因此所述锚定链的长度由所述金纳米颗粒的直径决定，以与金纳米颗粒圆周长相近为佳，利用a碱基与金的强吸附作用缠绕在金纳米颗粒表面，既可以屏蔽其他分子的干扰，同时可以实现金纳米颗粒的单分子标记，有利于检测探针结构的稳定性；所述双嵌段dna1的连接链前段与端粒酶引物序列部分互补或完全互补、后段与dna2连接链部分互补或完全互补，从而形成稳定的二聚体结构；所述双嵌段dna1的连接链前段指的是与双嵌段dna1锚定链直接相连的序列。
8.优选的，端粒酶引物序列tp的长度为15-20nt，进一步优选的，其序列如seq id no.3所示，具体为5’aatccgtcgagcagagtt3’；
9.优选的，所述双嵌段dna1的连接链序列长度为20-30nt，所述双嵌段dna2的连接链序列长度为5-8nt。
10.优选的，所述双嵌段dna1序列如seq id no：1所示且所述双嵌段dna2序列如seq id no：2所示；
11.或优选的，所述双嵌段dna1序列如seq id no：4所示且所述双嵌段dna2序列如seq id no：5所示；
12.或优选的，所述双嵌段dna1序列如seq id no：6所示且所述双嵌段dna2序列如seq id no：7所示；
13.优选的，所述金纳米颗粒尺寸范围在5-20nm，最佳尺寸为5nm，以5nm的金纳米颗粒作为dna序列的载体，该尺寸的金纳米颗粒均一稳定，更易于dna单分子标记组装，具有最佳的组装效率，且其大小尺寸在纳米孔传感器形成高信噪比的易位信号，同时相对于单一的dna链，可以极大地降低dna在易位过程中的速度，提高检测的灵敏度。
14.上述检测探针的制备方法，主要包括如下步骤：
15.步骤(1)：以金纳米颗粒为载体，采用不同序列的双嵌段dna即双嵌段dna1和双嵌段dna2分别修饰aunps，经修饰后获得aunps-dna1复合物和aunps-dna2复合物；
16.步骤(2)：将端粒酶引物序列tp、dntps、aunps-dna1复合物、aunps-dna2复合物混合孵育，获得交杂混合物；在此过程中，aunps从单颗粒的分散状态变为二聚体状态；
17.进一步的，所述步骤(1)中，采用不同序列的双嵌段dna即双嵌段dna1和双嵌段dna2分别修饰aunps具体包括：将aunps溶液均等的分成两份相同的部分，分别用双嵌段dna1和dna2以1:100的摩尔浓度比例修饰，并将其混合物在25℃混合孵育持续24小时；每30min添加pbs缓冲液加强aunps与dna之间的连接；添加的pbs缓冲液的终浓度为0.1m，可以实现加强aunps与dna之间的连接的目的，同时标记dna后的金纳米颗粒具有高的耐盐性，能够有效
防止在高离子强度溶液中产生聚集的现象；然后用0.1m pbs进行盐析，在25℃下孵育持续24小时完成，得到两种aunps-dna复合物；将产物进行离心后重复洗涤，优选的，所述离心的条件为：转速12500rpm，时间：30min；优选的，所述离心后重复洗涤至少洗涤三次以上，以除去过量的dna；将aunps-dna复合物新悬浮在0.1m pbs溶液(ph 7.4)溶液中保存。
18.进一步的，所述步骤(2)中，所述混合孵育的温度条件为25℃，孵育时间约为1-3h。
19.第二方面，本发明提供一种包含上述检测探针的检测试剂盒。
20.本发明提供一种端粒酶活性检测试剂盒，主要包括上述检测探针、dntps和该端粒酶逆转录缓冲液。
21.采用试剂盒与待测端粒酶提取液混合，所述的酶促反应体系包括：端粒酶底物引物、dntps和该端粒酶逆转录缓冲液，选取一定浓度的端粒酶和dntps、混合孵育在37℃下共同孵育1h，酶促反应中，dntp底物远远过量，保证反应充分进行。
22.第三方面，本发明提供一种端粒酶活性的直接检测方法，所述方法包括如下步骤，
23.步骤(1):取上述步骤制备的检测探针，加入端粒酶逆转录缓冲液和反应碱基dntp将反应物混合均匀，加入端粒酶提取液，混合均匀，在37℃条件下反应；
24.步骤(2)：在反应一段时间后，加入十二烷基硫酸钠sds溶液终止端粒酶的延伸反应，在降温后，离心去除上清液，使用超纯水溶液复溶，重复三次；
25.步骤(3)：将反应产物加入纳米孔检测液池一侧，其中纳米孔的直径与所述探针的金纳米颗粒尺寸匹配，所述纳米孔的直径为金纳米颗粒直径的2-5倍为宜，优选的纳米孔的直径24
±
2nm，施加不同偏置电压进行信号检测，使用膜片钳记录轨迹电流信号，获得反应物在不同电压下的电流脉冲信号，通过对脉冲信号的幅值和滞留时间进行特征提取和统计分析可以实现对端粒酶活性的高灵敏监测。
26.优选地，所述步骤(3)中,根据所选的检测探针中金纳米载体为5nm，选用直径24
±
2nm的固态纳米孔传感器进行信号检测。施加不同偏置电压进行信号检测，使用膜片钳记录轨迹电流信号，获得反应物在不同电压下的电流脉冲信号。通过对脉冲信号的幅值和滞留时间进行特征提取和统计分析可以实现对端粒酶活性的高灵敏监测。
27.有益效果：
28.如图1所示，本发明提供的检测探针，用于端粒酶活性高灵敏性检测，是由金纳米表面标记的dna序列互补杂交组装而成的dna-aunps二聚体复合物，在且仅在端粒酶活性存在下诱发二聚体发生解聚，因为在端粒酶活性作用下，会触发检测探针上的端粒酶引物延伸，从而导致dna2链被置换下来，导致检测探针二聚状态发生解离，形成单颗粒分散状态，在本发明提供的检测探针中，双嵌段dna1的连接链前段与端粒酶引物序列互补，形成双链增强了二聚体结构的刚性，同时该序列与端粒酶特异性作用，引发端粒的延伸；
29.本发明提供的检测探针利用碱基互补关系形成稳定的二聚体结构，具有结构稳定性和特异性，探针的解离仅与端粒酶活性有关，不受其他dna、蛋白质等生物背景的影响；
30.本发明所述的端粒酶活性的直接检测方法，利用检测探针的二聚体状态和单体状态切换，在固态纳米孔传感器中进行过孔信号检测，由于这两种状态具有不同的体积形貌，在纳米孔中具有高的信噪比，同时产生明显差异性电流信号，可以获得对端粒酶活性进行操作简单且具备超高灵敏度；
31.本发明所述的端粒酶活性的直接检测方法，将dna自组装的金纳米组装体与纳米
孔无标记高灵敏的特性结合，实现了端粒酶活性直接检测，克服了纳米孔传感中，检测分子对纳米孔尺寸相近的要求，以及现有的纳米孔道修饰及再加工的繁琐，具有操作简单的优势，有助于纳米孔传感器的在体细胞中端粒酶的活性异常检测中的推广和应用。
附图说明
32.图1为本发明所述纳米孔用于端粒酶活性检测的原理示意图；
33.图2为金纳米aunp-dna1探针的序列结构优化设计图；
34.图3为金纳米aunp-dna2探针和引物tp dna3的序列结构优化设计图；
35.图4为金纳米颗粒二聚体和单体tem图；
36.图5为端粒酶活性反应物在纳米孔中信号图；
37.图6为不同数量细胞中端粒酶活性与金纳米二聚体比例之间的线性关系；
38.图7为纳米孔检测中端粒酶活性的特异性图，其中，te代表端粒酶,aa代表抗坏血酸,lzm代表溶菌酶、gsh代表谷胱甘肽；
39.图8为表1中检测探针采用组合1中的dna序列所形成的碱基互补关系示意图。
具体实施方式
40.下面结合说明书附图和具体实施例来对本发明的技术方案做进一步的说明。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第四版，原版，m.r.格林、j.萨姆布鲁克著)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，以下实施例中dna溶液、pbs溶液和tbe溶液都是使用超纯水配制。
41.实施例1：检测探针的设计
42.本发明提供一种检测探针，用于端粒酶活性高特异性高灵敏性检测，所述检测探针包括：以两个金纳米颗粒(aunps)为载体、分别修饰两个金纳米颗粒二聚体的双嵌段dna1和双嵌段dna2、端粒酶引物序列tp dna3；其中金纳米颗粒直径5nm，易于dna单分子标记组装，具有最佳的组装效率，同时在纳米孔中具有高的信噪比和检测通量；其中，端粒酶引物序列为aatccgtcgagcagagtt；双嵌段dna1和双嵌段dna2的锚定链均为polya
40
序列，dna1的连接链前段与端粒酶引物序列互补、后段与dna2连接链部分互补，从而形成稳定的组装体结构；当端粒酶加入，随着端粒(ttaggg)n延伸，由于端粒序列与dna1连接链后段具有更强的杂交作用，从而引起dna2置换，实现金纳米颗粒的解离。
43.为了保证制备的检测探针具有较高的识别能力，针对dna1序列的识别功能进行了设计，如表1所示为较佳的三种组合序列设计，表1所示目前所选的三种dna1序列，如图2中(a)图所示，所选序列与引物、dna2具有高特异性，且与此同时不会形成如图2中(b)图和图3中(c)图所示的局域的环、茎突结构，能够保证后续与引物、dna2杂交作用过程中的精准匹配，同时制备的检测探针的解离仅与端粒酶活性有关，不受其他dna、蛋白质等生物背景的影响；如表1所示dna2和dna3的tp序列也进行了优化设计，如图3中的(a)图和(b)分别为dna2和tp dna3的线性序列，且不同组合中的dna2和dna3和dna1具有相应的较佳的组合效率。
44.表1：检测探针中的dna序列较佳组合及具体的序列sequence
[0045][0046][0047]
实施例2：检测探针的制备
[0048]
步骤(1)：取实验所需要的直径为5nm的aunps配置成总体积量为400ul、浓度为200nm的aunps溶液，将400ul的aunps溶液分为两等份后，分别用浓度为2mm的双嵌段dna1和双嵌段dna2各取20ul以1:100的摩尔比例进行孵育反应，在25℃混合培养持续24小时，具体的，本实施例dna1和dna2的序列分别如表1中的seq id no.1，seq id no.2所示；
[0049]
步骤(2)：在步骤(1)所得到的产物中每30分钟添加pbs缓冲液至终浓度为0.1m为止获得初样品；
[0050]
步骤(3)：将步骤(2)得到的初样品用0.1m pbs进行盐析，该过程同样是在25℃下孵育持续24小时完成，得到两种aunps-dna复合物；
[0051]
步骤(4)：将步骤(3)得到的产物在25℃下以12500rpm的转速离心30分钟，重复洗涤3次以除去过量的dna，并将aunps-dna复合物重新悬浮在ph 7.4、浓度为0.1m的pbs的溶液中保存；
[0052]
步骤(5)：分别取50ul步骤(4)中制备的两种aunps-dna复合物混合，加入序列如seq id1 no.3所示的端粒酶引物tp在25℃下共同孵育1h，获得杂交混合物；得到的产物在25℃下以12500rpm的转速离心30分钟，重复洗涤3次以除去过量的dna，并将aunps重新悬浮在ph 7.4、浓度为0.1m的pbs的溶液中。如图8所示，为本实施例检测探针的各dna序列所形成的碱基互补关系示意图。
[0053]
实施例3：端粒酶活性检测
[0054]
采用实施例2中制备的检测探针进行端粒酶活性检测，以氮化硅纳米孔为传感反应器。具体选用直径24nm的固态纳米孔传感器进行信号检测。
[0055]
端粒酶酶促反应：在实施例2步骤(5)获得的杂交混合物中加入20ul端粒酶逆转录缓冲液(20mm tris-hcl，ph 8.3，1mm edta，0.05％tween 20，63mm kcl，0.1mg/ml bsa，1.5mm mgcl2),100mm dntp溶液2ul和18ul超纯水，混合均匀，再加入10ul端粒酶提取液，混合均匀，放置到摇床上反应，反应条件为37℃，500rpm，共同孵育1h。
[0056]
端粒酶酶促反应后的产物溶液加入10ul 1％质量比的sds溶液；将制备的不同浓度的端粒酶延伸反应产物，放置到4℃降温约半小时，使用8000rpm离心去除沉淀，使用冷冻
离心机25℃，15000rpm离心30min，使用超纯水溶液复溶，重复三次。
[0057]
所述的端粒酶提取液，来自hela细胞，使用细胞裂解液对培养的hela细胞进行裂解提取其中的端粒酶，冰浴10min，使用冷冻离心机4℃,15000rpm进行离心，并分装保存在-80℃的冰箱内储存。
[0058]
如图4为端粒酶前后的金纳米颗粒的tem图；其中，(a)图为加入端粒酶前的金纳米二聚体tem图。该载体包括金纳米颗粒(aunps)及标记的双嵌段dna1链和dna2链，其中双嵌段dna1与dna2链的一端为polya锚定链，可以特异性包覆在金纳米颗粒表面，同时另一端为连接序列，通过dna1部分碱基与dna2发生杂交反应从而引起金纳米颗粒的组装。dna组装形成的纳米颗粒二聚体，可以与端粒酶引物杂交互补，在加入端粒酶和dntps混合孵育后，随着端粒(ttaggg)n延伸，由于端粒序列与dna1后段具有更强的杂交作用，从而引起使其dna1与dna2解链，实现金纳米颗粒的解离。因此二聚体状态的aunps又分解成为图(b)单颗粒状态。
[0059]
氮化硅纳米孔传感反应器的准备和调试：将氮化硅纳米孔用食人鱼溶液(h2so4：h2o2为3：1体积比混合)清洗，90℃水浴锅中，反应15分钟后，氮化硅表面的杂质被清除，在水溶液条件下转化为si-oh；将清洗后的纳米孔装置于检测流体中，检测液池被氮化硅薄膜分割成两个室，然后将两个agcl电极分别置于两个室内，电极引出来与膜片钳(axopatch 700b)装置连接。当施加100-1000mv电压后，电场分布在纳米孔及其附近，溶液中的离子在电场驱动下，通过纳米孔，形成离子电流；当kcl浓度为100mm时，电流基线平稳；电流信号通过16位的daq数字卡采集，采样频率为≥100khz，如图5中的(a)图为上述氮化硅纳米孔的基线电流信号图，可以看出在上述电压驱动下，基线电流保持平稳。
[0060]
将dna修饰的金球单体加入纳米孔检测液池，在100mm kcl溶液中，因金球和dna都带负电，在电压驱动下，单体向正极运动，产生一系列脉冲信号，如图5中的(b)图所示，为修饰后的aunps的随机事件的电流轨迹信号图，可以看出经过dna修饰的aunps通过纳米孔产生了电流堵塞信号；
[0061]
将dna组装的二聚体加入纳米孔检测液池，在800mv的电压驱动下，因金球和dna都带负电，二聚体向正极运动，产生一系列电流幅值和滞留时间都显著增加的脉冲信号，如图5中的(c)图所示；为dna组装的金纳米二聚体反应物过孔的随机事件的电流信号，与单独的dna修饰的aunps的过孔电流信号相比，当dna修饰的aunps和tp的混合物通过纳米孔时，由于dna修饰的aunps再与tp共同孵育后，导致了au二聚体的形成，产生了电流幅值更大、滞留时间更长的过孔电流信号；
[0062]
将组所制备的aunps-dna二聚体探针与端粒酶及引物序列反应后的产物加入纳米孔，此时二聚体的信号消失，产生一系列电流幅值明显减小的金纳米单体的脉冲信号；如图5中的(d)图所示，在添加dntps和端粒酶共同孵育之后，其产物产生的的电流幅值变小和滞留时间减少表明这是由dna修饰的单颗粒状态aunps易位引起的离子电流。离子脉冲电流的变化是由于端粒酶的存在而引起的端粒酶引物序列的延伸以及dna2置换反应引起的，dna序列之间的变化进一步导致了aunps聚集状态的改变——au二聚体解聚恢复成单颗粒状态的aunps；
[0063]
将图5中的(c)图二聚体产生的脉冲信号和(d)图解聚后的金纳米单体产生的脉冲信号进行对比分析，具体分析两者脉冲信号在电流幅值、滞留时间以及发生频率这三个参数上的区别，经过统计分析后从而得出纳米孔电信号与端粒酶活性的线性关系。
[0064]
图6中(a)图为不同数量hela细胞中端粒酶提取物对不同种类信号的响应比率的直方图。随着hela细胞的数量从0增加到2000，由于端粒酶存在而触发的端粒酶引物序列的伸长，更多的dna2链被置换下来，同时更多的au二聚体将解聚集变为单个aunps，导致二聚体信号的比率展现出一个下降趋势的曲线；图6中(b)图为不同数量细胞与au二聚体解聚程度之间的线性关系，以3σ/s的信噪比计算检测限lod为94个细胞，其中σ是对照组的标准偏差，而s是线性回归曲线的斜率。
[0065]
图7为本发明方法对端粒酶和不同干扰物质的特异性图，为了验证所提出的检测端粒酶活性的方法的特异性，在细胞提取物中检测到了共存的干扰物质，例如抗坏血酸(aa)，溶菌酶(lzm)和谷胱甘肽(gsh)，图7中显示的结果表明，与端粒酶相比，所有这些干扰物种对au二聚体聚集状态均没有明显的影响，显示了该方法的高特异性和可靠的选择性。