一种探针引物及其用于松贝/青贝专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途与流程

一种探针引物及其用于松贝/青贝专属性检测的荧光定量pcr检测方法和用途
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，涉及药物鉴别检测方法，尤其涉及一种探针引物及其用于松贝/青贝专属性检测的荧光定量pcr检测方法和用途。


背景技术：

2.川贝母是常用大宗药材，被视为止咳化痰良药。《中国药典》川贝母的基原收录了百合科植物的6个物种，即川贝母fritillaria cirrhosa d.don、暗紫贝母f.unibracteatahsiao et k.c.hsia、甘肃贝母f.przewalskii maxim.、梭砂贝母f.delavayi franch.、太白贝母f.taipaiensis p.y.li或瓦布贝母f.unibracteata hsiao et k.c.hsia var.wabuensis(s. y.tang et s.c.yue)z.d.liu,s.wang et s.c.chen，按性状差异又可分为松贝、青贝、炉贝及栽培品。传统认为川贝母以松贝和青贝为佳，市场价格最贵，其他贝母冒充或者掺伪的现象比较多见。松贝和青贝对应的物种为川贝母、暗紫贝母和甘肃贝母。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种探针引物及其用于松贝/青贝专属性检测的荧光定量pcr检测方法和用途。所述探针引物和检测方法能够用于药材、饮片及相关产品(如成方制剂)中松贝和/或青贝的定性或定量检测，从而客观评价川贝母药材、饮片及相关产品的质量和等级划分，具有重要的实用价值和应用前景。
4.一方面，本发明提供了一种探针引物。所述探针引物其由seq id no：1-21所示的 dna序列组成。
5.另一方面，本发明提供了一种用于松贝/青贝专属性检测的荧光定量pcr检测方法。所述方法包括下述步骤：
6.称取贝母样品及样品前处理；
7.从所述样品中提取dna并制备dna模板；及
8.选择探针引物；
9.优化反应条件；
10.根据不同的检测需求，设定不同的判定依据；其中对于定性检测，根据设定的ct 值临界点(如ct《35)判定是否检出；对于半定量检测，根据与阳性对照的ct值之差的绝对值作为判定依据，差值越小，含量越高；对于定量检测，一方面同时设置标准品 (s)，另一方面采用同体系中双探针标记进行扩增，即包括目的探针(p)和内参探针 (c)；供试品中目的探针(p)和内参探针(c)的定量检测比值可表示为
△
ct (t)，相应的标准品可表示为
△
ct(s)，
△△
ct＝
△
ct(t)
‑△
ct(s)从而目的 dna(松贝/青贝)所占比例计算公式可表示为：供试品(t)/标准品(s)％＝2
‑△△
ct绝对值
×
100％；
11.其中，所述方法能够用于检测所述样品中是否含有松贝/青贝；所述探针引物为序列号为seq id no1-21的探针引物。
12.在一些实施方式中，每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
13.在一些实施方式中，所述样品为中药材、饮片或成方制剂。
14.在一些实施方式中，所述提取dna的步骤采用紫外分光光度法进行定量和纯度测定。
15.在一些实施方式中，所述反应条件包括：94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火 30～60s,60℃收集荧光。根据所选反应预混液性质的不同，反应条件可进行调整。
16.另一方面，本发明提供了所述探针引物的用途，其中，所述探针引物为序列号为 seq id no：和/或所示的探针引物；所述探针引物通过荧光定量pcr检测方法实现松贝/青贝专属性检测。
17.在一些实施方式中，每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
18.在一些实施方式中，检测的所述样品为中药材、饮片或成方制剂。
19.另一方面，本发明提供了一种试剂盒。所述试剂盒含有上述探针引物，并且所述试剂盒用于松贝/青贝专属性检测。
附图说明
20.图1为探针引物的专属性测试。只有在检测松贝/青贝的3个基原时出现阳性扩增，瓦布贝母信号微弱，其他贝母未见阳性扩增信号；
21.图2为方法适用性测试。对不同产地和来源的松贝/青贝进行测试，每份样品均出现阳性扩增；
22.图3为松贝/青贝专属性探针引物检出限测试，从1～5dna浓度分别为100ng， 10ng，1ng，0.1ng，0.01ng；dna浓度在0.01ng时仍能检出，表明该探针引物具有较高的灵敏度；
23.图4为贝母通用探针引物检出限测试，从1～5dna浓度分别为100ng,10ng,1ng, 0.1ng,0.01ng；dna浓度在0.01ng时仍能检出，表明该探针引物具有较高的灵敏度；
24.图5为松贝与常见伪品平贝母按不同比例混合，采用专属探针引物(2)和贝母通用探针引物(1)同时检测，在松贝占比0.1％时仍能检出；
25.图6为专属探针引物和通用探针引物扩增效率比较。
具体实施方式
26.下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细的描述，这些实施例仅仅是说明性的，因此不应将其解释为对本发明范围的限制。
27.一、仪器与试剂
28.实时荧光定量pcr仪(ab 7500fast)，分析天平(mettler ab135-s)，纯水仪 (millipore公司)，球磨仪(m400，retsch)，微量紫外分光光度计，高速离心机，金属加热器。植物基因组提取试剂盒(dp321，天根生化科技有限公司)， universal master mix ii。
29.二、样品收集
30.收集准确来源的川贝母6个基原样品、平贝母、伊犁贝母及其他常见药用贝母、市售样品共计100余批。具体信息见附件1样品信息表。
31.三、样品处理与dna提取
32.1.样品处理及dna提取
33.将供试品研成极细粉，精密称定20mg，使用植物基因组提取试剂盒提取dna，得到供试品溶液。川贝母对照药材制成极细粉，精密称定20mg，同法制成阳性对照溶液。如为成方制剂，可酌情加大取样量在50～200mg。
34.2.dna提取具体步骤：
35.加入400μl缓冲液fp1和6μl的rnase a(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10 min。加入130μl缓冲液fp2，充分混匀，涡旋振荡1min。12,000rpm(～13,400
×
g)离心5min，将上清转移至新的离心管中；重复上述步骤。向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，(例如500μl的上清液加350μl异丙醇)，充分颠倒混匀，12,000 rpm(～13,400
×
g)离心2min，弃上清，保留沉淀。加入600μl 70％乙醇，涡旋振荡5 sec，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，弃上清；重复上述步骤。开盖倒置，室温5-10 min，彻底晾干残余的乙醇。加入洗脱缓冲液te 100μl，65℃水浴10-30min溶解 dna，最终得到dna溶液，置于4℃或-20℃备用。
36.也可采用硅胶离心柱法提取。对于成方制剂，可采用优化的ctab提取方法等，以获得足够纯度的dna模板溶液(一般要求od260/280在1.7～1.9之间)。
37.四、荧光定量pcr检测方法的建立
38.1.探针引物设计与筛选
39.根据its和psba-trnh区域的dna序列分析比对，在种内保守、种间差异区域设计探针引物，其中探针5’端标记荧光素集团fam或者vic，3’端标记非荧光素淬灭集团 bhq1。每个靶标物种设计2组以上的探针引物。
40.本发明的探针引物序列信息如附件2所示。
41.2.pcr反应体系及反应条件
42.反应体系：体积为20μl，包括荧光pcr反应混合液(2
×
)10μl，上下游引物及探针(10μmol/l)各0.5μl，模板dna 1μl，高压灭菌超纯水至总体积8.1μl。按照以上体系配制待测样品及阳性对照的反应溶液。空白对照为不含模板dna的反应体系，并用等体积高压灭菌超纯水代替模板dna。样品及对照均设三个重复，ct值取三个重复的平均值作为最终结果。
43.反应条件：50℃2分钟；95℃,10分钟；95℃，15秒，60℃，1分钟，40个循环。
44.表1.贝母通用探针引物的适用性考察
45.[0046][0047]
五、方法学考察
[0048]
1.专属性考察
[0049]
对松/青贝专属探针引物进行专属性考察，只有在检测松贝/青贝的3个基原时出现阳性扩增，瓦布贝母信号微弱，其他贝母未见阳性扩增信号(图1)。
[0050]
2.适用性考察
[0051]
采用专属探针引物对不同产地和来源的松贝/青贝进行检测，每份样品均出现明显阳性扩增(图2)。采用贝母通用探针引物对于多种贝母属来源的药材进行检测，每种药材均出现明显阳性扩增(表1)。
[0052]
3.检出限考察
[0053]
对松贝/青贝专属性探针引物检出限进行测试，从1～5dna浓度分别为100ng， 10ng，1ng，0.1ng，0.01ng；dna浓度在0.01ng时仍能检出(图3)。
[0054]
对贝母通用探针引物检出限进行测试，从1～5dna浓度分别为100ng，10ng，1ng， 0.1ng，0.01ng；dna浓度在0.01ng时仍能检出(图4)。
[0055]
松贝与常见伪品平贝母按不同比例混合，采用专属探针引物(2)和贝母通用探针引物(1)同时检测，在松贝占比0.1％时仍能检出(图5)。
[0056]
4.扩增效率考察
[0057]
对松贝/青贝专属性探针引物和贝母通用探针引物在同一反应体系中的扩增效率进行比较，结果二者扩增效率分别为92.2％和96.6，表明二者效率接近，可用于定量检测 (表2，图6)
[0058]
表2.特异引物与通用引物扩增效率比较
[0059][0060]
5.计算及判定方法
[0061]
1)对于定性检测，可将ct值临界点设置在35，ct《35视为检出松/青贝。
[0062]
2)对于半定量检测，需设置标准品(根据检测样品类型不同选择川贝母对照药材或者标准制剂)作为参照，鉴于聚合酶链式反应呈指数扩增，达到阈值时的扩增轮数为ct 值；标准品(s)与供试品(t)的ct值之差用
△
ct表示，则供试品中的目的dna所占比例可表示为：供试品(t)/标准品(s)％＝2
‑△
ct绝对值
×
100％。理论上
△
ct绝对值越小，松/青贝占比越大(表3)。
[0063]
3)对于定量检测，一方面同时设置标准品(s)，另一方面采用同体系中双探针标记进行扩增，即包括专属探针(p)和通用探针(c)。供试品中专属探针(p)和通用探针(c)的定量检测比值可表示为
△
ct(t)，相应的标准品可表示为
△
ct(s)，
△△
ct＝
△
ct(t)
‑△
ct
(s)。则目的dna(松/青贝母)所占比例计算公式可表示为：供试品(t)/标准品(s)％＝2
‑△△
ct绝对值
×
100％。
[0064]
表3.不同掺伪比例对应的
△
ct绝对值
[0065][0066]
附件：
[0067]
附件1.药材样品信息表
[0068]
[0069]
[0070]
[0071][0072]
附件2.探针引物序列信息
[0073][0074]
本文对一些具体的实施例进行了详细的描述，然而这只是作为对发明目的实例说明，而不限制下述权利要求书的范围。应当理解，对本文所述具体方案的不同取代、改变和修饰都不偏离本发明权利要求所定义的内涵和外延，从而应当属于本技术所要求保护的发明范围。