真菌筛选试剂、筛选方法、试剂盒及应用与流程

1.本发明涉及菌落筛选领域，尤其涉及真菌筛选试剂、筛选方法、试剂盒及应用。


背景技术：

2.在工程菌改造过程中，常需要筛选出阳性单克隆菌落，以进行下一步改造和培养。在现有的方法中，菌落pcr作为最快捷方便的筛选方法广泛应用于工程菌阳性单克隆筛选工作中。而对于真菌，由于其所具有的细胞壁和染色体结构，使其在进行菌落pcr时需要进行样品预处理：
3.取对数生长期酵母菌株1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min离心15s，沉淀悬浮于200μl te缓冲液中，在沸水上煮1～10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存于-20℃取1μl用于pcr。或者，取直径大于3mm的酵母干菌落，至于ep管中盖上盖子，在微波炉中加热，加入30μl te振荡，13000r/min，离心2～5min，上清储存浴-20℃，取1μl来作pcr。然后通过对扩增序列的大小进行分析对比，来达到挑选阳性单克隆的目的。
4.由于研发平台的高通量和自动化需求，现有的菌落pcr技术因其筛选结果是基于dna凝胶电泳，而该技术并不能实现自动化替代，且菌落pcr和凝胶电泳的筛选方法，耗时较长，不利于提高通量。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了真菌筛选试剂、筛选方法、试剂盒及应用。
6.本发明旨在开发出一种适用于自动化平台，且更加快速有效的菌落筛选技术，即基于蜗牛蛋白酶、cas12a蛋白的快速菌落筛选技术。本发明关键点在于第一次将crisprcas12a技术应用于真菌菌落筛选，并基于其技术原理进行了改进优化，使得其更适用于高通量筛选。在质粒设计上，本发明创造性的在基因末端引入pam序列，使得所有的crrna序列均可同时识别基因片段和载体片段。除此之外本发明利用自动化设备，大批次的筛选反应体系及反应条件，使其充分适用于菌落筛选的自动化实现方案，大大提升了菌种选育速度和菌种筛选效率。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了溶菌试剂，包括如下组分：
9.山梨醇
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0.8～1.1mol/l
10.edta
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10～20mol/l
11.蜗牛蛋白酶
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5～60mg/ml。
12.在本发明的一些实施方案中，上述溶菌试剂包括山梨醇0.9mol/l。
13.在本发明的一些实施方案中，上述溶菌试剂包括edta 10mol/l。
14.在本发明的一些实施方案中，上述溶菌试剂包括蜗牛蛋白酶30mg/ml。
15.本发明还提供了检测试剂，包括如下组分：
16.1μm crrna
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20～200nm
17.10nm cas12a蛋白
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0.2～0.5nm
18.1nm荧光报告分子
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0.1～0.5nm
19.10*buffer与ddh2o的体积比为1:6。
20.在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂包括1μm crrna100nm。
21.在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂包括10nm cas12a蛋白0.5nm。
22.在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂包括1nm荧光报告分子0.1nm。
23.本发明还提供了上述检测试剂的上述crrna的设计方法，包括在目的基因上选择pam位点tttn后20bp碱基序列作为识别序列。
24.本发明还提供了筛选试剂，包括上述溶菌试剂和/或上述检测试剂。
25.本发明还提供了真菌菌落的筛选方法，包括以下步骤：
26.s1：取上述溶菌试剂和/或上述筛选试剂中的上述溶菌试剂与样品混合，获得混合菌液；
27.s2：取上述混合菌液与上述检测试剂和/或上述筛选试剂中的上述检测试剂混合，检测。
28.在本发明的一些实施方案中，上述筛选方法s1中所述混合的时间为10～50min，温度为35～38℃。
29.在本发明的一些实施方案中，上述筛选方法s1中所述混合的时间为30min。
30.在本发明的一些实施方案中，上述筛选方法s1中所述混合的温度为37℃。
31.在本发明的一些实施方案中，上述筛选方法s1中上述溶菌试剂与上述样品的体积比为35:1。
32.在本发明的一些实施方案中，上述筛选方法s2中上述混合的时间为15min，温度为35～38℃。
33.在本发明的一些实施方案中，上述筛选方法s2中上述混合的温度为37℃
34.本发明还提供了试剂盒包括上述溶菌试剂、上述检测试剂和/或上述筛选试剂以及可接受的助剂。
35.本发明还提供了上述溶菌试剂、上述检测试剂、上述筛选试剂和/或上述试剂盒在检测和/或筛选真菌菌落中的应用。
36.本发明提供了本发明提供了溶菌试剂，包括如下组分：
37.山梨醇
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0.8～1.1mol/l
38.edta
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10～20mol/l
39.蜗牛蛋白酶
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5～60mg/ml。
40.本发明针对现有菌落pcr的不足，对筛选目标菌落的方法和技术进行改革，突破了菌落筛选的仪器(电泳仪、pcr仪)对菌落筛选的通量限制，可实现最大通量筛选。同时将筛选时间从3小时缩短到1小时，大大提升了筛选效率。
41.本发明与菌落pcr技术对比
42.附图说明
43.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
44.图1示破菌体系调整过程；
45.图2示反应体系测试结果；
46.图3示ppic9k-ct05载体；
47.图4示新方法筛选结果；
48.其中： 为阳性内参，1～5均显示为阳性，即为目标菌落；
49.图5示菌落pcr筛选结果；
50.其中：m为marker，1～5均显示为阳性，即为目标菌落。
具体实施方式
51.本发明公开了真菌筛选试剂、筛选方法、试剂盒及应用。
52.应该理解，表述
“……
中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
53.术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
54.应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
55.本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
56.此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与
20mg/ml1-1-1-1-1-1-1 /-1 /-1 25mg/ml1-1-1-1 /-1 /-1 1 1 1 30mg/ml1-1 /-1 /-1 1 1 1 1 1 35mg/ml1 /-1 /-1 0 0 0 0 0 0 40mg/ml1 0 0 0 0 0 0 0 0 45mg/ml0 0 0 0 0 0 0 0 0 50mg/ml0 0 0 0 0 0 0 0 0 55mg/ml0 0 0 0 0 0 0 0 0 60mg/ml0 0 0 0 0 0 0 0 0
71.结果表明，由于破菌体系会影响液体黏稠度，从而导致移液过程难以进行，故当液体黏稠度适中表现为可移液，液体黏稠度过高表现为不可移液；“可移液用1表示，不可移液用0表示”。由于破菌体系会影响待检测片段浓度，浓度高表现为可检测，浓度低表现为不可检测；“可检测用 表示，不可检测用-表示”。
72.标“粗体和下划线”为符合检测需求的可选体系
73.综合对效率、成本与准确性考虑，我们选择尽可能低浓度用量和尽可能快的检测时间，同时保证检测的准确性，故选取30mg/ml蜗牛蛋白酶反应30min为最终反应体系。
74.实施例2荧光检测
75.表2反应体系测试结果统计
[0076][0077]
表3体系1
[0078]
试剂用量终反应浓度1μm crrna1μl20nm10nm cas12a蛋白1μl0.2nm1nm荧光报告分子1μl0.1nm10*buffer2μl-ddh2o13μl-混合菌液2μl-[0079]
表4体系2
[0080][0081][0082]
表5体系3
[0083]
试剂用量终反应浓度1μm crrna2μl100nm10nm cas12a蛋白1μl0.2nm1nm荧光报告分子1μl0.1nm10*buffer2μl-ddh2o12μl-混合菌液2μl-[0084]
表6体系4
[0085]
试剂用量终反应浓度1μm crrna2μl200nm10nm cas12a蛋白1μl0.2nm1nm荧光报告分子1μl0.1nm10*buffer2μl-ddh2o12μl-混合菌液2μl-[0086]
表7体系5
[0087]
试剂用量终反应浓度1μm crrna2μl200nm10nm cas12a蛋白1μl0.5nm1nm荧光报告分子1μl0.1nm10*buffer2μl-ddh2o12μl-混合菌液2μl-[0088]
表8体系6
[0089]
试剂用量终反应浓度1μm crrna2μl150nm10nm cas12a蛋白1μl0.5nm1nm荧光报告分子1μl0.1nm
10*buffer2μl-ddh2o12μl-混合菌液2μl-[0090]
表9体系7
[0091]
试剂用量终反应浓度1μm crrna2μl100nm10nm cas12a蛋白1μl0.5nm1nm荧光报告分子1μl0.1nm10*buffer2μl-ddh2o12μl-混合菌液2μl-[0092]
表10 crispr cas12a检测技术反应体系
[0093]
试剂用量终反应浓度1μm crrna2μl100nm10nm cas12a蛋白1μl0.5nm1nm荧光报告分子1μl0.1nm10*buffer2μl-ddh2o12μl-混合菌液2μl-[0094]
最终确定蛋白浓度为0.5nm。而crrna浓度也并非越高越好，在多次测试后，最终反应体系内crrna浓度为100nm时效果最佳。由体系1到体系4，我们认为crrna浓度20nm过低，使其未能实现特异性识别，于是加大crrna浓度，最终于体系4加大到200nm。但情况仍未改观，便猜测是cas12a蛋白浓度0.2nm过低，于是在体系5我们增加了cas12a蛋白浓度至0.5nm，出现了假阴性现象，即存在部分阳性样品未被检出，于是在体系6和体系7，我们推翻了先前提升的crrna浓度，并在当前基础上对crrna浓度逐步降低得出在终浓度为100nm时，可实现百分百检出。经过以上调试，(部分调试过程见图2、表2)，故确定最终反应体系(表10)。
[0095]
在该反应体系下，只需将已配好体系加入待检测样品，而后放入37℃反应20min，即可在紫外光下观察实验结果。
[0096]
实施例3crrna设计
[0097]
不同的筛选基因设计不同的crrna。在目的基因上选择pam位点(tttn),选取该位点后的20bp碱基序列作为识别序列，设计crrna。
[0098]5′
uaauuucuacuaaguguagaugauugccggacccggaccgc 3
′
(如seq id no:1所示)
[0099]
其中：非划线部分为结构序列，划线部分为识别序列。
[0100]
实施例4鉴定筛选毕赤酵母中是否为带有ppic9k-ct05载体的阳性单克隆载体序列：
[0101]
agatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaa
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[0102]
其中下划线为ct05基因，粗体部分为pam位点，斜体部分为特异性识别序列(20bp)
[0103]
故crrna序列为：
[0104]5’
uaauuucuacuaaguguagauauuaugcaucuuaagggauc3’(如seq id no:3所示)
[0105]
其中：非划线部分为结构序列，划线部分为识别序列。
[0106]
实验操作：
[0107]
从37℃培养过夜的固体培养基上，挑取单克隆菌落，于10μl培养基中，取1μl菌液加入到30μl实施例1制备的bufferi中，再加入5μl实施例1中制备的蜗牛蛋白酶溶液。37℃，600rpm反应30min。取反应液2μl加入到实施例2预配检测体系中(见表10)，放入37℃反应15min，即可在紫外光下观察实验结果(图4)，同时用菌落pcr进行筛选，结果见(图5)。
[0108]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。