一种百脉根籽提取物及其制备方法和鼠李糖基尿苷的制备与流程

1.本发明涉及植物提取技术领域，特别是涉及一种百脉根籽提取物及其制备方法和鼠李糖基尿苷的制备。


背景技术：

2.百脉根(lotus corniculatus)是豆科(leguminosae)百脉根属(lotus)植物，又称五叶草、牛角花、鸟距草。在我国，百脉根主要产自西北、西南、长江中上游各省区，生于湿润而呈弱碱性的山坡、田野、草地或河滩。亚洲、欧洲、北美洲和大洋洲具有分布。百脉根是一种传统中草药，具有清热祛湿、止咳解毒、活血散瘀等功效。对其成分分析发现，主要包括黄酮类、苷类和三萜皂苷等，百脉根提取物及活性成分具有较强的抗炎、抗菌作用。且目前对百脉根籽的研究很少，未见有任何报道记载从百脉根籽中可提取得到鼠李糖基尿苷。
3.鼠李糖基尿苷的全称为5'-o-α-l-鼠李糖基尿苷，属于核苷类成分，化学结构如下所示。
[0004][0005]
目前仅有其化学合成方面的报道。lluis ballell等人于2005年报道了该化合物的合成方法，并证实其是rmlb蛋白(dtdp-α-d-葡萄糖-4,6-脱水酶)抑制剂，rmlb蛋白抑制剂能够有效治疗结核病。要得到鼠李糖基尿苷，现有方法只能采用化学合成的途径。可是，采用化学合成的方法不仅不环保，而且所用原料价格高昂且稀有，不利于鼠李糖基尿苷的大规模生产。
[0006]
因此，迫切需要开发一种工艺简单、环保并且能大规模生产的适用于鼠李糖基尿苷的制备方法。


技术实现要素：

[0007]
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种百脉根籽提取物及其制备方法和鼠李糖基尿苷的制备。
[0008]
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0009]
第一方面，本发明提供了一种百脉根籽提取物，所述百脉根籽提取物中包括质量含量为50％以上的鼠李糖基尿苷。所述鼠李糖基尿苷含量采用hplc峰面积归一化法计算得到。
[0010]
优选地，所述百脉根籽提取物中包括质量含量为80％以上的鼠李糖基尿苷。例如鼠李糖基尿苷含量为82.6-84.7％。
[0011]
第二方面，本发明提供了一种百脉根籽提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0012]
a、将百脉根籽压榨除油，收集滤饼；
[0013]
b、将滤饼采用溶剂提取，然后过滤得提取液；
[0014]
c、将提取液用第一树脂柱吸附，再进行梯度洗脱后，收集洗脱液；
[0015]
d、将步骤c得到的洗脱液用第二树脂柱吸附，再进行梯度洗脱后，收集洗脱液，去除溶剂，即得百脉根籽提取物。
[0016]
优选地，步骤b中，所述溶剂选自水、醇中的至少一种；
[0017]
所述提取的温度为70-90℃，提取时间为1-5h。
[0018]
优选地，所述醇选自甲醇、乙醇等，但不限于此。本发明在前期的实验中发现，采用水提、醇提或水和醇的混合物提取得到的提取液经后续步骤c和d的处理后，均能获得含有鼠李糖基尿苷的百脉根籽提取物，且鼠李糖基尿苷的含量在50％以上。而若采用其他溶剂如酸、碱提取，则会导致鼠李糖基尿苷被酸、碱分解掉，从而获得的鼠李糖基尿苷含量极少。
[0019]
更优选地，步骤b中，所述溶剂为水。
[0020]
优选地，步骤b中，所述过滤具体采用5-10μm的聚丙烯膜进行过滤；优选采用10μm 和5μm的聚丙烯膜依次过滤。
[0021]
优选地，步骤c中，所述第一树脂柱为非极性或弱极性大孔树脂；所述非极性大孔树脂可选自d101，hp-20，xad-1中的至少一种，所述弱极性大孔树脂可选自ab-8， dm-130中的至少一种。本发明在前期的实验中对比了不同非极性或弱极性大孔树脂的效果，均能获得高得率、高鼠李糖基尿苷含量的百脉根籽提取物；其中第一树脂为d101 时，获得的百脉根籽提取物的得率和鼠李糖基尿苷含量最高。
[0022]
所述梯度洗脱具体为：依次采用水、5-40％乙醇洗脱；采用5-40％乙醇洗脱是因为若乙醇浓度太低时，目标化合物的洗脱率低；而乙醇浓度过高时，其他杂质则会被大量洗脱下来。更优选依次采用水、20-40％乙醇洗脱，最优选采用水、30％乙醇洗脱(鼠李糖基尿苷的含量最高)。
[0023]
优选地，步骤c中，所述收集的洗脱液为5-40％乙醇洗脱后的洗脱液。
[0024]
优选地，步骤c中，还包括将所得洗脱液进行浓缩的步骤，所得浓缩液中乙醇含量为5％以下。由于步骤d的mci chp20p树脂柱对鼠李糖基尿苷的吸附量受醇的浓度影响很大，醇的浓度越高，吸附量越少。因此在本发明前期的实验中发现，若不对步骤c 的洗脱液进行浓缩，会导致目标成分得率降低。且进一步实验发现，浓缩后所得浓缩液中乙醇含量小于等于5％时，不影响mci chp20p树脂柱对鼠李糖基尿苷的吸附，从而获得的目标产物得率高。而浓缩液中乙醇浓度高于5％时，则会导致目标产物得率低。
[0025]
优选地，步骤d中，所述第二树脂柱为小粒径树脂柱，具体可选自mci chp20p、 diaion hp20ss中的至少一种；更优选第二树脂为mci chp20p，获得的百脉根籽提取物的得率和鼠李糖基尿苷含量最高。
[0026]
所述梯度洗脱具体为：依次采用水、10％乙醇、20％乙醇洗脱。先用水、10％乙醇洗脱可以除去一部分色素和杂质。
[0027]
优选地，步骤d中，收集的洗脱液为20％乙醇洗脱后的洗脱液。
[0028]
第三方面，本发明提供了一种鼠李糖基尿苷的制备方法，包括以下步骤：
[0029]
s1、将前述的百脉根籽提取物或前述方法制备的百脉根籽提取物分散于90-95％乙醇(若采用的乙醇浓度过低，则会使鼠李糖基尿苷更多地溶解在溶剂里，导致得率下降) 中，室温下搅拌5-15分钟后，过滤，收集固体；
[0030]
s2、将收集的固体重复步骤s1的操作2-4次，将最后收集的固体干燥后，即得鼠李糖基尿苷。
[0031]
优选地，步骤s1中，所述百脉根籽提取物与90-95％乙醇的固液比为1:10-20。更优选固液比为1:15。
[0032]
优选地，步骤s2中，所得鼠李糖基尿苷的纯度为95％以上，更优选纯度为98％以上。
[0033]
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0034]
(1)本发明首次在百脉根(lotus corniculatus linn.)籽中首次发现了5'-o-α-l-鼠李糖基尿苷，并首次实现了从植物中提取并分离得到鼠李糖基尿苷，且得到的鼠李糖基尿苷纯度高、水溶性好、应用方便。
[0035]
(2)本发明的制备流程简便，操作可行性高，可大规模生产鼠李糖基尿苷。
[0036]
(3)本发明通过对提取工艺的进一步改进，先采用非极性或弱极性大孔树脂柱进行粗分、再采用小粒径树脂柱进行精细分离，可获得高鼠李糖基尿苷含量的百脉根籽提取物；再通过提纯后得到高纯度的鼠李糖基尿苷。
[0037]
(4)本发明首次发现制备的含有大量鼠李糖基尿苷的百脉根籽提取物具有降低皮肤油脂分泌和收敛毛孔的效果，可应用于个人护理产品中。
附图说明
[0038]
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0039]
图1为实施例1制得的鼠李糖基尿苷的hplc谱图；
[0040]
图2为实施例1制得的鼠李糖基尿苷的1h-nmr谱图；
[0041]
图3为实施例1制得的鼠李糖基尿苷的
13
c-nmr谱图；
[0042]
图4为实施例1制得的鼠李糖基尿苷的hmbc谱图；
[0043]
图5为实施例1制得的鼠李糖基尿苷的hsqc谱图；
[0044]
图6为验证实施例4中百脉根籽提取物对其中一位受试者的毛孔收敛效果；其中，图6-a为使用供试品1第一天的visia照片；图6-b为使用供试品1四周后的visia照片；图6-c为使用对照品第一天的visia照片；图6-d为使用对照品四周后的visia照片。
具体实施方式
[0045]
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0046]
本发明对实验中所使用的中药原料为本公司提供和/或市面采购产品。以下实施例中采用的不同百分含量的乙醇均指乙醇的质量百分含量。
[0047]
实施例1
[0048]
本实施例提供了一种鼠李糖基尿苷的提取与分离方法，具体步骤如下：
[0049]
1)称取百脉根籽500g，采用榨油机进行压榨，收集滤饼。
[0050]
2)加入滤饼重量10倍的水，80℃提取2h，所得提取液依次用10μm、5μm聚丙烯膜过滤，得滤液。
[0051]
3)将滤液采用d101大孔树脂柱吸附，用纯净水洗至流出液基本为无色，再用30％乙醇洗至流出液基本为无色，收集30％乙醇洗脱液，浓缩至乙醇含量4％(此处乙醇浓度为酒精计实测值)。
[0052]
4)将浓缩液采用mci chp20p树脂柱吸附，依次用水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇进行洗柱。鼠李糖基尿苷主要集中在20％乙醇洗脱部位，水和30％乙醇洗脱液检测不到鼠李糖基尿苷，10％乙醇洗脱液有很少量的鼠李糖基尿苷。将20％乙醇洗脱液去除溶剂，得百脉根籽提取物0.97g。其中，鼠李糖基尿苷的含量为83.8％(采用hplc峰面积归一化法计算)。
[0053]
5)将0.97g百脉根籽提取物分散于95％乙醇中(固液比1:15)，室温下搅拌10分钟，过滤，收集固体。将收集的固体重复前面的操作两次，最后收集的固体进行干燥后得鼠李糖基尿苷0.78g，纯度为97.9％。
[0054]
实施例2
[0055]
本实施例提供了一种鼠李糖基尿苷的提取与分离方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于：收集的30％乙醇洗脱液不进行浓缩，直接将30％乙醇洗脱液用 mci chp20p树脂吸附。
[0056]
具体步骤如下：
[0057]
1)百脉根籽500g，采用榨油机进行压榨，收集滤饼。
[0058]
2)加入滤饼重量10倍的水，80℃提取2h，所得提取液依次用10μm、5μm聚丙烯膜过滤，得滤液。
[0059]
3)将滤液采用d101大孔树脂柱吸附，用纯净水洗至流出液基本为无色，再用30％乙醇洗至流出液基本为无色，收集30％乙醇洗脱液。
[0060]
4)将30％乙醇洗脱液再采用mci chp20p树脂柱吸附，依次用水、10％乙醇、20％乙醇进行洗柱。将收集的20％乙醇洗脱液去除溶剂，得百脉根籽提取物0.11g。其中，鼠李糖基尿苷的含量为84.1％(用hplc峰面积归一化法计算得到)。
[0061]
5)将0.11g百脉根籽提取物分散于95％乙醇中(固液比1:15)，室温下搅拌10分钟，过滤，收集固体。将收集的固体重复前面的操作两次，收集的所有固体进行干燥后得鼠李糖基尿苷0.09g，纯度为98.2％。
[0062]
实施例3
[0063]
1)称取百脉根籽500g，采用榨油机进行压榨，收集滤饼。
[0064]
2)加入滤饼重量10倍的水，70℃提取1h，所得提取液依次用10μm、5μm聚丙烯膜过滤，得滤液。
[0065]
3)将滤液采用d101大孔树脂柱吸附，用纯净水洗至流出液基本为无色，再用40％乙醇洗至流出液基本为无色，收集40％乙醇洗脱液，浓缩至乙醇含量5％(此处乙醇浓度为酒精计实测值)。
[0066]
4)将浓缩液采用mci chp20p树脂柱吸附，依次用水、10％乙醇、20％乙醇进行洗柱。将20％乙醇洗脱液去除溶剂，得百脉根籽提取物0.83g。其中，鼠李糖基尿苷的含量为84.7％。
[0067]
5)将0.83g百脉根籽提取物分散于90％乙醇中(固液比1:10)，室温下搅拌10分钟，过滤，收集固体。将收集的固体重复前面的操作两次，最后收集的固体进行干燥后得鼠李糖基尿苷0.59g，纯度为98.4％。
[0068]
实施例4
[0069]
1)称取百脉根籽500g，采用榨油机进行压榨，收集滤饼。
[0070]
2)加入滤饼重量10倍的水，90℃提取5h，所得提取液依次用10μm、5μm聚丙烯膜过滤，得滤液。
[0071]
3)将滤液采用d101大孔树脂柱吸附，用纯净水洗至流出液基本为无色，再用20％乙醇洗至流出液基本为无色，收集20％乙醇洗脱液，浓缩至乙醇含量2％(此处乙醇浓度为酒精计实测值)。
[0072]
4)将浓缩液采用mci chp20p树脂柱吸附，依次用水、10％乙醇、20％乙醇进行洗柱。将20％乙醇洗脱液去除溶剂，得百脉根籽提取物1.08g。其中，鼠李糖基尿苷的含量为82.6％。
[0073]
5)将1.08g百脉根籽提取物分散于95％乙醇中(固液比1:20)，室温下搅拌10分钟，过滤，收集固体。将收集的固体重复前面的操作两次，最后收集的固体进行干燥后得鼠李糖基尿苷0.82g，纯度为98.1％。
[0074]
对比例1
[0075]
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：本对比例中，步骤3)采用极性树脂da-201柱代替d101大孔树脂柱。
[0076]
由此得到百脉根籽提取物0.31g，其中鼠李糖基尿苷的含量为23.7％(采用hplc 峰面积归一化法计算)。进一步进行步骤5)的处理后得到鼠李糖基尿苷0.11g，纯度为62.8％。
[0077]
对比例2
[0078]
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：本对比例中，步骤4)采用大粒径树脂ab-8柱代替mci chp20p树脂柱。
[0079]
由此得到百脉根籽提取物1.12g，其中鼠李糖基尿苷的含量为69.7％(采用hplc 峰面积归一化法计算)。进一步进出步骤5)的处理后得到鼠李糖基尿苷0.79g，纯度为84.8％。
[0080]
验证实施例1
[0081]
以上述实施例1-4制备的鼠李糖基尿苷作为样品进行hplc分析。
[0082]
hplc测试条件为：色谱柱：zorbax sb c18(4.6*250mm，5μm)；流动相：水 (a相)和甲醇(b相)；梯度洗脱：具体洗脱程序见表1；流速：1.0min/l；柱温： 35℃；检测波长：260nm。
[0083]
表1 流动相梯度洗脱程序
[0084][0085]
以实施例1制备的鼠李糖基尿苷为例，其得到的hplc谱图如图1所示，用峰面积归一化法计算纯度，鼠李糖基尿苷的纯度为97.9％。实施例2-4制备的鼠李糖基尿采用相同方法计算得到的纯度分别为98.2％、98.4％、98.1％。
[0086]
验证实施例2
[0087]
对前述实施例1-4制备的鼠李糖基尿苷进行核磁共振(nmr)测试。
[0088]
将实施例1-4制备的鼠李糖基尿苷溶于氘代水，进行1h-nmr、
13
c-nmr、hmbc 和hsqc测试，其中实施例1制备的鼠李糖基尿苷的nmr谱图分别见图2-图5。综合分析nmr谱，将其结构鉴定为5'-o-α-l-鼠李糖基尿苷，
13
c-nmr数据归属为δc:166.16 (c-2)、151.46(c-1)、141.43(c-4)、102.18(c-3)、100.56(c-1”)、89.88(c-1')、82.32(c-4')、 73.68(c-2')、71.87(c-4”)、70.37(c-3”)、69.79(c-2”)、69.15(c-3')、68.86(c-5”)、66.54 (c-5')、16.61(c-6”)
[0089]
结构式如下：
[0090][0091]
实施例2-4制备的鼠李糖基尿苷的nmr谱图结果与实施例1制备的鼠李糖基尿苷一致。
[0092]
验证实施例3
[0093]
额头的控油实验测试：
[0094]
采用上述实施例1相同方法制备的百脉根籽提取物加到0.5％黄原胶中，配制成百脉根籽提取物质量分数为0.3％的半流动液体，标记为y-1；采用0.5％黄原胶作为空白对照品，标记为y-0。
[0095]
选取测试志愿者15人/组，清洗额头，一定环境中平衡30min，在受试者额头选取4个1.5*1.5cm的测试区域，采用ck公司的sebumeter sm 815测试探头分别检测平衡 30min和涂抹测试样品3h和6h的油脂含量，测试样品涂抹量为10μl，结果见表2。结果表明，实施例1制备的百脉根籽提取物具有即时控油效果。
[0096]
表2 油脂检测结果
[0097]
样品3h油脂平均降低率％6h油脂平均降低率％6h油脂降低人数有效率％y-0
‑‑‑
y-114.3827.4486.96％
[0098]
表2中，油脂降低率％＝100％
×
(空白对照组油脂含量-测试品组油脂含量)/空白
对照组油脂含量。
[0099]
验证实施例4
[0100]
visia毛孔分析：
[0101]
采用上述实施例1相同方法制备的百脉根籽提取物加到0.5％黄原胶中，配制成百脉根籽提取物质量分数为0.3％的半流动液体作为供试品。对照品为0.5％黄原胶。
[0102]
选取测试志愿者8人，清洗脸部，一定环境中平衡30min，在受试者左、右侧脸颊分别涂抹对照品和供试品，每日涂抹两次，每次涂抹量为两泵。连续使用4周后，采用 visia进行拍照。8位受试者中有3位受试者右脸使用供试品四周后毛孔粗大位置出现肉眼可见的毛孔变小。其中一位志愿者结果见图6。由图6可知，该志愿者在使用供试品4周后，可检测到的毛孔数量由341个降到315个，减少7.6％(图6-a和图6-b)；而使用对照品的志愿者在使用4周后的毛孔数量没有明显变化，有的甚至增多(图6-c 和图6-d)。说明实施例1制备的百脉根籽提取物具有收敛毛孔的功效。
[0103]
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。