一种PhlH蛋白突变体及其在提高莫匹罗星产量中的应用

一种phlh蛋白突变体及其在提高莫匹罗星产量中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种phlh蛋白突变体及其在提高莫匹罗星产量中的应用。


背景技术：

2.荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescen)定植在生长的植物根部，并显著增加作物产量，并且可以产生了一系列的次生代谢产物如抗生素莫匹罗星，噬铁素，氢氰酸，赤霉素，乙烯抑制剂等。荧光假单胞菌在矿物盐培养基辅以任何大量碳源中就可以很好地生长，众多的次生代谢产物构成了复杂的调节代谢网络。
3.莫匹罗星(mupirocin)是多种荧光假单胞菌产生的聚酮类次生代谢产物，是一种外用型广谱医用类抗生素，主要用于治疗表皮感染，特别是由革兰氏阳性细菌引起的感染，在结构上与其它抗生素不同，并通过抑制目标细菌中的异亮氨酸trna合成酶起作用。同时聚酮化合物作为功能和结构最多样化的天然产物之一，其前体大都是辅酶a(coa)，coa是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质，而改变coa代谢通路可大大提高所需聚酮化合物产物的产量。莫匹罗星合成法分为化学合成和生物合成，而化学合成需要许多步骤，材料和能源消耗高，且环境污染大，因此，生物合成法具有环保可持续和性能效率更高的特点而被广泛关注。莫匹罗星作为聚酮类医用抗生素，其本身会对菌株自身的基础代谢造成很大的负担，因此其生物合成必须通过严格的调控来保证自身的生长。转录因子是研究其调控路径的一种办法，本发明通过发现一种tetr家族的phlh蛋白，其是位于phl基因簇上的转录因子，并在phlh蛋白结构基础上，对其多个关键位点进行定点突变，从而改变了phlh蛋白的活性，使代谢中的coa尽可能的转向聚酮化合物莫匹罗星，进而在众多突变体中筛选出可能高产莫匹罗星的菌株。因此，提出一种phlh蛋白突变体及其在提高莫匹罗星产量中应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，针对发目前生物合成方法获得莫匹罗星产量低的问题，本发明提供一种phlh蛋白突变体及其在提高莫匹罗星产量中的应用，通过将转录因子phlh蛋白的第190位氨基酸定向突变，获得突变菌株，所述突变菌株能够提高莫匹罗星在荧光假单菌中的合成能力。
5.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
6.本发明提供了一种可提高莫匹罗星产量的phlh蛋白突变体，所述突变体为phlh蛋白序列的第190位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸制备获得，所述phlh蛋白来源于荧光假单胞菌p.fluorescen 2p24，所述phlh蛋白突变体记为phlh/v190a。
7.进一步改进在于，所述phlh蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，其编码基因phlh的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述突变体phlh/v190a的氨基酸序列如seq id no.4所示。
8.phlh基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，本发明还提供了一种phlh/v190a基因，所述phlh/v190a编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
9.本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒含有上述phlh/v190a基因。
10.进一步改进在于，所述重组质粒为pbbr5pemik质粒。
11.本发明还提供了一种一高产莫匹罗星的遗传工程菌，所述遗传工程菌包含上述重组质粒或基因组中整合有上述phlh/v190a基因。
12.进一步改进在于，所述遗传工程菌为e.coli dh5α或荧光假单胞菌pseudomonas fluorescen 2p24。
13.本发明还提供了一种上述遗传工程菌在提高莫匹罗星产量中的应用。
14.本发明的原理为：莫匹罗星(mupirocin)是多种荧光假单胞菌产生的聚酮类次生代谢产物，其前体大都是辅酶a(coa)，coa是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质，而改变coa代谢通路可大大提高所需聚酮化合物产物的产量，同时也是莫匹罗星生物合成产量受限的主要原因，本发明通过定点突变改变了phlh蛋白的活性，使代谢中的coa尽可能的转向聚酮化合物莫匹罗星，从而获得了莫匹罗星更高产量的突变菌株，具备较高的应用价值。
15.本发明具有如下有益效果：
16.本发明通过定点突变改变转录因子phlh蛋白的活性，使得其代谢水平发生极大的改变，结果表明，在摇瓶水平，z2的莫匹罗星产量相较于野生型的菌株和z0，z1的莫匹罗星产量均有提高，并且z3在z2基础上莫匹罗星产量又有所提高。
17.本发明中使用下列的缩写或简称：
18.荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)2p24：是中国农业大学张力群教授从山东小麦全蚀病土壤中分离的生防菌株；
19.hth-类型的转录抑制因子：phlh；
20.聚合酶链式反应：pcr；
21.缬氨酸：val(v)；
22.丙氨酸：ala(a)；
23.电转：是分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，电转指电穿孔法转染，电穿孔法靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将目的质粒导入细胞内。
24.酶切连接：是指通过限制性内切酶对目的基因和载体进行酶切，然后再将经同一限制酶酶切的一个或多个基因片段，通过连接酶进行连接。
附图说明
25.图1为p-phlh载体示意图；
26.图2为h-phlh/v190a载体示意图；
27.图3为100mg/l标准品莫匹罗星高效液相色谱检测；
28.图4为野生型荧光假单胞菌2p24发酵产物高效液相色谱检测；
29.图5为对照组z1菌株发酵产物高效液相色谱检测；
30.图6为实验组z2菌株发酵产物高效液相色谱检测；
31.图7为实验组z3菌株发酵产物高效液相色谱检测；
32.图8为各菌株莫匹罗星终产量对比图。
具体实施方式
33.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
34.1、材料
35.本实验所用所有试剂如无特殊说明均为常规试剂，均使用去离子水配制，所使用到的仪器均为实验室常规仪器。
36.(1)所用酶试剂购自thermo公司，提取质粒所用的试剂盒和回收dna片段所用的试剂盒购自诺唯赞公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
37.(2)质粒pk18mobsacb本实验室保存，质粒pbbr5pemik从addgene获取。
38.(3)敲除质粒pk18mobsacb带nptii(卡那霉素抗性基因)抗性标记，及sacb选择性标记；
39.(4)pbbr5pemik质粒带广谱复制子pbbr1，能在多种宿主细胞中进行自主复制，pbbr1复制子为中低拷贝复制子(～15copy)，携带pemi/k抗内毒素基因，能提高质粒在宿主细胞内的稳定性；带庆大霉素抗性标记。
40.(5)培养基配方:
41.a、摇瓶培养基配方
42.lb培养基:酵母粉5g，nacl10g，蛋白胨10g，定容至1l，分装为20ml用做种子培养基，121℃，20min灭菌。
43.b、摇瓶发酵培养基
44.kb培养基(g/l):蛋白胨10g，甘油10ml，mgso4.7h2o 1.5g，k2hpo
4 1.5g，ph7.0-7.2，定容至1l；分装成50ml用作发酵培养基，121℃，20min灭菌。
45.在实际培养过程中可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如终浓度为50mg/l的卡那霉素和50mg/l的庆大霉素。
46.本实验各个步骤均按照标准的分子克隆技术和微生物操作进行，本实验所使用的方法如下，不受具体实施案例的影响。
47.2、方法
48.2.1缺失phlh基因的荧光假单胞菌构建过程
49.2.1.1重组质粒pk18mobsacb-phlh的构建
50.荧光假单胞菌中phlh基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，phlh的氨基酸序列如seq id no.2所示，phlh的上下游同源臂是以p.fluorescens 2p24基因组dna为模板，通过pcr扩增获得；
51.上游同源臂正向引物序列为5-cggaattcgccgtggtcctgttgacccacg-3，反向引物序列为5-gctctagaatgagctatgcccttggcggcc-3；
52.下游同源臂正向引物序列为5-aatctagagttggccaacccctgctcggca-3，反向引物序
列为5-cccaagcttttgctgtattttttcgacagc-3。
53.克隆所得的上游同源臂由ecorⅰ，xbalⅰ双酶切，下游同源臂由xbalⅰ，hindⅲ双酶切，载体pk18mobsacb经ecorⅰ，hindⅲ双酶切后，利用回收试剂盒分别回收酶切后的上下游同源臂片段和载体pk18mobsacb片段，利用连接酶将三片段进行连接，连接产物转化escherichia coli dh5α，筛选出阳性克隆，得到重组质粒pk18mobsacb-phlh，质粒图谱如图1所示。
54.2.1.2敲除菌株的构建
55.将步骤2.1.1所得的重组质粒pk18mobsacb-phlh电转入p.fluorescens 2p24电转感受态中，将菌涂至各含有50ug/ml的氨苄霉素和卡纳霉素的双抗lb培养基上，待菌株长起来后，在无抗液体培养基培养5-8h后稀释一定倍数涂在含有10％蔗糖的培养基上，通过菌液pcr筛选出敲除菌株，记为z0。
56.2.2定点突变的荧光假单胞菌的构建过程
57.2.2.1回补质粒pbbr5pemik-phlh的构建
58.phlh基因的克隆是以p.fluorescens 2p24基因组dna为模板，通过pcr扩增获得；正向引物序列为5-aaaggtaccatggacaatgccattggcaa-3；反向引物序列为5-aaaaagctttcagcttgcagcatcgtgcg-3；克隆所得的phlh基因片段和pbbr5pemik载体经kpnⅰ，hindⅲ双酶切后，利用胶回收试剂盒回收酶切后的，在进行连接，连接产物转化e.coli dh5α，筛选出阳性克隆，得到重组质粒pbbr5pemik-phlh。
59.2.2.1回补质粒pbbr5pemik-phlh/v190a的构建：
60.以步骤2.2.1获得的载体为模板，通过pcr点突变质粒，正向引物序列为5-ccatcagccgctaaagcagcatgcactgcaggg-3，反向引物序列为5-ggctcgagactcaacccctgcagtgcatgctgc-3，用pcr清洁试剂盒回收，将回收质粒用dpnⅰ酶切，在进行连接，连接产物转化e.coli dh5α，筛选出阳性克隆，得到重组质粒pbbr5pemik-phlh/v190a，phlh/v190a编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，phlh/v190a的氨基酸序列如seq id no.4所示，质粒图谱如图2所示。
61.2.2.3突变菌株的构建
62.将步骤2.2.1和步骤2.2.2所得的重组质粒和pbbr5pemik质粒分别转入z0电转感受态中，将菌涂至各含有50ug/ml的氨苄霉素和庆大霉素的双抗固体lb培养基上，待菌株长起来后，通过菌液pcr筛选出携带载体的菌株，带有pbbr5pemik质粒的菌株记为z1；带有pbbr5pemik-phlh质粒的菌株记为z2；带有pbbr5pemik-phlh/v190a质粒的菌株记为z3。
63.2.3突变菌株的小瓶发酵实验
64.通过摇瓶发酵，来探明本发明所述突变株具有提高莫匹罗星产量的作用。
65.按照5组菌株进行实验，以说明本发明的重要性。
66.对照组：野生型2p24记为wt，菌株z0，z1。
67.实验组：菌株z2，z3。
68.a、将对照组和实验组的菌株在平板上活化，将活化后对照组和实验组分别接种到含有相应抗生素的20ml lb液体培养基中，28℃、200rpm培养至od600至1.0左右，按照2％-5％的接种量接种于含有相应抗生素的发酵培养基kb中，将突变株于28℃、200rpm继续培养至发酵结束。
69.b、取发酵液，4℃，6000rpm离心10min，取上清，经0.22μm的滤头抽滤1ml进入进样瓶，高效液相色谱检测发酵液中的莫匹罗星。
70.c、莫匹罗星的hplc检测
71.流动相：a相为乙腈；b相为5g/l nh4h2po4；色谱柱：wondasil c18-wr column(5μm，4.6x150mm)；检测条件为a相40％，b相60％，流速1ml/min，柱温30℃，检测波长230nm，检测时间10min/样品。
72.其中标准品制备方法为称取500mg莫匹罗星软膏，溶于1ml甲醇，制备成10g/l母液；梯度稀释成20mg/l，50mg/l，100mg/l，500mg/l，以此制作标准曲线。
73.如图3-7所示，分别为100mg/l标准品莫匹罗星高效液相色谱检测，野生型荧光假单胞菌2p24发酵产物高效液相色谱检测，对照组z1和实验组z2、z3菌株发酵产物高效液相色谱检测，从图中可以看出，z3菌株》z2菌株》z1菌株》野生型菌株。
74.3、结果
75.在摇瓶水平上，对照的野生型菌株wt的莫匹罗星产量为187mg/l，菌株z0的莫匹罗星产量为163mg/l，菌株z1的莫匹罗星产量为210mg/l，菌株z2的莫匹罗星产量为264mg/l，菌株z3的莫匹罗星产量为339mg/l，各菌株莫匹罗星发酵的最终产量如图8所示。即本发明所述的通过定点突变phlh的菌株z3莫匹罗星产量相比于野生型2p24菌株提高了103％的产量。
76.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。