1.本发明具体涉及一种新型大脑皮层发育障碍动物模型构建方法及应用。
背景技术：
：：2.目前较常采用的mcd(大脑皮质发育畸形malformationofcorticaldevelopment，mcd)动物模型包括基因型。reeler小鼠是采用较多的基因型mcd小鼠模型之一，但其病理机制尚未完全研究清楚，部分研究结果还存在一些矛盾之处，因而影响了其科研价值。技术实现要素：3.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种新型大脑皮层发育障碍动物模型构建方法及应用。4.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：5.一种新型大脑皮层发育障碍动物模型构建方法，包括以下步骤：6.(1)分别构建针对小鼠nischarin基因并携带egfp标记的nis-shrna质粒；7.(2)选取孕期为e13.5的孕鼠行子宫内电穿孔，将egfp标记的nis-shrna质粒注射至胎鼠侧脑室，对胎鼠大脑施加电脉冲刺激，最后将胚胎回置于母鼠腹腔使其继续发育。8.进一步地，还包括以下步骤：9.(3)于e18.5通过与对照比较评估nischarin敲低后对小鼠大脑皮层神经元迁移定位及形态的影响；10.(4)观察并记录仔鼠从出生到4周龄内的发育表征、运动能力和反射发育指标。11.进一步地，步骤(1)中，nis-shrna质粒的构建：12.查找小鼠nischarin的mrna全序列，选取4段含19个碱基的nischarin特异性靶序列作为shrna目标序列，设计nis-shrna质粒；shrna目标序列如下：13.序列1：5’‑cacaactgtcgcaaccgct-3’；14.序列2：5’‑tgatgccaagactgacctt-3’；15.序列3：5’‑cctcagagacaaccggatt-3’；16.序列4：5’‑agcattgccgaggttgaaa-3’17.再合成shrna目标序列的反向互补序列，5’端为bamhi酶切位点(gatcc)，中间由tcaagag的发夹状序列将此两段序列相连，形成茎环结构，3’端为ecori酶切位点(gaattc)，并加6个t作为rna聚合酶ⅲ的转录终止子，共形成63nt的寡核苷酸正义链及其互补的反义链。18.nischarin在大脑皮质发育中的应用，nischarin和reelin信号通路的pak1和limk1的相互作用。19.进一步地，nis-shrna质粒及其对照质粒转染neuro-2a细胞，再用免疫印迹方法检测pak1、limk1、cofilin的磷酸化程度，得到nischarin抑制pak1、limk1、cofilin的磷酸化。20.nischarin在大脑皮质发育中的应用，nischarin对dab1/akt/mtor信号通路的磷酸化调控。21.进一步地，nischarin的表达能够激活reelin信号通路中dab1的磷酸化活性。22.nischarin在大脑皮质发育中的应用，nischarin通过抑制reelin信号通路下游分子pak1，调节neuro-2a细胞迁移能力。23.nischarin在大脑皮质发育中的应用，nischarin激活pak1活性调节neuro-2a细胞突起生长能力。24.本发明的有益效果是：25.(1)本发明利用子宫内电穿孔在胚胎期对nischarin的表达进行定时、定位干扰，制备得到一组新型大脑皮层发育障碍小鼠模型，并借助该模型进行研究，得到：在大脑皮层发育过程中，nischarin在神经元中的表达受reelin影响发生时空上的动态变化，通过调控pak1/limk1/cofilin通路，以及pi3k/akt/mtor通路，影响神经元的迁移过程和迁移到位神经元树突发育过程，最终与reelin蛋白一起精细调控大脑皮层发育。26.(2)本发明构建针对nischarin蛋白的mcd小鼠模型有望进一步阐明reeler小鼠模型的具体分子机制，从而为深入研究mcd致病机理及其防治打下基础。附图说明27.图1是nis-shrna质粒结构示意图，stableselectionmarker:puromycin；reportergene:egfp；shrna使用u6启动子。28.图2是nis-shrna质粒转染neuro-2a细胞对nischarin的抑制效果示意图，其中(a)为转染后48小时用egfp荧光检测转染效率的检测结果图；(b)采用qrt-pcr检测nischarinmrna的表达的检测结果图；(c)采用westernblotting法检测nischarin蛋白水平的表达结果图；(d)为图(c)的结果统计图；*p＜0.05,**p＜0.01,与control-shrna对照比较，n＝3。29.图3是子宫内电穿孔敲降nischarin对胎鼠大脑皮层神经元迁移能力的影响结果示意图，其中(a)为control-shrna对照组e18.5胎鼠脑皮层egfp阳性神经元迁移结果示意图；(b)nis-shrna组(敲降nischarin的实验组)e18.5胎鼠脑皮层egfp阳性神经元迁移结果示意图；**p＜0.01,***p＜0.001,与control-shrna对照比较，n＝3。30.图4是子宫内电穿孔敲降nischarin对仔鼠一般发育状况的影响结果示意图；(a)为iue后出生的仔鼠体重增长情况示意图；(b)为仔鼠出毛日龄统计图；(c)为仔鼠门齿萌出日龄统计图；(d)仔鼠首次抬头日龄统计图，n＝15。31.图5是子宫内电穿孔敲降nischarin对仔鼠神经发育状况的影响结果示意图；(a)为仔鼠睁眼日龄统计图；(b)为仔鼠耳廓分离日龄统计图；(c)为仔鼠前肢抓握反射指数统计图；(d)仔鼠平面翻正反射指数统计图，n＝15；**p＜0.01表示与ctl-shrna对照组比较差异显著，n＝3；数据以平均值±se表示。32.图6是皮层神经元内源性nischarin与pak1、limk1互作示意图；(a)为pak1免疫沉淀物用nischarin抗体或pak1抗体进行免疫印迹检测结果示意图；(c)为limk1免疫沉淀物用nischarin抗体或limk1抗体进行免疫印迹检测结果示意图；(b)为用pak1抗体或nischarin抗体对nischarin免疫沉淀物进行免疫印迹检测结果示意图；(d)为用limk1抗体或nischarin抗体对nischarin免疫沉淀物进行免疫印迹检测结果示意图。33.图7是皮层神经元内源性nischarin与pak1、pak2共定位示意图；其中(a)为nischarin和pak1的共定位示意图，(b)为nischarin和pak2的共定位示意图，(c)为图(a)中方框内部分的放大图；(d)为图(b)中方框内部分的放大图；皮层神经元内源性nischarin(绿色)和pak1(红色)或pak2(红色)均有共定位，呈现黄色(白色箭头指示的部位为共定位部位)。34.图8是皮层神经元内源性nischarin抑制pak1磷酸化示意图，(a)免疫印迹实验结果示意图；(b)为p-pak(磷酸化的pak)水平统计图。35.图9是nischarin抑制pak1/limk1/cofilin的磷酸化示意图，(a)为正常细胞组、ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组免疫印迹检测结果示意图，(b)为pak1、limk1以及cofilin磷酸化程度统计图。36.图10是nischarin激活dab1而非akt/mtor的磷酸化示意图，(a)-(c)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组免疫印迹检测结果示意图，(d)为图(a)-(c)中dab1、akt、mtor磷酸化程度统计图。37.图11是nischarin依赖pak1活性调节neuro-2a细胞迁移能力示意图，(a)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组neuro-2a细胞迁移图片，(b)为neuro-2a细胞迁移能力检测结果统计图。38.图12是nischarin依赖pak活性调节neuro-2a细胞突起生长能力示意图；(a)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组neuro-2a细胞图片；比例尺长度为20μm；(b)ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组蛋白印迹法检测pak1/2的磷酸化结果图；其中，nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组做了2次测试；(c)ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组中神经细胞突起数量统计图；(d)ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组中，细胞中最长神经轴突的平均长度统计图；(e)ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组中，每个细胞的神经轴突总长度统计图。具体实施方式39.以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。40.以下实施方式中所使用的试剂、材料、仪器等均可以通过商业途径获得。以下具体实施例中，pbs为0.01m，ph7.4的pbs缓冲液，其中1m＝1mol/l。41.一种新型大脑皮层发育障碍动物模型构建方法，包括以下步骤：42.(1)分别构建针对小鼠nischarin基因并携带egfp标记的nis-shrna质粒；43.(2)选取孕期为e13.5(即胚胎期13.5天)的孕鼠行子宫内电穿孔，将绿色荧光标记(即egfp标记)的nis-shrna质粒溶液(nis-shrna质粒溶液的浓度为：1.6μg/μl，其中溶剂为蒸馏水)(或control-shrna)各2μl注射至胎鼠侧脑室，利用btx电转仪在子宫壁外对胎鼠大脑施加电脉冲刺激(设定参数为：50v脉冲，50ms，5次，间隔940ms)，最后将胚胎回置于母鼠腹腔使其继续发育；仔鼠出生后于不同发育阶段进行后续实验操作。44.在一些优选的方式中，所述构建方法还包括：45.(3)于e18.5通过与对照比较评估nischarin敲低后对小鼠大脑皮层神经元迁移定位及形态的影响；46.(4)为观察nischarin表达被干扰后对仔鼠神经发育的近远期效应，观察并记录仔鼠从出生到4周龄内的发育表征、运动能力和反射发育指标。47.步骤(1)中，nis-shrna质粒的设计：48.在genebank中查找小鼠nischarin的mrna全序列，选取4段含19个碱基的nischarin特异性靶序列作为shrna目标序列，设计nis-shrna质粒；49.序列1：5’‑cacaactgtcgcaaccgct-3’；50.序列2：5’‑tgatgccaagactgacctt-3’；51.序列3：5’‑cctcagagacaaccggatt-3’；52.序列4：5’‑agcattgccgaggttgaaa-3’。53.再合成该序列的反向互补序列，5’端为bamhi酶切位点(gatcc)，中间由tcaagag的发夹状序列将此两段序列相连，形成茎环结构，3’端为ecori酶切位点(gaattc)，并加6个t作为rna聚合酶ⅲ的转录终止子，共形成63nt的寡核苷酸正义链及其互补的反义链。54.本发明采用的4段shrna目标序列能有效抑制nischarin的表达(即敲除nischarin的表达)，并能在大鼠、小鼠体内使用。55.1.2neuro-2a细胞培养56.neuro-2a细胞于含体积分数10％胎牛血清、体积分数1％双抗(青霉素、链霉素)、体积分数44.5％opti-mem和体积分数44.5％dmem培养基中培养，在体积分数5％co2、37℃的细胞培养箱中培养。每两天换液一次，每次传代用0.25％(m/v)胰酶(含0.02％edta)溶液消化。57.1.3细胞转染及nis-shrna敲降效果鉴定58.按照lipofectaminetm3000说明书操作，采用瞬时转染法将敲降质粒转染到neuro-2a细胞。按照1μg质粒∶5μl脂质体进行转染，48h后进行后续操作。转染效率以gfp荧光阳性细胞比例来鉴定，目的基因敲降效果用免疫印迹方法检测。59.1.4实时定量rt-pcr60.刮取转染48h后的细胞，移至1.5mlrnase-free的eppendorf管，加入1mltrizol试剂，超声破碎仪粉碎脊髓组织，提取rna并逆转录成cdna。以gapdh为内对照，分别检测nischarin的表达变化。用2-δδct法计算相对于control-shrna组的nischarinmrna的相对表达量。实验独立重复3次。61.1.5免疫印迹技术(westernbolt)62.培养皿中加入适量蛋白裂解液(1mg/ml)，冰上用细胞刮收集细胞并静置10min以充分裂解。4℃，12000rpm离心30min，取上清。蛋白浓度测定用bca蛋白浓度测定试剂盒蛋白定量，取适量定量，蛋白以每1μl蛋白样本加入1μl的2×sds蛋白上样缓冲液的比例加入适量蛋白上样缓冲液，充分混匀后100℃沸水煮10min，使蛋白充分变性，样品蛋白(20μg)行sds-page电泳并转膜。体积分数5﹪羊血清封闭硝酸纤维素膜2h后，加入nischarin抗体(nischarin抗体与抗体稀释液的体积比为1：1000，)或gapdh抗体(gapdh抗体与抗体稀释液的体积比为1:2000)，4℃反应过夜。次日洗膜，加入1：1000辣根过氧化物酶标记的二抗(也就是说，辣根过氧化物酶标记的二抗与抗体稀释液的体积比为1：1000)，室温孵育2h，洗膜后加ecl显色剂，x片显影。imagej图象分析软件根据光密度定量分析。所述抗体稀释液为5％bsa(取bsa0.5g，溶于10ml1×tbst缓冲液中)。63.1.6动物准备64.将40只雌鼠随机按3～4﹕1与雄鼠合笼，合笼之后于次日清晨观察阴道栓，标记怀孕雌鼠并分别记录怀胎时间。65.1.7子宫内电穿孔(iue)66.取e13.5的孕鼠，异氟烷吸入麻醉。仰卧位置于手术台，消毒后用无菌纱布覆盖腹部，距离腹中线约0.5cm处纵向切开2.5cm左右的口子，将子宫从腹腔中拉出置于纱布上。在近距离光源的透射下，找到胎鼠脑中线，用拉制的玻璃针(口径50μm)将混有fastgreenfcf±1μg的nis-shrnapsilv-u6-gfp质粒(1.6μg/μl)或对照组质粒cshctr001-lvu6(1.3μg/μl)注入左侧脑室中，并用型号为geminix2的btx电转仪的镊状电极夹住胚胎脑，给以一个序列的电脉冲刺激，设定参数为：50v脉冲，50ms，5次，间隔940ms，结束后将子宫放回腹腔，逐层缝合。67.1.8组织切片的制备及观察68.鼠胚在母体内继续发育4d之后，重新打开腹腔；将导入质粒的鼠胚取出,置于含有0.01mol/lpbs的六孔板中；剥离脑组织，用4％多聚甲醛溶液固定2～4h；30％蔗糖-pbs溶液处理，每隔2h换液一次，共换液2～3次；冰冻切片机冠状面切片，切片厚度为15～20lm，每个样品连续切片。在正置荧光显微镜下观察切片，并拍照。69.1.9神经发育指标检测70.测定时间：从仔鼠出生后每天检测小鼠一般情况，记录体重、出毛时间、门齿萌出时间等。同时记录以下检测神经发育指标：71.1)耳廓分离：双侧耳廓均分离者结果为阳性，单侧分离者不计。72.2)平面翻正：四肢朝上扶持2s，小鼠在2s内四肢着地翻正，连续3次者结果为阳性。不足3次者结果为阴性。73.3)前肢抓握：用牙签端轻触小鼠前爪，观察小鼠被触前肢是否立即有抓握现象，自然抓握3次者结果为阳性，不足3次者结果为阴性。74.4)睁眼：双侧眼睛睁开者结果为阳性，单侧眼睁开者不记。75.1.10统计方法76.数据用平均值±标准误表示。用spss13.0软件进行统计分析，各组数据之间比较采用one-wayanova，两组之间比较用独立样本的t检验。p《0.05为有显著统计学意义。77.2探讨nischarin介导reelin信号通路的机制，进行以下步骤：78.(1)在原代培养的小鼠皮层神经元上，利用免疫共沉淀法和免疫荧光染色法检测内源性nischarin和pak1和limk1的互作情况，明确nischarin影响reelin信号通路的可能作用位点；79.(2)构建敲低nischarin表达的质粒载体nisch-shrna，包装扩增后用nisch-shrna及其对照质粒转染神经细胞，用westernblot法检测pak1/limk1/cofilin及pi3k/akt/mtor通路各信号分子的磷酸化水平，明确nischarin对reelin主要信号通路的调控作用；80.(3)应用reelin下游信号通路的抑制剂(pak1抑制剂ipa3)进行药理学干预，观察其是否逆转nischarin敲低对细胞迁移及树突形态变化的影响，进而验证nischarin对shrna质粒或对照质粒转染到neuro-2a细胞。按照1μg质粒dna∶5μl脂质体进行转染，24h后进行后续操作。转染效率以westernblot(免疫印迹)鉴定。93.2.7细胞划痕实验94.细胞转染后24h吸干培养液，用灭菌枪头在皿底十字交叉划线，pbs清洗细胞3次，加入新鲜培养液后再加入dehp(100nmol·l-1)孵育，对照组加入dmso。培养12、24和48h后分别拍照观察。用imagej软件测量各时间点划痕间的距离，每个皿随机选取4个部位测量，计算平均迁移距离和平均每小时迁移速率「细胞迁移速率(μm·h-1)＝(a时划痕间距-b时划痕间距)/(b时-a时)。95.2.8突起生长观察96.细胞转染后24h吸干培养液，加入新细胞培养液后再加入dehp(100nmol·l-1)孵育，对照组加入dmso。培养6、12、24和48h后分别拍照观察。神经细胞突起长度用imagej软件测量，每个皿随机测量5个视野中的细胞，长度大于一倍胞体者认定为有效突起并测量其长度，计算平均突起长度(meanneuritelength)；计数有突起细胞和所有细胞总数，计算有突起细胞百分比(有突起细胞的百分比＝有突起细胞数/细胞总数)。97.2.9统计方法98.数据用平均值±标准误表示。用spss13.0软件进行统计分析，各组数据之间比较采用one-wayanova，两组之间比较用独立样本的t检验。p《0.05为有显著统计学意义。99.测试结果100.3.1nis-shrna质粒的构建101.在genebank中查找小鼠nischarin的mrna全序列，基因编号为xm_240330.5，选取4段含19个碱基的nischarin特异性靶序列作为shrna目标序列：102.序列1：5’‑cacaactgtcgcaaccgct-3’；(seqidno.1)103.序列2：5’‑tgatgccaagactgacctt-3’；(seqidno.2)104.序列3：5’‑cctcagagacaaccggatt-3’；(seqidno.3)105.序列4：5’‑agcattgccgaggttgaaa-3’，(seqidno.4)106.再合成该序列的反向互补序列，[0107]5’端为bamhi酶切位点(gatcc)，中间由tcaagag的发夹状序列将此两段序列(所述两段序列指的是：序列1及其互补序列或者序列2及其互补序列或者序列3及其互补序列或者序列4及其互补序列)相连，形成茎环结构，3’端为ecori酶切位点(gaattc)，并加6个t作为rna聚合酶ⅲ的转录终止子，共形成63nt的寡核苷酸正义链及其互补的反义链；合成的序列分别命名为nis-shrnal，nis-shrna2，nis-shrna3，nis-shrna4。[0108]同时按上述原则设计阴性对照序列，命名为control-shrna(简称ctl-shrna)。[0109]nis-shrnal：[0110]gatcc cacaactgtcgcaaccgct tcaagag gtgttgacagcgttggcga gaattctttttt(seqidno.5)[0111]nis-shrna2：[0112]gatcc tgatgccaagactgacctt tcaagag actacggttctgactggaa gaattctttttt(seqidno.6)[0113]nis-shrna3：shrna组(即敲降nischarin的实验组)e18.5胎鼠脑皮层egfp阳性神经元迁移结果示意图；(c)为图3a、3b中迁移结果的统计图。与对照组比较，皮层神经元转染nis-shrna后迁移能力增强，停滞于iz区的神经元数量减少，而迁移到上皮层的神经元数量增多。**p＜0.01,***p＜0.001,与control-shrna对照比较，n＝3。[0127]3.4子宫电穿孔抑敲降nischarin表达对仔鼠一般发育状况的影响[0128]行子宫电穿孔(iue)胚胎实验后，待仔鼠出生，每天检测仔鼠一般情况，记录体重、出毛时间、门齿萌出和抬头时间。[0129]图4是子宫内电穿孔敲降nischarin对仔鼠一般发育状况的影响结果示意图；(a)为iue后出生的仔鼠体重增长情况示意图；(b)为仔鼠出毛日龄统计图；(c)为仔鼠门齿萌出日龄统计图；(d)仔鼠首次抬头日龄统计图，n＝15。[0130]图4显示，与control-shrna组小鼠比较，nischarin敲降组的体重、出毛时间、门齿萌出时间和抬头时间等各项指标均无显著差异，说明nischarin敲降不影响小鼠一般身体发育。[0131]3.5子宫电穿孔抑敲降nischarin表达对仔鼠神经发育状况的影响[0132]为明确nischarin敲降后对小鼠的神经发育情况的影响，待仔鼠出生，每天检测仔鼠耳廓分离、睁眼日期、平面翻正反射和前肢抓握情况，结果如图5显示。[0133]图5是子宫内电穿孔敲降nischarin对仔鼠神经发育状况的影响结果示意图；(a)为仔鼠睁眼日龄统计图；(b)为仔鼠耳廓分离日龄统计图；(c)为仔鼠前肢抓握反射指数统计图；(d)仔鼠平面翻正反射指数统计图，n＝15；**p＜0.01表示与ctl-shrna对照组比较差异显著，n＝3；数据以平均值±se表示。[0134]与control-shrna组(即ctl-shrna组)小鼠比较，nischarin敲降组(即nis-shrna组)的睁眼日龄无显著差异，但耳廓分离日龄延后(p＜0.01)，此外，从出生第1天(即p1)起，敲降组仔鼠的前肢抓握反射和平面翻正反射指数均低于对照组，分别直至第8天(p8)和第6天(p6)才与对照组持平。[0135]4.1co-ip显示皮层神经元nischarin可与pak1、limk1互作[0136]为明确神经元上的内源性nischarin是否和reelin通路的信号分子有直接关系，在小鼠脑皮层组织上用免疫共沉淀(co-ip)观察了nischarin和reelin信号通路的重要分子pak1和limk1的互作关系，发现nischarin和pak1、limk1相互作用(图6a,6b)。图6中，将小鼠皮层神经元的裂解物与兔抗pak1或limk1多克隆抗体与鼠抗nischarin单克隆抗体及其g免疫球蛋白一起孵育，并用g蛋白-琼脂糖珠沉淀结果示意图。(a)为pak1免疫沉淀物用nischarin抗体或pak1抗体进行免疫印迹检测结果示意图；(c)为limk1免疫沉淀物用nischarin抗体或limk1抗体进行免疫印迹检测结果示意图；(b)为用pak1抗体或nischarin抗体对nischarin免疫沉淀物进行免疫印迹检测结果示意图；(d)为用limk1抗体或nischarin抗体对nischarin免疫沉淀物进行免疫印迹检测结果示意图。[0137]4.2免疫荧光染色显示皮层神经元nischarin可与pak互作[0138]为进一步证明神经元上nischarin和pak是否存在共定位现象，在原代培养的皮层神经元上用双重免疫荧光染色法进行形态学观察，发现和co-ip结果一致，神经元内源性nischarin和pak1、pak2均存在共定位现象(图7)。图5中，双重免疫荧光染色结果显示皮层神经元内源性nischarin(绿色)和pak1(红色)或pak2(红色)均有共定位，呈现黄色，提示nischarin和pak1(p21蛋白激活激酶1)或pak2(p21蛋白激活激酶2)均能互作。[0139]4.3皮层神经元的nischarin可抑制pak1的磷酸化[0140]为明确这种互作关系是否影响了pak的磷酸化活性，构建了针对nischarin基因并携带egfp的shrna质粒载体以及相应的对照control-shrna质粒载体。在验证质粒的表达效果后，用慢病毒包装系统对其进行包装，并收获慢病毒颗粒。用携带nis-shrna的慢病毒感染神经元，再用westernblot法检测p-pak水平(p-pak水平为p-pak占总pak的比例)，结果显示抑制nischarin表达可明显增加pak1的磷酸化表达，而对pak2则无此效应(图8)。[0141]图8是皮层神经元内源性nischarin抑制pak1磷酸化示意图，(a)免疫印迹实验结果示意图；(b)为图(a)结果的统计图；其中，gapdh是内参；nis指的是nischarin蛋白的表达。图8中免疫印迹实验结果显示用nis-shrna敲降皮层神经元内源性nischarin的表达后解除了对pak1磷酸化激活的抑制，但对pak2的磷酸化无影响。***p＜0.001表示与ctl-shrna对照组比较差异非常显著，n＝3；数据以平均值±se表示。[0142]4.4nischarin对pak1-limk1-cofilin信号通路的磷酸化调控[0143]免疫共沉淀结果显示，内源性蛋白nischarin与pak1、limk1之间存在相互作用。为进一步研究神经细胞中的nischarin是否能调控reelin信号通路中的pak1和limk1的磷酸化，本发明用nis-shrna及其对照质粒转染neuro-2a细胞，干扰内源性nischarin的表达后，再用免疫印迹方法检测pak1-limk1-cofilin的磷酸化程度，分析其与nischarin表达量的关系。结果显示，与未经转染处理的正常细胞比较，control-shrna转染组细胞的各指标均未发生显著变化。但nis-shrna转染后，内源性nischarin表达量降低75％(p＜0.01)，于此同时，p-pak1/pak1比值、p-limk1/limk1比值及p-cofilin/cofilin比值分别增加了41.5％(p＜0.05)、40％(p＜0.05)及57.5％(p＜0.01)(图9)，说明敲降nischarin的表达可显著增高pak1-limk1-cofilin信号通路的磷酸化活性，则nischarin负调控该信号通路。[0144]图9是nischarin抑制pak1/limk1/cofilin的磷酸化示意图，(a)为正常细胞组、control-shrna转染组细胞组、nis-shrna转染细胞组免疫印迹检测结果示意图，(b)为pak1、limk1以及cofilin磷酸化程度统计图。图9免疫印迹实验结果显示用nis-shrna敲降neuro-2a的nischarin表达后pak1、limk1以及cofilin磷酸化程度明显增加，说明内源性nischarin可抑制pak1/limk1/cofilin的磷酸化；*p＜0.05，**p＜0.01表示与ctl-shrna对照组比较差异显著，n＝3；数据以平均值±se表示。[0145]4.5nischarin对dab1/akt/mtor信号通路的磷酸化调控[0146]用nis-shrna干扰内源性nischarin的表达后，本发明又用免疫印迹方法检测dab1/akt/mtor的磷酸化程度，分析其与nischarin表达量的关系。结果显示，与control-shrna转染组细胞比较，nis-shrna转染后，p-dab1/dab1比值显著降低(p＜0.05)，但p-akt/akt、p-mtor/mtor比值变化不大(图10)，说明内源性nischarin的表达可激活reelin信号通路中dab1的磷酸化活性，但对下游信号akt和mtor的影响不大。[0147]图10是nischarin激活dab1而非akt/mtor的磷酸化示意图，图(a)-(c)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组免疫印迹检测结果示意图，(d)为图(a)-(c)中dab1、akt、mtor磷酸化程度统计图；其中，nis-shrna代表nischarin蛋白被敲除了，ctl-shrna是对照组，nischarin蛋白没有被敲除。图(a)-(c)中有两组nis-shrna，表示重复做的，避免偶然性；两组ctl-shrna表示重复做的，避免偶然性。图10中，用nis-shrna敲降neuro-2a的nischarin表达后dab1磷酸化程度明显下降，说明内源性nischarin可激活dab1的磷酸化，但其对akt和mtor的磷酸化无明显影响。*p＜0.05表示与ctl-shrna对照组比较差异显著，n＝3；数据以平均值±se表示，其中，p-dab1，p-akt，p-mtor分别表示磷酸化的dab1，akt，mtor。[0148]4.6nischarin依赖pak1活性调节neuro-2a细胞迁移能力[0149]上述结果表明内源性蛋白nischarin与pak1、limk1之间存在相互作用，且nischarin可抑制pak1/limk1/cofilin的磷酸化，而激活dab1的磷酸化。为进一步明确nischarin的抑制作用是依赖哪一通路发挥作用，本发明用pak1的特异性抑制剂ipa3处理被敲降nischarin表达的neuro-2a细胞，并行划痕实验，结果发现敲降nischarin使细胞迁移能力显著增加(p＜0.001)，但ipa3处理很大程度逆转了这种促进作用(p＜0.001，图11)，说明nischarin正是通过抑制reelin信号通路下游分子pak1起作用的。[0150]图11是nischarin依赖pak1活性调节neuro-2a细胞迁移能力示意图，(a)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组划痕实验结果示意图，(b)为neuro-2a细胞迁移能力检测结果统计图。图11中，用nis-shrna-3转染和pak1抑制剂ipa3处理的neuro-2a细胞迁移照片；nis-shrna敲降neuro-2a细胞内源性nischarin表达48h后使细胞迁移能力显著增强，但ipa3处理逆转了nis-shrna引起的神经细胞迁移能力增强。***p《0.001表示ctl-shrna和nis-shrna两组之间的差异显著，n＝3。###p《0.001表示nis-shrna和nis-shrna ipa3之间的差异显著，n＝3。[0151]4.7nischarin依赖pak活性调节neuro-2a细胞突起生长能力[0152]用nis-shrna敲降neuro-2a细胞的内源性nischarin蛋白表达后，细胞形态发生变化，细胞突起显著增多增长(图12a)。用pak1的抑制剂ipa3处理后，蛋白印迹法检测pak1/2的磷酸化发现p-pak1显著下降，而p-pak2则未受影响(图12b)。进一步统计neuro-2a细胞的突起生长情况后发现，ipa3处理逆转了nis-shrna引起的神经细胞突起数量增加、细胞中最长神经轴突的平均长度的增长和每个细胞的神经轴突总长度的增加(图12c、12d、12e)。以上结果说明nischarin抑制神经细胞突起生长是通过激活reelin下游信号pak1发挥作用的。[0153]图12中，图12(c)、(d)、(e)的结果说明了：ipa3处理逆转了nis-shrna引起的神经细胞突起数量(c)、细胞中最长神经轴突的平均长度(d)和每个细胞的神经轴突总长度(e)的增加。***p《0.001表示ctl-shrna和nis-shrna两组之间的差异显著，n＝3；#p《0.05，##p《0.01表示nis-shrna和nis-shrna ipa3两组之间的差异显著，n＝3。[0154]综上，在大脑皮层发育过程中，nischarin蛋白的表达通过调控皮层神经元的迁移活动参与脑发育的进程。通过子宫电穿孔(iue)干扰皮层神经元内源性nischarin的表达可造成胎鼠大脑皮层神经元迁移失控，造成形态学和功能学上的异常，产生典型的mcd症状。[0155]神经元上内源性nischarin可以与reelin信号通路中的pak1和pak2发生互作，并抑制pak1而非pak2的磷酸化激活。[0156]nischarin依赖reelin信号通路中的pak1及其下游limk1/cofilin信号分子影响神经细胞的迁移和突起生长功能。[0157]显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。当前第1页12当前第1页12
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：：2.目前较常采用的mcd(大脑皮质发育畸形malformationofcorticaldevelopment，mcd)动物模型包括基因型。reeler小鼠是采用较多的基因型mcd小鼠模型之一，但其病理机制尚未完全研究清楚，部分研究结果还存在一些矛盾之处，因而影响了其科研价值。技术实现要素：3.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种新型大脑皮层发育障碍动物模型构建方法及应用。4.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：5.一种新型大脑皮层发育障碍动物模型构建方法，包括以下步骤：6.(1)分别构建针对小鼠nischarin基因并携带egfp标记的nis-shrna质粒；7.(2)选取孕期为e13.5的孕鼠行子宫内电穿孔，将egfp标记的nis-shrna质粒注射至胎鼠侧脑室，对胎鼠大脑施加电脉冲刺激，最后将胚胎回置于母鼠腹腔使其继续发育。8.进一步地，还包括以下步骤：9.(3)于e18.5通过与对照比较评估nischarin敲低后对小鼠大脑皮层神经元迁移定位及形态的影响；10.(4)观察并记录仔鼠从出生到4周龄内的发育表征、运动能力和反射发育指标。11.进一步地，步骤(1)中，nis-shrna质粒的构建：12.查找小鼠nischarin的mrna全序列，选取4段含19个碱基的nischarin特异性靶序列作为shrna目标序列，设计nis-shrna质粒；shrna目标序列如下：13.序列1：5’‑cacaactgtcgcaaccgct-3’；14.序列2：5’‑tgatgccaagactgacctt-3’；15.序列3：5’‑cctcagagacaaccggatt-3’；16.序列4：5’‑agcattgccgaggttgaaa-3’17.再合成shrna目标序列的反向互补序列，5’端为bamhi酶切位点(gatcc)，中间由tcaagag的发夹状序列将此两段序列相连，形成茎环结构，3’端为ecori酶切位点(gaattc)，并加6个t作为rna聚合酶ⅲ的转录终止子，共形成63nt的寡核苷酸正义链及其互补的反义链。18.nischarin在大脑皮质发育中的应用，nischarin和reelin信号通路的pak1和limk1的相互作用。19.进一步地，nis-shrna质粒及其对照质粒转染neuro-2a细胞，再用免疫印迹方法检测pak1、limk1、cofilin的磷酸化程度，得到nischarin抑制pak1、limk1、cofilin的磷酸化。20.nischarin在大脑皮质发育中的应用，nischarin对dab1/akt/mtor信号通路的磷酸化调控。21.进一步地，nischarin的表达能够激活reelin信号通路中dab1的磷酸化活性。22.nischarin在大脑皮质发育中的应用，nischarin通过抑制reelin信号通路下游分子pak1，调节neuro-2a细胞迁移能力。23.nischarin在大脑皮质发育中的应用，nischarin激活pak1活性调节neuro-2a细胞突起生长能力。24.本发明的有益效果是：25.(1)本发明利用子宫内电穿孔在胚胎期对nischarin的表达进行定时、定位干扰，制备得到一组新型大脑皮层发育障碍小鼠模型，并借助该模型进行研究，得到：在大脑皮层发育过程中，nischarin在神经元中的表达受reelin影响发生时空上的动态变化，通过调控pak1/limk1/cofilin通路，以及pi3k/akt/mtor通路，影响神经元的迁移过程和迁移到位神经元树突发育过程，最终与reelin蛋白一起精细调控大脑皮层发育。26.(2)本发明构建针对nischarin蛋白的mcd小鼠模型有望进一步阐明reeler小鼠模型的具体分子机制，从而为深入研究mcd致病机理及其防治打下基础。附图说明27.图1是nis-shrna质粒结构示意图，stableselectionmarker:puromycin；reportergene:egfp；shrna使用u6启动子。28.图2是nis-shrna质粒转染neuro-2a细胞对nischarin的抑制效果示意图，其中(a)为转染后48小时用egfp荧光检测转染效率的检测结果图；(b)采用qrt-pcr检测nischarinmrna的表达的检测结果图；(c)采用westernblotting法检测nischarin蛋白水平的表达结果图；(d)为图(c)的结果统计图；*p＜0.05,**p＜0.01,与control-shrna对照比较，n＝3。29.图3是子宫内电穿孔敲降nischarin对胎鼠大脑皮层神经元迁移能力的影响结果示意图，其中(a)为control-shrna对照组e18.5胎鼠脑皮层egfp阳性神经元迁移结果示意图；(b)nis-shrna组(敲降nischarin的实验组)e18.5胎鼠脑皮层egfp阳性神经元迁移结果示意图；**p＜0.01,***p＜0.001,与control-shrna对照比较，n＝3。30.图4是子宫内电穿孔敲降nischarin对仔鼠一般发育状况的影响结果示意图；(a)为iue后出生的仔鼠体重增长情况示意图；(b)为仔鼠出毛日龄统计图；(c)为仔鼠门齿萌出日龄统计图；(d)仔鼠首次抬头日龄统计图，n＝15。31.图5是子宫内电穿孔敲降nischarin对仔鼠神经发育状况的影响结果示意图；(a)为仔鼠睁眼日龄统计图；(b)为仔鼠耳廓分离日龄统计图；(c)为仔鼠前肢抓握反射指数统计图；(d)仔鼠平面翻正反射指数统计图，n＝15；**p＜0.01表示与ctl-shrna对照组比较差异显著，n＝3；数据以平均值±se表示。32.图6是皮层神经元内源性nischarin与pak1、limk1互作示意图；(a)为pak1免疫沉淀物用nischarin抗体或pak1抗体进行免疫印迹检测结果示意图；(c)为limk1免疫沉淀物用nischarin抗体或limk1抗体进行免疫印迹检测结果示意图；(b)为用pak1抗体或nischarin抗体对nischarin免疫沉淀物进行免疫印迹检测结果示意图；(d)为用limk1抗体或nischarin抗体对nischarin免疫沉淀物进行免疫印迹检测结果示意图。33.图7是皮层神经元内源性nischarin与pak1、pak2共定位示意图；其中(a)为nischarin和pak1的共定位示意图，(b)为nischarin和pak2的共定位示意图，(c)为图(a)中方框内部分的放大图；(d)为图(b)中方框内部分的放大图；皮层神经元内源性nischarin(绿色)和pak1(红色)或pak2(红色)均有共定位，呈现黄色(白色箭头指示的部位为共定位部位)。34.图8是皮层神经元内源性nischarin抑制pak1磷酸化示意图，(a)免疫印迹实验结果示意图；(b)为p-pak(磷酸化的pak)水平统计图。35.图9是nischarin抑制pak1/limk1/cofilin的磷酸化示意图，(a)为正常细胞组、ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组免疫印迹检测结果示意图，(b)为pak1、limk1以及cofilin磷酸化程度统计图。36.图10是nischarin激活dab1而非akt/mtor的磷酸化示意图，(a)-(c)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组免疫印迹检测结果示意图，(d)为图(a)-(c)中dab1、akt、mtor磷酸化程度统计图。37.图11是nischarin依赖pak1活性调节neuro-2a细胞迁移能力示意图，(a)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组neuro-2a细胞迁移图片，(b)为neuro-2a细胞迁移能力检测结果统计图。38.图12是nischarin依赖pak活性调节neuro-2a细胞突起生长能力示意图；(a)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组neuro-2a细胞图片；比例尺长度为20μm；(b)ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组蛋白印迹法检测pak1/2的磷酸化结果图；其中，nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组做了2次测试；(c)ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组中神经细胞突起数量统计图；(d)ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组中，细胞中最长神经轴突的平均长度统计图；(e)ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组中，每个细胞的神经轴突总长度统计图。具体实施方式39.以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。40.以下实施方式中所使用的试剂、材料、仪器等均可以通过商业途径获得。以下具体实施例中，pbs为0.01m，ph7.4的pbs缓冲液，其中1m＝1mol/l。41.一种新型大脑皮层发育障碍动物模型构建方法，包括以下步骤：42.(1)分别构建针对小鼠nischarin基因并携带egfp标记的nis-shrna质粒；43.(2)选取孕期为e13.5(即胚胎期13.5天)的孕鼠行子宫内电穿孔，将绿色荧光标记(即egfp标记)的nis-shrna质粒溶液(nis-shrna质粒溶液的浓度为：1.6μg/μl，其中溶剂为蒸馏水)(或control-shrna)各2μl注射至胎鼠侧脑室，利用btx电转仪在子宫壁外对胎鼠大脑施加电脉冲刺激(设定参数为：50v脉冲，50ms，5次，间隔940ms)，最后将胚胎回置于母鼠腹腔使其继续发育；仔鼠出生后于不同发育阶段进行后续实验操作。44.在一些优选的方式中，所述构建方法还包括：45.(3)于e18.5通过与对照比较评估nischarin敲低后对小鼠大脑皮层神经元迁移定位及形态的影响；46.(4)为观察nischarin表达被干扰后对仔鼠神经发育的近远期效应，观察并记录仔鼠从出生到4周龄内的发育表征、运动能力和反射发育指标。47.步骤(1)中，nis-shrna质粒的设计：48.在genebank中查找小鼠nischarin的mrna全序列，选取4段含19个碱基的nischarin特异性靶序列作为shrna目标序列，设计nis-shrna质粒；49.序列1：5’‑cacaactgtcgcaaccgct-3’；50.序列2：5’‑tgatgccaagactgacctt-3’；51.序列3：5’‑cctcagagacaaccggatt-3’；52.序列4：5’‑agcattgccgaggttgaaa-3’。53.再合成该序列的反向互补序列，5’端为bamhi酶切位点(gatcc)，中间由tcaagag的发夹状序列将此两段序列相连，形成茎环结构，3’端为ecori酶切位点(gaattc)，并加6个t作为rna聚合酶ⅲ的转录终止子，共形成63nt的寡核苷酸正义链及其互补的反义链。54.本发明采用的4段shrna目标序列能有效抑制nischarin的表达(即敲除nischarin的表达)，并能在大鼠、小鼠体内使用。55.1.2neuro-2a细胞培养56.neuro-2a细胞于含体积分数10％胎牛血清、体积分数1％双抗(青霉素、链霉素)、体积分数44.5％opti-mem和体积分数44.5％dmem培养基中培养，在体积分数5％co2、37℃的细胞培养箱中培养。每两天换液一次，每次传代用0.25％(m/v)胰酶(含0.02％edta)溶液消化。57.1.3细胞转染及nis-shrna敲降效果鉴定58.按照lipofectaminetm3000说明书操作，采用瞬时转染法将敲降质粒转染到neuro-2a细胞。按照1μg质粒∶5μl脂质体进行转染，48h后进行后续操作。转染效率以gfp荧光阳性细胞比例来鉴定，目的基因敲降效果用免疫印迹方法检测。59.1.4实时定量rt-pcr60.刮取转染48h后的细胞，移至1.5mlrnase-free的eppendorf管，加入1mltrizol试剂，超声破碎仪粉碎脊髓组织，提取rna并逆转录成cdna。以gapdh为内对照，分别检测nischarin的表达变化。用2-δδct法计算相对于control-shrna组的nischarinmrna的相对表达量。实验独立重复3次。61.1.5免疫印迹技术(westernbolt)62.培养皿中加入适量蛋白裂解液(1mg/ml)，冰上用细胞刮收集细胞并静置10min以充分裂解。4℃，12000rpm离心30min，取上清。蛋白浓度测定用bca蛋白浓度测定试剂盒蛋白定量，取适量定量，蛋白以每1μl蛋白样本加入1μl的2×sds蛋白上样缓冲液的比例加入适量蛋白上样缓冲液，充分混匀后100℃沸水煮10min，使蛋白充分变性，样品蛋白(20μg)行sds-page电泳并转膜。体积分数5﹪羊血清封闭硝酸纤维素膜2h后，加入nischarin抗体(nischarin抗体与抗体稀释液的体积比为1：1000，)或gapdh抗体(gapdh抗体与抗体稀释液的体积比为1:2000)，4℃反应过夜。次日洗膜，加入1：1000辣根过氧化物酶标记的二抗(也就是说，辣根过氧化物酶标记的二抗与抗体稀释液的体积比为1：1000)，室温孵育2h，洗膜后加ecl显色剂，x片显影。imagej图象分析软件根据光密度定量分析。所述抗体稀释液为5％bsa(取bsa0.5g，溶于10ml1×tbst缓冲液中)。63.1.6动物准备64.将40只雌鼠随机按3～4﹕1与雄鼠合笼，合笼之后于次日清晨观察阴道栓，标记怀孕雌鼠并分别记录怀胎时间。65.1.7子宫内电穿孔(iue)66.取e13.5的孕鼠，异氟烷吸入麻醉。仰卧位置于手术台，消毒后用无菌纱布覆盖腹部，距离腹中线约0.5cm处纵向切开2.5cm左右的口子，将子宫从腹腔中拉出置于纱布上。在近距离光源的透射下，找到胎鼠脑中线，用拉制的玻璃针(口径50μm)将混有fastgreenfcf±1μg的nis-shrnapsilv-u6-gfp质粒(1.6μg/μl)或对照组质粒cshctr001-lvu6(1.3μg/μl)注入左侧脑室中，并用型号为geminix2的btx电转仪的镊状电极夹住胚胎脑，给以一个序列的电脉冲刺激，设定参数为：50v脉冲，50ms，5次，间隔940ms，结束后将子宫放回腹腔，逐层缝合。67.1.8组织切片的制备及观察68.鼠胚在母体内继续发育4d之后，重新打开腹腔；将导入质粒的鼠胚取出,置于含有0.01mol/lpbs的六孔板中；剥离脑组织，用4％多聚甲醛溶液固定2～4h；30％蔗糖-pbs溶液处理，每隔2h换液一次，共换液2～3次；冰冻切片机冠状面切片，切片厚度为15～20lm，每个样品连续切片。在正置荧光显微镜下观察切片，并拍照。69.1.9神经发育指标检测70.测定时间：从仔鼠出生后每天检测小鼠一般情况，记录体重、出毛时间、门齿萌出时间等。同时记录以下检测神经发育指标：71.1)耳廓分离：双侧耳廓均分离者结果为阳性，单侧分离者不计。72.2)平面翻正：四肢朝上扶持2s，小鼠在2s内四肢着地翻正，连续3次者结果为阳性。不足3次者结果为阴性。73.3)前肢抓握：用牙签端轻触小鼠前爪，观察小鼠被触前肢是否立即有抓握现象，自然抓握3次者结果为阳性，不足3次者结果为阴性。74.4)睁眼：双侧眼睛睁开者结果为阳性，单侧眼睁开者不记。75.1.10统计方法76.数据用平均值±标准误表示。用spss13.0软件进行统计分析，各组数据之间比较采用one-wayanova，两组之间比较用独立样本的t检验。p《0.05为有显著统计学意义。77.2探讨nischarin介导reelin信号通路的机制，进行以下步骤：78.(1)在原代培养的小鼠皮层神经元上，利用免疫共沉淀法和免疫荧光染色法检测内源性nischarin和pak1和limk1的互作情况，明确nischarin影响reelin信号通路的可能作用位点；79.(2)构建敲低nischarin表达的质粒载体nisch-shrna，包装扩增后用nisch-shrna及其对照质粒转染神经细胞，用westernblot法检测pak1/limk1/cofilin及pi3k/akt/mtor通路各信号分子的磷酸化水平，明确nischarin对reelin主要信号通路的调控作用；80.(3)应用reelin下游信号通路的抑制剂(pak1抑制剂ipa3)进行药理学干预，观察其是否逆转nischarin敲低对细胞迁移及树突形态变化的影响，进而验证nischarin对shrna质粒或对照质粒转染到neuro-2a细胞。按照1μg质粒dna∶5μl脂质体进行转染，24h后进行后续操作。转染效率以westernblot(免疫印迹)鉴定。93.2.7细胞划痕实验94.细胞转染后24h吸干培养液，用灭菌枪头在皿底十字交叉划线，pbs清洗细胞3次，加入新鲜培养液后再加入dehp(100nmol·l-1)孵育，对照组加入dmso。培养12、24和48h后分别拍照观察。用imagej软件测量各时间点划痕间的距离，每个皿随机选取4个部位测量，计算平均迁移距离和平均每小时迁移速率「细胞迁移速率(μm·h-1)＝(a时划痕间距-b时划痕间距)/(b时-a时)。95.2.8突起生长观察96.细胞转染后24h吸干培养液，加入新细胞培养液后再加入dehp(100nmol·l-1)孵育，对照组加入dmso。培养6、12、24和48h后分别拍照观察。神经细胞突起长度用imagej软件测量，每个皿随机测量5个视野中的细胞，长度大于一倍胞体者认定为有效突起并测量其长度，计算平均突起长度(meanneuritelength)；计数有突起细胞和所有细胞总数，计算有突起细胞百分比(有突起细胞的百分比＝有突起细胞数/细胞总数)。97.2.9统计方法98.数据用平均值±标准误表示。用spss13.0软件进行统计分析，各组数据之间比较采用one-wayanova，两组之间比较用独立样本的t检验。p《0.05为有显著统计学意义。99.测试结果100.3.1nis-shrna质粒的构建101.在genebank中查找小鼠nischarin的mrna全序列，基因编号为xm_240330.5，选取4段含19个碱基的nischarin特异性靶序列作为shrna目标序列：102.序列1：5’‑cacaactgtcgcaaccgct-3’；(seqidno.1)103.序列2：5’‑tgatgccaagactgacctt-3’；(seqidno.2)104.序列3：5’‑cctcagagacaaccggatt-3’；(seqidno.3)105.序列4：5’‑agcattgccgaggttgaaa-3’，(seqidno.4)106.再合成该序列的反向互补序列，[0107]5’端为bamhi酶切位点(gatcc)，中间由tcaagag的发夹状序列将此两段序列(所述两段序列指的是：序列1及其互补序列或者序列2及其互补序列或者序列3及其互补序列或者序列4及其互补序列)相连，形成茎环结构，3’端为ecori酶切位点(gaattc)，并加6个t作为rna聚合酶ⅲ的转录终止子，共形成63nt的寡核苷酸正义链及其互补的反义链；合成的序列分别命名为nis-shrnal，nis-shrna2，nis-shrna3，nis-shrna4。[0108]同时按上述原则设计阴性对照序列，命名为control-shrna(简称ctl-shrna)。[0109]nis-shrnal：[0110]gatcc cacaactgtcgcaaccgct tcaagag gtgttgacagcgttggcga gaattctttttt(seqidno.5)[0111]nis-shrna2：[0112]gatcc tgatgccaagactgacctt tcaagag actacggttctgactggaa gaattctttttt(seqidno.6)[0113]nis-shrna3：shrna组(即敲降nischarin的实验组)e18.5胎鼠脑皮层egfp阳性神经元迁移结果示意图；(c)为图3a、3b中迁移结果的统计图。与对照组比较，皮层神经元转染nis-shrna后迁移能力增强，停滞于iz区的神经元数量减少，而迁移到上皮层的神经元数量增多。**p＜0.01,***p＜0.001,与control-shrna对照比较，n＝3。[0127]3.4子宫电穿孔抑敲降nischarin表达对仔鼠一般发育状况的影响[0128]行子宫电穿孔(iue)胚胎实验后，待仔鼠出生，每天检测仔鼠一般情况，记录体重、出毛时间、门齿萌出和抬头时间。[0129]图4是子宫内电穿孔敲降nischarin对仔鼠一般发育状况的影响结果示意图；(a)为iue后出生的仔鼠体重增长情况示意图；(b)为仔鼠出毛日龄统计图；(c)为仔鼠门齿萌出日龄统计图；(d)仔鼠首次抬头日龄统计图，n＝15。[0130]图4显示，与control-shrna组小鼠比较，nischarin敲降组的体重、出毛时间、门齿萌出时间和抬头时间等各项指标均无显著差异，说明nischarin敲降不影响小鼠一般身体发育。[0131]3.5子宫电穿孔抑敲降nischarin表达对仔鼠神经发育状况的影响[0132]为明确nischarin敲降后对小鼠的神经发育情况的影响，待仔鼠出生，每天检测仔鼠耳廓分离、睁眼日期、平面翻正反射和前肢抓握情况，结果如图5显示。[0133]图5是子宫内电穿孔敲降nischarin对仔鼠神经发育状况的影响结果示意图；(a)为仔鼠睁眼日龄统计图；(b)为仔鼠耳廓分离日龄统计图；(c)为仔鼠前肢抓握反射指数统计图；(d)仔鼠平面翻正反射指数统计图，n＝15；**p＜0.01表示与ctl-shrna对照组比较差异显著，n＝3；数据以平均值±se表示。[0134]与control-shrna组(即ctl-shrna组)小鼠比较，nischarin敲降组(即nis-shrna组)的睁眼日龄无显著差异，但耳廓分离日龄延后(p＜0.01)，此外，从出生第1天(即p1)起，敲降组仔鼠的前肢抓握反射和平面翻正反射指数均低于对照组，分别直至第8天(p8)和第6天(p6)才与对照组持平。[0135]4.1co-ip显示皮层神经元nischarin可与pak1、limk1互作[0136]为明确神经元上的内源性nischarin是否和reelin通路的信号分子有直接关系，在小鼠脑皮层组织上用免疫共沉淀(co-ip)观察了nischarin和reelin信号通路的重要分子pak1和limk1的互作关系，发现nischarin和pak1、limk1相互作用(图6a,6b)。图6中，将小鼠皮层神经元的裂解物与兔抗pak1或limk1多克隆抗体与鼠抗nischarin单克隆抗体及其g免疫球蛋白一起孵育，并用g蛋白-琼脂糖珠沉淀结果示意图。(a)为pak1免疫沉淀物用nischarin抗体或pak1抗体进行免疫印迹检测结果示意图；(c)为limk1免疫沉淀物用nischarin抗体或limk1抗体进行免疫印迹检测结果示意图；(b)为用pak1抗体或nischarin抗体对nischarin免疫沉淀物进行免疫印迹检测结果示意图；(d)为用limk1抗体或nischarin抗体对nischarin免疫沉淀物进行免疫印迹检测结果示意图。[0137]4.2免疫荧光染色显示皮层神经元nischarin可与pak互作[0138]为进一步证明神经元上nischarin和pak是否存在共定位现象，在原代培养的皮层神经元上用双重免疫荧光染色法进行形态学观察，发现和co-ip结果一致，神经元内源性nischarin和pak1、pak2均存在共定位现象(图7)。图5中，双重免疫荧光染色结果显示皮层神经元内源性nischarin(绿色)和pak1(红色)或pak2(红色)均有共定位，呈现黄色，提示nischarin和pak1(p21蛋白激活激酶1)或pak2(p21蛋白激活激酶2)均能互作。[0139]4.3皮层神经元的nischarin可抑制pak1的磷酸化[0140]为明确这种互作关系是否影响了pak的磷酸化活性，构建了针对nischarin基因并携带egfp的shrna质粒载体以及相应的对照control-shrna质粒载体。在验证质粒的表达效果后，用慢病毒包装系统对其进行包装，并收获慢病毒颗粒。用携带nis-shrna的慢病毒感染神经元，再用westernblot法检测p-pak水平(p-pak水平为p-pak占总pak的比例)，结果显示抑制nischarin表达可明显增加pak1的磷酸化表达，而对pak2则无此效应(图8)。[0141]图8是皮层神经元内源性nischarin抑制pak1磷酸化示意图，(a)免疫印迹实验结果示意图；(b)为图(a)结果的统计图；其中，gapdh是内参；nis指的是nischarin蛋白的表达。图8中免疫印迹实验结果显示用nis-shrna敲降皮层神经元内源性nischarin的表达后解除了对pak1磷酸化激活的抑制，但对pak2的磷酸化无影响。***p＜0.001表示与ctl-shrna对照组比较差异非常显著，n＝3；数据以平均值±se表示。[0142]4.4nischarin对pak1-limk1-cofilin信号通路的磷酸化调控[0143]免疫共沉淀结果显示，内源性蛋白nischarin与pak1、limk1之间存在相互作用。为进一步研究神经细胞中的nischarin是否能调控reelin信号通路中的pak1和limk1的磷酸化，本发明用nis-shrna及其对照质粒转染neuro-2a细胞，干扰内源性nischarin的表达后，再用免疫印迹方法检测pak1-limk1-cofilin的磷酸化程度，分析其与nischarin表达量的关系。结果显示，与未经转染处理的正常细胞比较，control-shrna转染组细胞的各指标均未发生显著变化。但nis-shrna转染后，内源性nischarin表达量降低75％(p＜0.01)，于此同时，p-pak1/pak1比值、p-limk1/limk1比值及p-cofilin/cofilin比值分别增加了41.5％(p＜0.05)、40％(p＜0.05)及57.5％(p＜0.01)(图9)，说明敲降nischarin的表达可显著增高pak1-limk1-cofilin信号通路的磷酸化活性，则nischarin负调控该信号通路。[0144]图9是nischarin抑制pak1/limk1/cofilin的磷酸化示意图，(a)为正常细胞组、control-shrna转染组细胞组、nis-shrna转染细胞组免疫印迹检测结果示意图，(b)为pak1、limk1以及cofilin磷酸化程度统计图。图9免疫印迹实验结果显示用nis-shrna敲降neuro-2a的nischarin表达后pak1、limk1以及cofilin磷酸化程度明显增加，说明内源性nischarin可抑制pak1/limk1/cofilin的磷酸化；*p＜0.05，**p＜0.01表示与ctl-shrna对照组比较差异显著，n＝3；数据以平均值±se表示。[0145]4.5nischarin对dab1/akt/mtor信号通路的磷酸化调控[0146]用nis-shrna干扰内源性nischarin的表达后，本发明又用免疫印迹方法检测dab1/akt/mtor的磷酸化程度，分析其与nischarin表达量的关系。结果显示，与control-shrna转染组细胞比较，nis-shrna转染后，p-dab1/dab1比值显著降低(p＜0.05)，但p-akt/akt、p-mtor/mtor比值变化不大(图10)，说明内源性nischarin的表达可激活reelin信号通路中dab1的磷酸化活性，但对下游信号akt和mtor的影响不大。[0147]图10是nischarin激活dab1而非akt/mtor的磷酸化示意图，图(a)-(c)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组免疫印迹检测结果示意图，(d)为图(a)-(c)中dab1、akt、mtor磷酸化程度统计图；其中，nis-shrna代表nischarin蛋白被敲除了，ctl-shrna是对照组，nischarin蛋白没有被敲除。图(a)-(c)中有两组nis-shrna，表示重复做的，避免偶然性；两组ctl-shrna表示重复做的，避免偶然性。图10中，用nis-shrna敲降neuro-2a的nischarin表达后dab1磷酸化程度明显下降，说明内源性nischarin可激活dab1的磷酸化，但其对akt和mtor的磷酸化无明显影响。*p＜0.05表示与ctl-shrna对照组比较差异显著，n＝3；数据以平均值±se表示，其中，p-dab1，p-akt，p-mtor分别表示磷酸化的dab1，akt，mtor。[0148]4.6nischarin依赖pak1活性调节neuro-2a细胞迁移能力[0149]上述结果表明内源性蛋白nischarin与pak1、limk1之间存在相互作用，且nischarin可抑制pak1/limk1/cofilin的磷酸化，而激活dab1的磷酸化。为进一步明确nischarin的抑制作用是依赖哪一通路发挥作用，本发明用pak1的特异性抑制剂ipa3处理被敲降nischarin表达的neuro-2a细胞，并行划痕实验，结果发现敲降nischarin使细胞迁移能力显著增加(p＜0.001)，但ipa3处理很大程度逆转了这种促进作用(p＜0.001，图11)，说明nischarin正是通过抑制reelin信号通路下游分子pak1起作用的。[0150]图11是nischarin依赖pak1活性调节neuro-2a细胞迁移能力示意图，(a)为ctl-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞组、nis-shrna转染细胞与ipa3处理组划痕实验结果示意图，(b)为neuro-2a细胞迁移能力检测结果统计图。图11中，用nis-shrna-3转染和pak1抑制剂ipa3处理的neuro-2a细胞迁移照片；nis-shrna敲降neuro-2a细胞内源性nischarin表达48h后使细胞迁移能力显著增强，但ipa3处理逆转了nis-shrna引起的神经细胞迁移能力增强。***p《0.001表示ctl-shrna和nis-shrna两组之间的差异显著，n＝3。###p《0.001表示nis-shrna和nis-shrna ipa3之间的差异显著，n＝3。[0151]4.7nischarin依赖pak活性调节neuro-2a细胞突起生长能力[0152]用nis-shrna敲降neuro-2a细胞的内源性nischarin蛋白表达后，细胞形态发生变化，细胞突起显著增多增长(图12a)。用pak1的抑制剂ipa3处理后，蛋白印迹法检测pak1/2的磷酸化发现p-pak1显著下降，而p-pak2则未受影响(图12b)。进一步统计neuro-2a细胞的突起生长情况后发现，ipa3处理逆转了nis-shrna引起的神经细胞突起数量增加、细胞中最长神经轴突的平均长度的增长和每个细胞的神经轴突总长度的增加(图12c、12d、12e)。以上结果说明nischarin抑制神经细胞突起生长是通过激活reelin下游信号pak1发挥作用的。[0153]图12中，图12(c)、(d)、(e)的结果说明了：ipa3处理逆转了nis-shrna引起的神经细胞突起数量(c)、细胞中最长神经轴突的平均长度(d)和每个细胞的神经轴突总长度(e)的增加。***p《0.001表示ctl-shrna和nis-shrna两组之间的差异显著，n＝3；#p《0.05，##p《0.01表示nis-shrna和nis-shrna ipa3两组之间的差异显著，n＝3。[0154]综上，在大脑皮层发育过程中，nischarin蛋白的表达通过调控皮层神经元的迁移活动参与脑发育的进程。通过子宫电穿孔(iue)干扰皮层神经元内源性nischarin的表达可造成胎鼠大脑皮层神经元迁移失控，造成形态学和功能学上的异常，产生典型的mcd症状。[0155]神经元上内源性nischarin可以与reelin信号通路中的pak1和pak2发生互作，并抑制pak1而非pak2的磷酸化激活。[0156]nischarin依赖reelin信号通路中的pak1及其下游limk1/cofilin信号分子影响神经细胞的迁移和突起生长功能。[0157]显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。当前第1页12当前第1页12
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