由多糖和聚氨基酸组成的交联聚合物及其用途的制作方法

由多糖和聚氨基酸组成的交联聚合物及其用途
1.本技术是分案申请，原申请的申请日为2018年7月6日、申请号为2018800493880、发明名称为“由多糖和聚氨基酸组成的交联聚合物及其用途”。
技术领域
2.本发明涉及由多糖和聚氨基酸组成的交联聚合物以及衍生自所述交联聚合物的水凝胶的领域。本发明还涉及用于制备其的方法，以及它们在递送用于药物和(皮肤)化妆品应用的活性剂中的用途和作为细胞/组织培养基的用途。


背景技术：

3.水凝胶是天然或合成来源的三维网络形式的交联聚合材料，其遇水膨胀以形成柔软且有弹性的材料并且在其结构上保留其大部分而不溶解。根据不同的物理化学性质，可将水凝胶分类为数种类型，例如，根据它们的粘度：流体、半固体和固体；根据它们的结构：有弹性的(例如明胶)和非弹性的(硅胶)；根据固相性质：无机的(例如膨润土糊)和有机的(例如卡波姆、纤维素衍生物、泊洛沙姆等)。另一种分类基于构成它们的三维(3d)网络接头的性质，水凝胶可以是物理凝胶(形成它们的3d网络通过非共价相互作用形成)和化学凝胶(其中通过共价键形成网络的那些)；最后一种类型的键非常牢固并且产生交联的网状物，其中通过所述网状物的共价结头(knot)固定分子框架。
4.由于其长链结构和它们在溶液中所采取的结构，聚合固体尤其适合形成水凝胶。这些链的柔韧性使它们能够变形并允许溶剂分子进入它们的3d结构中。
5.在化妆品中最常使用的水凝胶是流体、有弹性的水凝胶，其具有固体有机相，例如聚乙烯醇、(由卡波姆形成)和纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素或透明质酸)。聚维酮和(由泊洛沙姆形成)也最常用。
6.现有技术描述了数个文件，其公开了网状透明质酸和包括它们的凝胶。在它们的许多中，使用聚赖氨酸进行网状化。例如，wo2006021644描述了网状透明质酸，其中网状剂(reticulate agent)是聚赖氨酸。尽管可溶于水，所得的网状透明质酸对不同的生物降解因子不太敏感；它在重建和/或整形外科中使用。至少使用一种催化剂获得网状透明质酸。文件us2001039336也描述了网状透明质酸和包括它的凝胶，其中以聚赖氨酸修饰透明质酸；它用作药物递送。
7.具有开发由多糖和聚氨基酸组成的新型交联聚合物的明确需求，其保持它们的性质同时允许高效地运输活性剂，特别是通过皮肤运输。


技术实现要素：

8.本发明待解决的问题是提供生物相容性交联聚合物，其能够并入用于作为药物递送和在(皮肤)化妆品中用途的组分，包括制备用于其局部施用的水凝胶的用途。
9.本发明的交联聚合物和现有技术中公开的那些交联聚合物之间的差异是本发明的交联聚合物不包括聚阳离子均聚氨基酸。出乎意料地，本发明中公开的交联聚合物显示
了意想不到的性质，具体地，增加了细胞和组织增殖和皮肤渗透。同样地，出乎意料地，本发明的交联聚合物充当渗透增强剂，同时通过透明质酸酶的作用提供降解抗性。此外，发现本发明的交联聚合物粘着在角质层，其为交联聚合物缓慢释放和渗透到表皮层提供来源。尽管交联的透明质酸已经被广泛地描述，但是通常使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚和二乙烯基砜作为交联剂。特别相关的是，通过阴离子多糖和聚氨基酸的交联获得的本发明的交联聚合物使用生物相容性化学，获得能够调节流变学性质的完全生物相容性和生物可降解的材料。这种交联聚合物作为药物递送运载体或与其他载体结合充当渗透增强剂的用途在之前没有描述过。同样值得注意的是本发明的交联聚合物与油包水(w/o)和水包油(o/w)乳剂的令人意外的相容性，该事实打开了它们在常规局部制剂中的适用性，这导致用于(皮肤)化妆品和药物应用中高度通用的运载体(例如膏、洗剂、水凝胶
……
)。
10.如本公开内容中深刻显示的，本发明人出人意料地意识到通过仔细控制本发明的交联聚合物交联反应的条件，并因此仔细控制最终交联聚合物的组成，可实现微调它们的粘弹性性质。一方面，本发明人意识到现有技术公开的交联聚合物中的多肽骨架的侧链对交联是无关的或完全饱和的。因此，发现了聚氨基酸的氨基酸的侧功能团在与生物屏障相互作用中起重要作用并因此在药物递送性质中起重要作用。因此，本发明的另一个优势是交联聚合物的通用性，在某种意义上可在多肽序列中使用特定氨基酸作为蛋白酶底物以调节释放应用，例如，用于急性炎症中的基体金属蛋白酶的底物，其降解更快并且释放活性剂；或作为交联剂、生成在(皮肤)化妆品中感兴趣的细胞外基质的胶原蛋白或其他组分的氨基酸前体的用途。本文公开的交联技术允许例如控制起始透明质酸的分子量增加，以致因此可产生透明质酸交联的水凝胶。
11.因此，在第一方面，本发明涉及包括下列式(i)的重复单元的交联聚合物：
[0012][0013]
或其盐、溶剂合物或异构体，其中：pls是多糖基团；pls-ru是多糖的重复单元基团；paa是聚氨基酸基团，其中聚氨基酸选自均-、无规和嵌段共聚氨基酸，条件是均聚氨基酸不是聚阳离子的；aa是聚氨基酸的氨基酸单元基团；基团(aa)的下标x是1到200范围内的整数；基团[(paa)-(aa)
x
]的下标v是1到48范围内的整数；基团(pls-ru)的下标w是1到200范围内的整数；in是rop引发剂，其包括每个[(paa)-(aa)]基团的末端x基团，其中每个末端x基团直接与每个[(paa)-(aa)]基团结合，和其中末端x基团选自-nh-、-o-、-s-或其组合；cl是选自下述的基团：(c
1-c
500
)-烷基，其中两个或更多的h被下列取代：(1)(c
1-c
500
)-烷基，(2)(c
3-c
30
)-环烷基，(3)衍生自具有1-6个环的环系统的c-基团，每个环是独立饱和的、部分不饱和的或芳族的，环系统的环是分离或稠合的并且每个环具有3-20种元件(element)，每种元件独立地选自c、ch、ch2、co、o、s、n和nh，(4)oh，(5)nrarb，(6)onrcrd，(7)cn，(8)卤根，(9)sh2，(10)srerf，(11)n(h)nh2，(12)rgcorh，(13)coori，(14)con(rj)(rk)，(15)r
l
n(rm)con(rn)(r’n
)，(16)(c
1-c
30
)-烯，(17)(c
1-c
30
)-炔，(18)n3，(19)roch(or
p
)(orq)，(20)rrch(srs)
(sr
t
)，(21)rub(orv)(orw)，(22)cor
x
；和其中没有c、多个c之一独立地被替换为(c
3-c
30
)-环烷基、芳基、芳基-(c
1-c
30
)-烷基、nr
yrz
、co、o、s、s(o)、s(o2)、b、p和(o-ch
2-ch2)a；基团(o-ch
2-ch2)的下标a是介于1和500之间的整数；ra、rb、rc、rd、re、rf、rh、ri、rj、rk、rm、rn、r’n
、r
p
、rq、rs、r
t
、rv、rw、r
x
、ry和rz是独立地选自h、(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基-(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，任何它们中，除了h，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代；rg、r
l
、ro、rr和ru是独立地选自(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基-(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，任何它们中，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代；条件是：(1)可能存在或不存在cl，以致如果不存在cl，则pls-ru基团和aa基团形成直接稳定的键。
[0014]
如技术人员在本文中所理解的，术语“重复单元(recurring unit)”意味着交联聚合物包含至少2个重复单元。
[0015]
如技术人员鉴于其常识和本文技术教导所理解的，实践中，本发明的交联聚合物通常包括2到200个重复单元。
[0016]
在进一步方面，本发明涉及缀合物，其包括本发明的交联聚合物和至少一种结合到交联聚合物上的活性剂。
[0017]
在进一步方面，本发明涉及包括本发明缀合物的试剂盒。
[0018]
在另一个方面，本发明涉及本发明缀合物作为显象剂的用途。
[0019]
在进一步方面，本发明涉及药物、诊断或治疗诊断的组合物，其包括本发明缀合物、和一种或多种分别在药学上、诊断学上和治疗诊断学上可接受的赋形剂或载体。
[0020]
在进一步方面，本发明涉及用于医学或治疗中使用的本发明缀合物或药物组合物。
[0021]
在甚至另一个方面，本发明涉及用于诊断中使用的本发明缀合物或诊断组合物。
[0022]
在甚至另一个方面，本发明涉及用于治疗诊断中使用的本发明缀合物或药物或诊断组合物。
[0023]
在进一步方面，本发明涉及(皮肤)化妆品组合物，其包括本发明的交联聚合物或缀合物、和一种或多种化妆品上可接受的赋形剂。
[0024]
在进一步方面，本发明涉及细胞和/或组织的培养基，其包括本发明的交联聚合物。
[0025]
在仍另一个方面，本发明涉及培养细胞和/或组织的方法，其包括在本发明的培养基中培养所述细胞和/或组织。
[0026]
本发明的这些和其他目标将在下面发明部分的说明书中进一步详细地描述，并且它们不意欲对本发明是限制性的。除非另有预先定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员一般理解的含义具有相同的含义。可在本发明的实践中使用与本文描述的那些类似或等价的方法和材料。贯穿说明书和权利要求书，单词“包括”和该词的变化不意欲排除其他技术特征、添加物、组分或步骤。在检查说明书后，对本领域的技术人员来说，本发明额外的目标、优势和特征将变得显而易见，或可以通过实践本发明实践得知。下面仅通过实例描述了本发明的实施方式。通过说明的方式提供了实例，并且它们不意欲对本发明是限制性的。此外，本发明覆盖本文描述的具体实施方式的所有可能组合。
附图说明
[0027]
图1显示了原始材料(l-赖氨酸盐酸盐(lys
·
hcl))、聚-l-谷氨酸钠(napga)以及实施例1a和1b中获得的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物的1h nmr光谱。
[0028]
图2显示了实施例1a中获得的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物的尺寸排阻色谱分析。
[0029]
图3显示了实施例1b中获得的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物的尺寸排阻色谱分析。
[0030]
图4显示了原始材料(起始于n-丁基二胺(na-nbu(pga)2)的双官能团聚-l-谷氨酸钠和透明质酸钠(naha))和在实施例2中获得的合成[ha]-[pga]交联聚合物的1h nmr光谱。
[0031]
图5显示了在实施例2中使用na-nbu(pga)2获得的自交联[ha]-[pga]交联聚合物的尺寸排阻色谱分析。
[0032]
图6显示了在实施例2中使用na-nbupga获得的自交联[ha]-[pga]交联聚合物的尺寸排阻色谱分析。
[0033]
图7显示了在5％wt下用在实施例1a(圆圈)和1b(方框)中获得的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物以及250kda(下三角形)和50kda(上三角形)的商用naha进行的震荡流变分析。在线性粘弹性范围内、1hz的频率下测量在震荡应力试验下的储能模量(g
′
，填充符号)和损耗模量(g
″
，空符号)数据。
[0034]
图8显示了条状图，其代表了包括本发明的交联聚合物的制剂与传统化妆品制剂的分离度。“sp”代表分离度。“0”对应未分离。“1”对应最小的水相出现。“2-4”对应高量的水相分离。“5”对应水乳化剂和油中完全相分离。
[0035]
图9显示了实施例1b的交联聚合物的透明质酸酶消化的结果。
[0036]
图10显示了皮肤切片的共聚焦激光扫描显微镜图像，该皮肤切片用本发明的交联聚合物的溶液浸透，所述交联聚合物的溶液用荧光标记的聚合胶束配置。
[0037]
图11显示了与-cy5.5缀合的实施例1b的交联聚合物的1h nmr和uv-vis光谱。
[0038]
图12显示了利用ri和uv(676nm)检测器使用花青5.5对在实施例7.1中获得的荧光标记的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物的尺寸排阻色谱分析。
[0039]
图13显示了皮肤切片的共聚焦激光扫描显微镜图像，该皮肤切片用在实施例7.1中获得的荧光标记的交联聚合物的溶液浸透。
[0040]
图14显示了在成纤维细胞中实施例1a中获得的交联聚合物的细胞活力。
具体实施方式
[0041]
除非另有说明，否则本文使用的所有术语应当以本领域内已知的普通含义理解为。本应用中使用的某些术语的其他更具体定义如下阐述并且除非另有明确阐述的定义提供了更宽泛的定义，否则旨在一致地应用于说明书和权利要求书。
[0042]
本发明的交联聚合物
[0043]
交联聚合物包括下面式(i)的重复单元：
[0044][0045]
或其盐、溶剂合物或异构体，其中：pls是多糖基团；pls-ru是多糖的重复单元基团；paa是聚氨基酸基团，其中聚氨基酸选自均-、无规和嵌段共聚氨基酸，条件是均聚氨基酸不是聚阳离子的；aa是聚氨基酸的氨基酸单元基团；基团(aa)的下标x是1到200范围内的整数；基团[(paa)-(aa)
x
]的下标v是1到48范围内的整数；基团(pls-ru)的下标w是1到200范围内的整数；in是rop引发剂，其包括每个[(paa)-(aa)]基团的末端x基团，其中每个末端x基团直接与每个[(paa)-(aa)]基团结合，和其中末端x基团选自-nh-、-o-、-s-或其组合；cl是选自下述的基团：(c
1-c
500
)-烷基，其中两个或更多的h被下列取代：(1)(c
1-c
500
)-烷基，(2)(c
3-c
30
)-环烷基，(3)衍生自鉴于1-6个环的环系统的c-基团，每个环是独立饱和的、部分不饱和的或芳族的，环系统的环是分离或稠合的并且每个环具有3-20种元件，每种元件独立地选自c、ch、ch2、co、o、s、n和nh，(4)oh，(5)nrarb，(6)onrcrd，(7)cn，(8)卤根，(9)sh2，(10)srerf，(11)n(h)nh2，(12)rgcorh，(13)coori，(14)con(rj)(rk)，(15)r
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1-c
30
)-烯，(17)(c
1-c
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)-炔，(18)n3，(19)roch(or
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)，(21)rub(orv)(orw)，(22)cor
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；和其中没有c、多个c之一独立地被替换为(c
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3-c8)-环烷基的基团；其中，任何它们中，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代；条件是：(1)可能存在或不存在cl，以致如果不存在cl，则pls-ru基团和aa基团形成直接稳定的键。在本文中指交联聚合物时，如果适用，也指其相应的药学上可接受的盐或溶剂合物。
[0046]
在如上所述的交联聚合物的具体实施方式中，下标v是介于1和5之间的整数且每个x末端基团是-nh-。
[0047]
如本文所用的术语“聚氨基酸(聚合物)”(或paa)指由氨基酸的至少2个重复单元组成的聚合物。聚氨基酸的氨基酸可以是l-或d-氨基酸。然而，除非另有说明，否则本发明的聚氨基酸的氨基酸是l-氨基酸。
[0048]
本发明的交联聚合物的聚氨基酸可以仅由一种类型的氨基酸重复单元组成，本文中称为均聚氨基酸。当本文所用时，术语“聚阳离子的”均聚氨基酸指其中氨基酸重复单元选自赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、脯氨酸和精氨酸的均聚氨基酸。
[0049]
可选地，本发明的交联聚合物的聚氨基酸可以由多于一种类型的氨基酸作为重复单元组成，本文中称为共聚氨基酸。
[0050]
如本文所用的术语“无规共聚氨基酸”和“嵌段共聚氨基酸”指共聚氨基酸，其中不同的氨基酸分别以随机或顺序的方式连接(例如，lavilla，c.等2016)。无规聚氨基酸的实例是醋酸格拉替雷(robin，y，2015)。
[0051]
如本文所用的术语“肽键”指沿着(多)肽、聚氨基酸或蛋白链连接两个连续的氨基酸单体的共价化学键。
[0052]
如本文所用的术语“多糖”指由通过糖苷键结合在一起的多于10个单糖组成的聚合碳水化合物分子。它们结构上的范围从线性的到高度分支的。多糖非限制性地包括糖胺聚糖、右旋糖酐及其衍生物、纤维素及其衍生物(例如甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙酸纤维素、琥珀酸盐、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素)、壳聚糖及其衍生物、葡聚糖、阿拉伯木聚糖、角叉菜聚糖、果胶、糖原、岩藻依聚糖、戊聚糖、藻酸盐或环糊精、或它们的盐和衍生物，包括其酯和硫酸盐。
[0053]
如本文所用的术语“糖胺聚糖”指由重复二糖组成的长无分支的多糖，其中重复单元(除角质素外)由氨基糖(n-乙酰葡糖胺或n-乙酰半乳糖胺)连同糖醛糖(葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸)或半乳糖组成。糖胺聚糖分为四组，即，肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素/硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。
[0054]
如本文所用的术语“透明质酸”包含多种链长度和电荷状态的透明质酸、透明质酸盐或乙酰透明质酸(hyaluronan)的所有变体和变体的组合。
[0055]
均多糖是由单一类型的单糖组成的多糖，换言之，重复单元是单糖。杂多糖是由两种或更多种不同类型的单糖组成的多糖，换言之，重复单元是两种或更多种不同种类的单糖。
[0056]
如本文所用的术语“低聚糖”指由通过糖苷键结合在一起的2到10个单糖组成的聚合碳水化合物分子(或多糖)。
[0057]
如本文所用的术语“单糖”指由单个糖单元组成的简单形式的糖，其不能进一步分解成更小的糖构建基块。用于多糖的优选单糖选自呋喃糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、修饰的单糖，例如而不限于，唾液酸和赤藓糖(erithrose)，及其混合物。单糖可以是其线性或环状形式(即半缩醛环状异构体)。
[0058]
在本发明的上下文中，下列术语具有以下详细含义：
[0059]
–
术语“烷基”指具有碳原子数目(如果指示)的直链或支链烃基团，并且其通过单键连接到分子的剩余部分。例如，(c
1-c6)-烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、己基等
[0060]
–
术语“烯”指具有所指示原子数的直链或支链不饱和的烃基团，其至少包含一个碳-碳双键
[0061]
–
术语“炔”指具有所指示原子数的直链或支链不饱和的烃基团，其至少包含一个碳-碳三键
[0062]
–
术语“烷氧基”指具有式-or的部分，其中r是如上定义的烷基基团。烷氧基基团的实例非限制性地包括甲氧基、乙氧基和异丙氧基
[0063]
–
术语“胺”指-nr3部分，其中每个r基团是h或如上定义的烷基；氨基部分可离子化以形成相应的铵阳离子
[0064]
–
术语“酰胺”指-nrc(o)r或-c(o)nr2部分，其中每个r基团是h或如上定义的烷基
[0065]
–
术语“酰基”指通过从包括无机酸的含氧酸中去除一个或多个羟基基团衍生的部分；酰基包含双键氧原子和如上定义的烷基基团
[0066]
–
术语“烷基胺”指如上定义的烷基，其中一个或多个氢替换为如上定义的氨基。烷基胺基团的实例非限制性地包括甲胺、乙胺和异丙胺
[0067]
–
术语“卤根”指氟根、氯根、溴根或碘根
[0068]
–
术语“芳基”指具有任何适合数目的环原子和任何适合数目的环的芳族环系统。芳基基团可包括任何适合数目的环原子，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子，以及从6到10、6到12、或6到14个环成员。芳基基团可以是单环的、稠合以形成二环(例如苯并环己基)或三环基、或通过键连接以形成联芳基基团。代表性的芳基基团包括苯基、萘基和联苯基。其他芳基基团包括苄基，其具有亚甲基连接基团。一些芳基可被“取代”或“不被取代”。“取代的芳基”指被选自卤根、oh、氨基、烷基胺、酰胺、酰基、no2、cn、烷基和烷氧基的一种或多种基团取代的芳基基团。如果所指示的芳基可具有一个或多个碳原子被取代，例如被杂原子取代；它们非限制性地包括吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩(thiphene)、呋喃、噻唑、异噻唑、唑和异唑。如果它们稠合成芳族环系统，例如苯基，它们非限制性地包括苯并吡咯、苯并吡啶和苯并吡嗪
[0069]
–
术语“烷基-芳基”指经由具有所指示碳原子数的烷基结合到化合物上的芳基基团
[0070]
–
术语“环烷基”指饱和或部分饱和的单环、包含所指示原子数的稠合二环或桥联多环组件。饱和的单环环烷基环包括例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。饱和的二环和多环包括，例如，二环辛烷。环烷基基团也可以是部分饱和的，其环中具有一个或多个双键或三键。部分不饱和的代表性环烷基基团包括，但不限于环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯、环庚烯、环庚二烯、环辛烯和环辛二烯。当环烷基是饱和的单环环烷基时，示例性的c
3-c8环烷基基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。类似地，示例性的饱和单环(c
3-c6)-环烷基基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烷基基团可以是取代或未取代的。取代的环烷基基团可以被选自卤根、oh、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、no2、cn、烷基和烷氧基的一种或多种基团取代。如果指示，环烷基可以具有一个或多个碳原子被取代，例如被杂原子取代。如果是单环，它们非限制性地包括氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷(azepane)、氮杂环辛烷(azocane)、吡唑烷、咪唑烷(imidazolidinie)、哌嗪(1,2-、1,3-和1,4-异构体)、四氢呋喃、烷、唑烷、二烷或二噻烷。如果是饱和的，它们非限制性地包括氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉、氧杂环丁基、四氢呋喃基或四氢吡喃基。如果是不饱和的，它们非限制性地包括2,3-二氢呋喃基、2,5-二氢呋喃基、3,4-二氢吡喃基、3,6-二氢吡喃基或1,4-二氢吡啶基
[0071]
–
术语“叠氮化物”指具有式n
3-的阴离子
[0072]
–
术语“氨基甲酸酯”指-ro-co-nr2部分，其中每个r基团是h或如上定义的烷基，并且其中所述部分衍生自相应的氨基甲酸(即nh2cooh)
[0073]
–
术语“席夫碱”指r2c＝nr’部分(其中每个r基团是h或烷基，除了r'不能为氢)。席
夫碱可被视为亚胺的为子类，根据它们的结构是仲酮亚胺或仲醛亚胺；这些化合物存在许多特定的命名系统；例如，衍生自苯胺的席夫碱(其中r’是苯基或取代的苯基)可被称为缩苯胺
[0074]
–
术语“腙”指r2c＝nnh2部分，其中每个r基团是如上定义的烷基
[0075]
–
术语“马来酰亚胺”指r2c2(co)2nh部分，其中每个r基团是h或如上定义的烷基；它也指那些部分，其中nh基团被替换为如上定义的烷基或芳基基团，或聚合物例如聚乙二醇
[0076]
–
术语“缩醛”指r2c(or')2部分，其中两个r'基团是如上定义的烷基。两个or'基团可以是彼此相同或不同的。两个r基团可以是彼此相同(“对称的缩醛”)或不同(“混合的的缩醛”)，并且其一个或两者可以是h或如上定义的烷基基团。
[0077]
–
术语“酰肼”指共享了共同官能团的一类有机化合物，特征在于氮-氮共价键具有4个取代基，它们中至少一个是酰基基团。酰肼的一般结构是e(＝o)-nr-nr2，其中r'经常是h，其中e可以是下述，并且酰肼据此分类：o，即碳酰肼(r-c(＝o)-nr-nr2)；s，即磺酰肼(r-s(＝o)
2-nr-nr2)；和膦二酰肼(r-p(＝o)(-nr-nr2)2。
[0078]
本发明的交联聚合物的聚氨基酸包括引发剂(或“in”)。如本文所用的术语“引发剂”(或“in”)指用于通过正常胺机制引发α-氨基酸n羧基酐的开环聚合(rop)反应的化学分子，其中引发剂被并入所得聚氨基酸的主链中(例如，在deng，c.等，2014；和us9623125b2中公开的)。引发剂可包含一种或多种可以引发rop反应的亲核基团，因此，引发剂可以分别是单官能或多官能的，其分别导致了本发明的交联聚合物中的一个或几个末端x基团。
[0079]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，in具有下列化学结构，w-亲核基团(一种或多种)，其中w是选自下述的基团：(c
1-c
500
)-烷基，其中一个或多个h被下列取代：(1)(c
1-c
500
)-烷基，(2)(c
3-c
30
)-环烷基，(3)衍生自具有1-6个环的环系统的c-基团，每个环是独立饱和的、部分不饱和的或芳族的，环系统的环是分离或稠合的并且每个环具有3-20种元件，每种元件独立地选自c、ch、ch2、co、o、s、n和nh，(4)oh，(5)nrarb，(6)onrcrd，(7)cn，(8)卤根，(9)sh2，(10)srerf，(11)n(h)nh2，(12)rgcorh，(13)coori，(14)con(rj)(rk)，(15)r
l
n(rm)con(rn)(r’n
)，(16)(c
1-c
30
)-烯，(17)(c
1-c
30
)-炔，(18)n3，(19)roch(or
p
)(orq)，(20)rrch(srs)(sr
t
)，(21)rub(orv)(orw)，(22)cor
x
；和其中没有c、多个c之一独立地被替换为(c
3-c
30
)-环烷基、芳基、芳基-(c
1-c
30
)-烷基、nr
yrz
、co、o、s、s(o)、s(o2)、b、p和(o-ch
2-ch2)a；基团(o-ch
2-ch2)的下标a是介于1和500之间的整数；ra、rb、rc、rd、re、rf、rh、ri、rj、rk、rm、rn、r’n
、r
p
、rq、rs、r
t
、rv、rw、r
x
、ry和rz是独立地选自h、(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基-(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，任何它们中，除了h，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代；rg、r
l
、ro、rr和ru是独立地选自(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基、(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代。
[0080]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，引发剂具有亲核基团胺，这导致-nh-作为本发明的交联聚合物的x末端基团。
[0081]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，引发剂具有亲核基团羟基，这导致-o-作为本发明的交联聚合物的x末端基团。
[0082]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组
合，引发剂具有亲核基团硫醇，这导致-s-作为本发明的交联聚合物的x末端基团。
[0083]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，引发剂具有2、3、4、5、6、7和8个同时引发rop反应的亲核基团。
[0084]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，引发剂选自(c
1-c
500
)-烷基胺(例如丁胺、丙胺、乙胺等)、乙二醇和聚乙二醇，从n＝2到n＝16，其中n是重复的乙二醇单元的数量，其具有作为亲核基团的末端胺。
[0085]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，引发剂具有介于1和5之间的亲核基团(或本发明的任何交联聚合物的式i的下标v)或v是介于1和5之间的整数，和引发剂的亲核基团是-nh2。
[0086]
如本文所用的术语“连接分子(linker molecule)”指具有与多糖上一个或多个官能团反应的第一化学基团和与聚氨基酸上一个或多个官能团反应的第二化学基团的分子，这导致所谓的本发明的交联聚合物的“cl”基团。
[0087]
连接分子的化学基团和多糖及聚氨基酸的官能团是化学上互补的，即能够形成稳定的键。所述官能团可以指多糖或聚氨基酸的固有官能团(即在天然存在的多糖或聚氨基酸的情况下，换言之，存在于天然或活的生物体中的多糖或聚氨基酸的情况下)，或添加至多糖或聚氨基酸的官能团——由于与连接分子的对应化学基团反应之前官能化(即，在非天然存在的多糖或聚氨基酸的情况下，换言之，不存在与天然或活的生物体中的多糖或氨基酸的情况下)。与连接分子的第一或第二化学基团反应的多糖和聚氨基酸的官能团它们可以是相同的或不同的。
[0088]
连接分子的化学基团非限制性地包括炔、叠氮化物、反应性二硫化物、马来酰亚胺、酰肼、腙、席夫碱、缩醛、醛、氨基甲酸酯、和反应性酯、或疏水官能团。
[0089]
可以非限制性地通过下述获得多糖的官能团：氧化例如将-ch2oh基团氧化至-cho和/或-cooh；邻近羟基的高碘酸盐氧化，任选地，随后还原，例如将-cho还原至-ch2oh或与胺偶联形成亚胺，随后还原至仲胺；硫酸化；脱酰胺，任选地，随后脱氨或与新酸酰胺形成；和酯化。
[0090]
例如，可用琥珀酸官能化多糖以获得羧酸官能团，其能够与具有胺化学基团的连接分子反应以形成酰胺键。
[0091]
聚氨基酸的官能团可通过经由氨基酸侧链官能团将其偶联而获得，其非限制性地包括酰胺形成、还原性胺化、酯化、亚胺形成、硫醇-烯(thiol-ene)反应、二硫化物形成等。例如，可用炔、叠氮化物、反应性二硫化物、马来酰亚胺、酰肼、腙、席夫碱、缩醛、醛、氨基甲酸酯、和反应性酯、或疏水功能团官能化聚氨基酸。
[0092]
稳定的键可能是非共价键、可逆共价键和不可逆共价键。如果需要，可施行正交化学以选择性地完成稳定的键。如本文所用的术语“非共价键”指不涉及电子共享的键，但涉及分子之间电磁相互作用的更分散的变化。非共价键可分为多种类别，例如静电相互作用、π相互作用、范德华力、氢键合和疏水作用。
[0093]
如本文所用的术语“交联”、“交联的”、“使交联”指一个聚合链至另一个聚合链的化学键。
[0094]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，本发明的交联聚合物中不存在cl基团。
[0095]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，本发明的交联聚合物中存在cl基团。
[0096]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，本发明的交联聚合物的cl基团选自：
[0097][0098]
其中r1到r5和r7到r
13
独立地选自：
[0099][0100]
p
‘
和s’是独立地选自0到500的整数；且r6独立地选自h和(c
1-c4)-烷基。
[0101]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，本发明的交联聚合物的cl基团是-nh-ch(cooh)-(c
1-c
30
)-烷基-nh-。
[0102]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，或任选地与如上定义的式(i)的交联聚合物组合，其中存在或不存在cl，并且其中任选地，v是介于1和5之间的整数和每个x末端基团是-nh-，本发明的交联聚合物的paa基团是式(ii)的基团
[0103][0104]
和，aa基团是式(iii)的基团
[0105][0106]
其中m、n、o、p和q是独立地选自0到500的整数，并且其中m n o p q》1；r1到r6独立地选自：
[0107][0108]
每个x1和x2独立地选自h、n、nh2和z；每个x3和x4独立地选自h和z；每个y和y’是独立地选自0到3的整数，其中y y’＝2或3；每个y”和y
”’
是独立地选自0到2的整数，其中y” y
”’
＝1或2；z选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子；和r8到r
13
独立地选自h和-c
1-c4烷基；条件是：(1)当不存在cl时，aa基团通过paa基团的末端胺通过肽键结合到paa基团上；和(2)当cl存在时，aa基团通过aa基团的胺末端结合到cl上。
[0109]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，或任选地与如上定义的式(i)的交联聚合物组合，其中存在或不存在cl，和其中任选地v是介于1和5之间的整数并且每个x末端基团是-nh-，本发明的交联聚合物的paa基团是式(iv)的基团
[0110][0111]
和aa基团是式(v)的基团
[0112][0113]
其中，m、n、o、p和q是独立地选自0到500的整数，并且其中m n o p q》1；r1到r5独立地选自：
[0114][0115]r’6选自：
[0116][0117]
每个x1和x2独立地选自h、n、nh2和z；每个x3和x4选自h和z；每个r1到r5的下标y和y’是独立选自0到3的整数，其中y y’＝2或3；每个r1到r5的下标y”和y
”’
是独立地选自0到2的整数，其中y” y
”’
＝1或2；每个r
’6的下标y是1或2；r
’6的下标y’是0或1；z选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子；r7是选自下述的基团：(c
1-c
500
)-烷基，其中一个或多个h被下列取代：(1)(c
1-c
500
)-烷基，(2)(c
3-c
30
)-环烷基，(3)衍生自具有1-6个环的环系统的c-基团，每个环是独立饱和的、部分不饱和的或芳族的，环系统的环是分离或稠合的并且每个环具有3-20种元件，每种元件独立地选自c、ch、ch2、co、o、s、n和nh，(4)oh，(5)nrarb，(6)onrcrd，(7)cn，(8)卤根，(9)sh2，(10)srerf，(11)n(h)nh2，(12)rgcorh，(13)coori，(14)con(rj)(rk)，(15)r
l
n(rm)con(rn)(r’n
)，(16)(c
1-c
30
)-烯，(17)(c
1-c
30
)-炔，(18)n3，(19)roch(or
p
)(orq)，(20)rrch(srs)(sr
t
)，(21)rub(orv)(orw)，(22)cor
x
；和其中没有c、多个c之一独立地被替换为(c
3-c
30
)-环烷基、芳基、芳基-(c
1-c
30
)-烷基、nr
yrz
、co、o、s、s(o)、s(o2)、b、p和(o-ch
2-ch2)a；基团(o-ch
2-ch2)的下标a是介于1和500之间的整数；ra、rb、rc、rd、re、rf、rh、ri、rj、rk、rm、rn、r’n
、r
p
、rq、rs、r
t
、rv、rw、r
x
、ry和rz是独立地选自h、(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基-(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，任何它们中，除了h，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代；rg、r
l
、ro、rr和ru是独立地选自(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基、(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代；和r8到r
13
独立地选自h和(c
1-c4)-烷基；条件是：(1)当不存在cl时，aa基团通过paa基团的末端胺通过肽键结合到paa基团上；和(2)当存在cl时，基团aa通过r
’6结合到cl上。
[0118]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，本发明的交联聚合物的r7基团选自h、co-(c
1-c
20
)-烷基、conh-(c
1-c
20
)-烷基和焦谷氨酸根。
[0119]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，或任选地与式(i)、(ii)和(iii)的如上定义的交联聚合物组合，其中存在或不存在cl，和其中v是介于1和5之间的整数并且每个x末端基团是-nh-，本发明的交联聚合物的聚氨基酸是均聚氨基酸，其中r1＝r2＝r3＝r4＝r5＝r6。在优选实施方式中，所述r1＝r2＝r3＝r4＝r5＝r6选自：
[0120][0121]
其中z选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子。
[0122]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组
合、或任选地与式(i)、(iv)和(v)的如上定义的交联聚合物组合，其中存在或不存在cl，和其中v是介于1和5之间的整数并且每个x末端基团是-nh-，本发明的交联聚合物的聚氨基也是均聚氨基酸，其中r1＝r2＝r3＝r4＝r5和r
’6是所述r1＝r2＝r3＝r4＝r5对应的双基团(double radical)。在优选实施方式中，所述r1＝r2＝r3＝r4＝r5选自：
[0123][0124]
和所述r
’6选自：
[0125][0126]
其中z选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子。
[0127]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，或任选地与式(i)、(ii)和(iii)的如上定义的交联聚合物组合，其中存在或不存在cl，和其中v是介于1和5之间的整数并且每个x末端基团是-nh-，本发明的交联聚合物的聚氨基酸是无规或嵌段共聚氨基酸。在优选实施方式中，无规或嵌段共聚氨基酸的所述r1、r2、r3、r4、r5和r6独立地选自：
[0128][0129]
其中每个x1和x2独立地选自h、n、nh2和z；每个x3和x4独立地选自h和z；每个y和y’是独立地选自0到3的整数，其中y y’＝2或3；每个y”和y
”’
是独立地选自0到2的整数，其中y” y
”’
＝1或2；z选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子。在更优选实施方式中，本发明的无规或嵌段聚氨基酸的r1、r2、r3、r4、r5和r6独立地选自：
[0130][0131]
其中每个x1和x2独立地选自h、n、nh2和z；每个x3和x4独立地选自h和z；每个y和y’是独立地选自0到3的整数，其中y y’＝2或3；每个y”和y
”’
是独立地选自0到2的整数，其中y” y
”’
＝1或2；z选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子。
[0132]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，或任选地与式(i)、(iv)和(v)的如上定义的交联聚合物组合，其中存在或不存在cl，和其中v是介于1和5之间的整数并且每个x末端基团是-nh-，本发明的交联聚合物的聚氨基酸是无规或嵌段共聚氨基酸。在优选实施方式中，无规或嵌段共聚氨基酸的基团r1到r5独立地选自：
[0133][0134]
和基团r
’6选自：
[0135][0136]
其中每个x1和x2独立地选自h、n、nh2和z；每个x3和x4独立地选自h和z；r1到r5的每个下标y和y’是独立地选自0到3的整数，其中y y’＝2或3；r1到r5的每个下标y”和y
”’
是独立地选自0到2的整数，其中y” y
”’
＝1或2；
[0137]r’6的每个下标y是1或2；r
’6的下标y’是0或1；并且每个z独立地选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子。在更优选实施方式中，基团r1到r5独立地选自：
[0138][0139]
其中每个x1和x2独立地选自h、n、nh2、和z；每个x3和x4独立地选自h和z；r1到r5的每个下标y和y’是独立地选自0到3的整数，其中y y’＝2或3；r1到r5的每个下标y”和y
”’
是独立地选自0到2的整数，其中y” y
”’
＝1或2；
[0140]r’6的每个下标y是1或2；r
’6的下标y’是0或1；并且每个z独立地选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子。
[0141]
在具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，本发明的交联聚合物的多糖选自透明质酸、果胶、壳聚糖和硫酸软骨素。
[0142]
在另一个具体实施方式中，任选地与上述或下述多种实施方式的一种或多种组合，或任选地与具体实施方式组合——其中交联聚合物是如上定义的式(i)且不存在cl，交联聚合物的多糖是透明质酸，paa是聚谷氨酸根，aa是谷氨酸根，v是介于2和4之间的整数并且x w是介于2和200之间的整数。
[0143]
在具体实施方式中，任选地与上述多种实施方式一种或多种组合，或任选地与具体实施方式组合——其中交联聚合物是如上定义的式(i)且存在cl，交联聚合物的多糖是透明质酸，paa是聚谷氨酸根，aa是谷氨酸根，v＝1，x w是介于2和200之间的整数并且cl是-nh-ch(cooh)-(c
1-c4)-烷基-nh-。
[0144]
本发明的交联聚合物的盐、异构体和溶剂合物
[0145]
如本文所用的术语“盐”指本发明的交联聚合物的酸式盐或碱式盐。例如，本发明的交联聚合物包含一种或多种碱性氮，并因此可通过与酸——有机酸和无机酸二者——反应形成盐。所述盐的实例非限制性地包括：无机酸的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、高氯酸、硫酸或磷酸；和有机酸的盐，所述有机酸例如甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、富马酸、草酸、乙酸、马来酸、抗坏血酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、乙醇酸、琥珀酸和丙酸等；和季铵的盐，所述季铵例如碘甲烷、碘乙烷等等。
[0146]
本发明的一些交联聚合物可以包含一种或多种酸性质子，并因此也可通过与碱反应形成盐。所述盐的实例非限制性地包括：无机阳离子的盐，所述无机阳离子例如钠、钾、钙、镁、锂、铝、锌等；和与药学上可接受的胺形成的盐，所述药学上可接受的胺例如氨、烷基胺、羟基烷基胺、赖氨酸、精氨酸、n-甲基葡糖胺、普鲁卡因和类似物。
[0147]
对于可使用的盐的类型没有限制，条件是它们是药学上可接受用于治疗目的，因此，它们是无毒的。药学上可接受的盐被理解为指根据医学标准足以用来与人类或其他哺乳动物的组织接触而不引起过度毒性、刺激、过敏反应或类似作用的那些盐。药学上可接受的盐是本领域技术人员广泛熟知的。
[0148]
本发明的交联聚合物的盐可在本发明的交联聚合物的最终离析和纯化期间获得或通过以常规方式用足量所需的酸或碱处理本发明的交联聚合物以生产盐来制备。该盐又可以通过离子交换——使用例如而不限于离子交换树脂——转变为其他盐。
[0149]
本发明的交联聚合物和其盐在某些物理性质方面可能不同，但对于本发明的目的是等同的。本发明的交联聚合物的所有盐包括在本发明的范围内。
[0150]
本发明的交联聚合物可与溶剂形成复合物，该聚合物可与溶剂反应或它们从溶剂中沉淀或结晶。这些复合物被称为溶剂合物。如本文所用，术语“溶剂合物”指通过溶质(本发明的交联聚合物或其盐)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。示例性的溶剂包括药学上可接受的溶剂，例如而不限于水、乙醇和类似物。由水形成的复合物被称为水合物。包括水合物在内的本发明的交联聚合物(或其盐)的溶剂合物包括在本发明的范围内。
[0151]
本发明的交联聚合物可以以不同的物理形式存在，即以非结晶形式和结晶形式存在。此外，本发明的交联聚合物可能能够以多于一种形式结晶，该特性称为多晶性。例如，多晶型物可能在本领域技术人员所广泛熟知的一些物理性质方面不同，比如x射线衍射图、熔点或溶解度。本发明的交联聚合物的所有物理形式——包括其所有的多晶性形式(“多晶型物”)——包括在本发明的范围内。
[0152]
本发明的一些交联聚合物可以以数种光学异构体(或立体异构体)的形式存在，这取决于手性中心的存在。单一异构体、对映体或非对映异构体及其混合物落入本发明的范围内。类似地，并且除非另有说明，本发明的交联聚合物拟包括仅存在一个或多个同位素富集原子不同的交联聚合物。例如，以氘或氚取代一个或多个氢、或以富含
13
c或
14
c的碳取代一个或多个碳、或以富含
15
n的氮取代一个或多个氮的化合物在本发明的范围内。
[0153]
在另一个方面，本发明提供了用于式(i)的交联聚合物合成的方法，其中不存在cl并且多糖和聚氨基酸是自然存在的，该方法包括：(1.1)多糖和聚氨基酸通过它们的官能(和互补)基团的反应，其经由羧酸的活化反应和与反应性胺的偶联，其中通过调整活化的羧酸与反应性胺的相对摩尔比和反应条件，即，温度、反应时间和浓度控制所得交联聚合物
的交联度，和(1.2)通过在前面步骤中获得的反应产物的分馏、沉淀、超滤、透析、体积排阻色谱或切向流过滤进行纯化。在另一个方面，本发明提供了式(i)的交联聚合物合成的方法，其中不存在cl并且多糖和/或聚氨基酸是非自然存在的，该方法包括，(2.1)化学修饰多糖和/或聚氨基酸以便在它们之间并入化学上互补的官能团(一个或多个)，其将在合适反应条件下反应以形成稳定键，和通过官能团的摩尔比和反应条件，即温度、反应时间和浓度调整所得交联聚合物的交联度，和(2.2)通过在前面步骤中获得的反应产物的分馏、沉淀、超滤、透析、体积排阻色谱或切向流过滤进行纯化。
[0154]
本发明也提供了用于式(i)的交联聚合物合成的方法，其中存在cl并且多糖和聚氨基酸是自然存在的，该方法包括下列步骤：(3.1)使用连接分子使多糖和聚氨基酸反应以生成相应的cl基团，这通过(3.1.a)将多糖和聚氨基酸溶解在水溶液中(溶液a)，(3.1.b)将羧酸活化基团添加至溶液a(溶液b)，(3.1.c)将“连接分子”添加至溶液b以与活化的羧酸反应，和(3.2)通过通过分馏、沉淀、超滤、透析、体积排阻色谱或切向流过滤纯化在步骤(3.1)中获得的反应产物。本发明也提供了用于式(i)的交联聚合物合成的方法，其中存在cl并且多糖和/或聚氨基酸是非自然存在的，该方法包括下列步骤：(4.1)化学修饰多糖和/或聚氨基酸以便并入与连接分子的化学基团化学上互补的官能团(一个或多个)，(4.2)将所述化学修饰的多糖和聚氨基酸与连接分子反应以形成稳定键，并生成相应的cl基团，这通过(4.2.a)将化学修饰的多糖和聚氨基酸溶解在水溶液中(溶液a’)，(4.2.b)将羧酸活化基团添加至溶液a(溶液b)，(4.2.c)将“连接分子”添加至溶液b’以与活化的羧酸反应，(4.3)通过分馏、沉淀、超滤、透析、体积排阻色谱或切向流过滤纯化在步骤(4.2)中获得的反应产物。
[0155]
缀合物
[0156]
如本文所用的术语“缀合物”指包括本发明的交联聚合物和至少一种活性剂的组合。因此，本发明的交联聚合物可用作活性剂的药物递送，其中递送可以是缓释的或不是缓释的。因此，本发明涉及包括本发明的交联聚合物和至少一种结合至交联聚合物的活性剂的缀合物。
[0157]
在本发明的上下文中，术语“活性剂”指活性药剂、显象剂或美容剂(cosmetic agent)。
[0158]
活性剂(一种或多种)可以直接或通过连接基团共价结合至交联聚合物。当本文所用时，术语“连接基团”指连接或结合本发明的交联聚合物和至少一种活性剂的有机部分，其中连接基团可以独立且非限制性地是磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基甲酸酯、甲基膦酸酯、胍、二硫化物、酯、腙、氨基磺酸盐、磺酰胺、缩醛、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛(thioformacetal)、砜、酰胺和其混合物。活性剂可以通过聚氨基酸、多糖或它们两者共价地结合至交联聚合物。在具体实施方式中，共价键是生物响应性键。如本文所用的术语“生物响应性键”，指在特定的生理或外部触发条件下(例如且不限于ph、活性氧种类、还原性环境、特异性酶、葡萄糖、光、温度等)可裂解的化学连接。在具体实施方式中，本发明缀合物中的至少一种活性剂通过pls-(pls-ru)w基团和/或(paa)-(aa)
x
基团结合到本发明的交联聚合物上。
[0159]
可选地，活性剂可非共价地结合到本发明的交联聚合物上。
[0160]
在具体实施方式中，至少一种活性剂可以通过其包裹在胶束、脂质体、聚合胶束或
聚合物囊泡(polymersome)中并入本发明的交联聚合物中。
[0161]
在具体实施方式中，本发明缀合物的至少一种活性剂选自活性药剂、显象剂和其组合。
[0162]
在具体实施方式中，至少一种活性药剂选自小分子(即药物或前药)到生物分子(即激素、肽、(载脂)蛋白、抗体、fab或片段抗原结合、和核酸或类似物)。活性药物成分的实例非限制性地包括抗体、抗原、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(rgd)、双膦酸酯、适配体、gaptamer、多糖、双链寡核苷酸(dna)、sirna、短发夹rna、微小rna、反义序列、核酶或rna酶、锁核酸、肽核酸、嵌入核酸等。在具体实施方式中，活性药物成分选自疫苗、抗氧化剂、抗炎药、神经保护剂、维生素、紫外线过滤剂、离子、金属、生长因子、干细胞、天然提取物、化学治疗剂、rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂、蛋白质、解毒剂、止痛药、麻醉药、抗糖尿病药、抗生素、抗真菌药、抗组胺药、皮质激素、抗癌剂、抗转移剂、抗凋亡药、促凋亡药、神经保护剂、免疫刺激剂和免疫抑制剂。
[0163]
维生素包括维生素类似物、维生素衍生物和改性维生素，其可以包括在颗粒(例如，微粒)中，并且本公开内容的组合物包括但不限于维生素a(和维生素a前体)、硫胺素(维生素b1)、核黄素(维生素b2)、烟酸(维生素b3)、吡哆醇(维生素b6)、叶酸、钴胺素(维生素b12)、泛酸(维生素b5)、维生素c、维生素d、维生素e、生物素、维生素k、其他b族复合维生素、b族复合物相关化合物例如胆碱和肌醇、和类胡萝卜素例如而不限于，叶黄素、番茄红素、玉米黄质和虾青素。应当理解维生素的衍生物和类似物在本公开内容的范围内。本文考虑的类似物包括但不限于改性环结构、官能团或侧链的维生素分子——其包括额外去除保护基，和衍生自任何来源的盐及其复合体，例如化学合成的，或通过筛选方法(例如天然产物筛选)鉴定的，条件是类似物对维生素受体具有一些结合活性。在具体实施方式中，维生素是叶酸、烟酰胺、n,n-二乙基烟酰胺、生物素或水杨酸钠。
[0164]
如本文所用，术语“显象剂”指在任何成像技术中用作标记或增强特定结构的任何物质。因此，显象剂包括光学显象剂、磁共振显象剂、放射性同位素和造影剂。光学显象剂的非限制性的实例是吖啶染料、香豆素染料、罗丹明染料、呫吨染料、花青染料、和芘染料、德州红、alexa染料、染料、荧光素、oregon染料、和罗丹明绿
tm
染料，其是市售或通过本领域技术人员熟知的方法容易制备的。适合本发明的显象剂的实例包括但不限于与螯合剂螯合的过渡金属和放射性过渡金属，所述螯合剂例如dtpa(二亚乙基三胺五乙酸)、dota(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)和nota(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)。
[0165]
在另一个具体实施方式中，活性剂是美容剂。如本文所用，术语“美容剂”指拟施加到人体以清洁、美化、提升吸引力或改变外貌而不影响人体结构或功能的试剂。单独的交联聚合物或交联聚合物与至少一种美容剂的缀合物通过治疗和/或防止自由基的效果发挥作用，其包括但不限于过氧化皮肤物质(具体地，细胞例如角质细胞的膜质)、炎症、老化、褪色和皮肤纹理(skin grain)的细度，改善角质细胞的分化、滋润皮肤、和对皮肤末梢神经也有麻醉作用。
[0166]
在另一个具体实施方式中，本发明缀合物的至少一种美容剂选自维生素a、b1、b6、b12、e、c、pp、视黄酸、视黄醛、视黄醇及其酯、水杨酸及其和衍生物(具体是其盐或酯)、2,5-二羟基苯甲酸、生育酚及其酯(具体是生育酚磷酸酯)、积雪草酸、羟基积雪草酸及含其糖苷
的酯、积雪草苷、积雪草提取物、豨莶草提取物、原花青素低聚物(proantocyanide oligomer)，具体是由葡萄籽获得的那些和其酯(具体是棕榈酸酯和硬脂酸酯)、抗坏血酸衍生物(具体是其磷酸盐和其盐)、异抗坏血酸、微量元素(oligoelement)(具体是盐的形式，特别是天冬氨酸盐或氯化镁、氯化硒、氯化锌或氯化铜的形式)、α-羟基化酸(具体是苹果酸、乳酸和酒石酸)和其酯(具体是与脂肪醇，例如硬脂醇)、氨基酸(具体是丝氨酸、苏氨酸、瓜氨酸和氨基酸组成nmf(天然保湿因子))、神经酰胺(具体是单个或混合使用的2、3或6神经酰胺)、植物神经酰胺(photoceramide)(具体是由小麦中提取的那些)和蜕皮类固醇(ecdysteroid)(具体是蜕皮甾酮)及其酯。
[0167]
在具体实施方式中，本发明缀合物的至少一种美容剂选自能够触发组织修复和/或再生的试剂、胶束和维生素。
[0168]
如本文所用，术语“能够触发组织修复和/或再生的活性成分”指皮肤细胞的再生，其允许减少例如人皮肤上的皮肤妊娠纹，或允许烧伤例如但不限于太阳灼伤后愈合皮肤细胞。
[0169]
药物、诊断、治疗诊断和(皮肤)化妆品组合物
[0170]
在进一步方面，本发明还涉及药物、诊断或治疗诊断组合物，其至少包括本发明的缀合物——所述缀合物至少分别包括活性药剂和/或显象剂、和一种和多种分别在药学、诊断学和治疗诊断学上可接受的赋形剂或载体。
[0171]
如上所述，本发明也涉及药物组合物(或制剂)，其至少包括活性药剂、本发明的交联聚合物(或其药学上可接受的盐或溶剂合物)和一种或多种药学上可接受的赋形剂。赋形剂必须是“可接受的”，在某种意义上是与该组合物的剩余成分相容并且对服用所述组合物的那些人无害。
[0172]
众所周知，药物组合物的性质将依赖于活性药剂的性质及其施用途径。原则上，可使用任何施用途径，例如，口服、全身性的——例如，通过静脉、皮下或肌内注射、鞘内、鼻内、眼内递送、直肠、局部和皮下注射。
[0173]
用于口服施用的固体药物制剂包括片剂、颗粒和胶囊。在任何情况下，制造方法将基于有效成分与赋形剂的简单混合、干燥制粒或湿法制粒。例如，这些赋形剂可以是稀释剂，例如乳糖、微晶纤维素、甘露醇或磷酸氢钙；结合剂，例如淀粉、明胶或聚乙烯吡咯烷酮；分解剂(disaggregating agent)，例如羧甲基淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠；和润滑剂，例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以通过已知的技术进一步用赋形剂包衣，以延迟其在胃肠道中的分解和吸收，并因此实现在长时间段内的持续效果、或仅仅改善其感官性质或其稳定性。
[0174]
获得粉末和颗粒以便通过添加水，混合活性药剂与分散剂或湿润剂、悬浮剂和防腐剂制备口服悬浮液。也可添加其他赋形剂，例如，甜味剂、调味剂和着色剂。
[0175]
用于口服施用的液体形式可包括乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂，其包含通常使用的惰性稀释剂，例如蒸馏水、乙醇、山梨糖醇、甘油、聚乙二醇(聚乙二醇(macrogol))和丙二醇。所述制剂也可包含佐剂，例如润湿剂、悬浮剂、甜味剂和调味剂、防腐剂和ph调节剂。
[0176]
根据本发明，对肠道外施用的可注射制品包括在水性或非水性溶剂例如丙二醇、聚乙二醇或植物油中的无菌溶液、悬浮液或乳剂。这些药物制剂也可包含佐剂，例如湿润剂、乳化剂和分散剂、以及防腐剂。它们可通过任何通常已知的方法灭菌或制备为无菌固体
制剂，随后就在使用前立即将该制剂溶解入水或任何其他无菌可注射介质中。在整个制造方法期间，从无菌原始材料开始并将它们保持在这些条件下也是可能的。
[0177]
对于直肠施用，本发明的药物组合物可优选是栓剂，例如油性基础的(例如，植物油或半合成固体甘油酯)、或亲水性基础的，例如聚乙二醇(聚乙二醇(macrogol))。
[0178]
用于鼻腔施用或吸入，本发明的药物组合物可以是气雾剂的形式，使用适合的推进剂从其方便地释放药物组合物。
[0179]
本发明的药物组合物也可配制用于局部应用、用于治疗如此病理，其影响通过所述途径可进入的区域或器官，例如眼睛、皮肤和肠道。这些药物组合物包括霜、乳液、凝胶、粉末、溶液和贴剂，其中化合物在适当的赋形剂中分散或溶解。具有这样支架的生长因子的局部递送在很多情况下有助于伤口愈合和组织再生。
[0180]
本发明的交联聚合物——单独的或并入至少一种美容剂，也可在(皮肤)化妆品中使用。因此，本发明也涉及(皮肤)化妆品组合物，其包括本发明的交联聚合物或本发明的缀合物，其中至少一种活性剂是美容剂、和一种或多种化妆品上可接受的赋形剂。因此，本发明的(皮肤)化妆品组合物可以作为清洁组合物、皮肤护理化妆品、头发化妆品、和化妆品广泛地在多种应用中使用。其实例非限制性地包括乳、霜、面膜、流体、洗发水、沐浴露、洁面乳、湿巾(用于清洁)、湿巾(用于面部清洁)和卸妆液(用于睫毛膏、眼影和粉底)。皮肤护理化妆品的实例包括按摩凝胶、身体凝胶和面霜(face pack)。头发化妆品的实例包括头发护理、冲洗、发型制品和头发颜色。
[0181]
在具体实施方式中，(皮肤)化妆品组合物用于皮肤、粘膜和/或头发的护理保护和/或处理。由于与使用时舒适度有关的原因，(皮肤)化妆品组合物拟用于局部应用，通常以乳剂的形式。根据本发明的(皮肤)化妆品组合物可以以水包油(o/w)或油包水(w/o)乳剂的形式提供。对水相和油相的份数而言，根据对(皮肤)化妆品组合物期望的盖仑形式(galenical form)，以化妆品领域内常见的相对比例使用水相和油相。这些相对比例的确定在本领域内技术人员的能力范围内。根据本发明的具体优势特征，(皮肤)化妆品组合物优选地包括包含在水相中的生理保湿剂和包含在油相中的生理润肤剂。当(皮肤)化妆品组合物是乳剂时，脂肪相的比例在5％到80％w/w的范围内，优选地在5到50％w/w的范围内。乳剂可包含或不包含化妆品上和/或皮肤病学上可接受的赋形剂。这些赋形剂具体地可以是表面活性剂、脂肪物质、保湿剂、防腐剂、香水、胶凝剂、螯合剂、颜料例如tio2等。
[0182]
至少一种美容剂可以存在于(皮肤)化妆品组合物中，其范围在0.001到5％、0.05到4％、0.05到3％、0.04到2％、0.05到2％或0.01到1％重量/重量的至少一种美容剂相对于(皮肤)化妆品组合物的总重量(w/w)。
[0183]
本发明的缀合物的治疗、诊断和治疗诊断用途
[0184]
本发明也涉及本发明的缀合物或药物组合物的用途，其中至少一种活性剂是用于医学的活性药剂。可选地，本发明也涉及本发明的缀合物或药物组合物，其中至少一种活性剂是用于医学或治疗中的活性药剂。可选地，本发明涉及用于疾病治疗或预防的方法，其包括给需要的受试者施用药学上有效量的本发明的缀合物或药物组合物，其中至少一种活性剂是活性药剂。
[0185]
本发明也涉及本发明的缀合物或药物组合物的用途，其中至少一种活性剂是诊断学中的显象剂，可选地，这可表述为用于受试者中疾病诊断的方法。可选地，本发明也涉及
本发明的缀合物或诊断组合物，其中至少一种活性剂是用于诊断学中的显象剂。
[0186]
本发明也涉及本发明的缀合物或药物组合物用于治疗诊断的用途。可选地，本发明也涉及本发明的缀合物或药物组合物，用于治疗诊断。
[0187]
贯穿本说明书中，术语“治疗”包括治疗和预防。
[0188]
如本文所用，术语“治疗(treatment、treating)”指消除、降低或减少疾病的起因或影响。为了本发明的目的，“治疗”包括而不限于减轻、降低或消除疾病的一种或多种症状、降低疾病的等级、稳定(即不恶化)疾病的状态、延迟或减缓疾病的进展、减轻或改善疾病的状态、和缓解(无论全部或部分)疾病。
[0189]
如本文所用，术语“预防(prevention、preventing和prevent)”指将根据本发明的化合物、或其药学上可接受的盐、或药物组合物施用至受试者，该受试者在施用时尚未诊断为可能患有该疾病。预防也包括在之前遭受所述疾病的受试者中避免该疾病的再现。预防可以是完全的或部分的。
[0190]
如本文所用，术语“诊断的”和“诊断”指识别某些现象的性质和起因。
[0191]
如本文所用，术语“治疗诊断(theranostic)”，指用于个体患者的诊断治疗以测试他们对服用新药的可能反应和为他们制定治疗计划，换言之，是基于测试结果测试患者对药物的反应的诊断治疗形式。
[0192]
术语“受试者”、“个体”、“动物”和“患者”包括任何受试者，特别是哺乳动物受试者，预期对其治疗和/或预防。哺乳动物受试者包括人类、家畜、农场动物、和动物园动物或宠物。在本发明具体实施方式中，受试者是哺乳动物。在更具体实施方式中，受试者是人类，优选任何种族和性别的人类。
[0193]
可选地，本发明涉及本发明的缀合物或药物组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体用于制备或制造药物的用途。
[0194]
本发明也涉及化妆品皮肤护理的方法，其包括将化妆品上有效量的本发明的(皮肤)化妆品组合物局部地递送至受试者的皮肤。在具体实施方式中，化妆品皮肤护理的方法是进行化妆品护理，其选自避免或降低自由基对皮肤的有害效果、用于减缓或消除红疹或皮肤刺痛或针刺的感觉、有助于角质形成细胞的分化、恢复表皮的正常保湿、改善皮肤纹理细度、减缓或处理衰老对皮肤的影响、减轻色素沉着，该方法包括将化妆品上有效量的本发明化妆品制剂局部递送至其所需的人的皮肤区域。
[0195]
如本文所用，术语“药学上有效量”和“化妆品上有效量”，被理解为分别能够提供治疗效果和化妆品效果的量，并且其可由本领域技术人员通过常用手段测定。
[0196]
培养基及其用途
[0197]
本发明也涉及用于细胞和/或组织的培养基，其包括本发明的交联聚合物；以及培养细胞和/或组织的方法，其包括在所述培养基中培养所述细胞和/或组织(如图14所示)。
[0198]
如本文及在所附权利要求中所用的，除非上下文中另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。例如，“一个”或“一种”意味着“至少一个”或“一个或多个”。参考“方法”包括参考本文公开的和/或本领域技术人员熟知的等效步骤和方法。
[0199]
本文以权力要求书格式呈现的方面/实施方式
[0200]
1.一种交联聚合物，其包括下列式(i)的重复单元：
[0201][0202]
或其盐、溶剂合物或异构体，其中：
[0203]
pls是多糖的基团；
[0204]
pls-ru是所述多糖的重复单元基团；
[0205]
paa是聚氨基酸的基团，其中所述聚氨基酸选自均-、无规和嵌段共聚氨基酸，条件是所述均聚氨基酸不是聚阳离子的；
[0206]
aa是所述聚氨基酸的氨基酸单元基团；
[0207]
所述基团(aa)的下标x是1到200范围内的整数；
[0208]
所述基团[(paa)-(aa)
x
]的下标v是1到48范围内的整数；
[0209]
所述基团(pls-ru)的下标w是1到200范围内的整数；
[0210]
in是rop引发剂，其包括每个[(paa)-(aa)]基团的末端x基团，其中每个末端x基团直接结合到每个[(paa)-(aa)]基团上，和其中所述末端x基团选自-nh-、-o-、-s-或其组合；
[0211]
cl是选自下述的基团：(c
1-c
500
)-烷基，其中两个或更多h被下列取代：(1)(c
1-c
500
)-烷基；(2)(c
3-c
30
)-环烷基，(3)衍生自具有1-6个环的环系统的c-基团，每个环是独立饱和的、部分不饱和的或芳族的，所述环系统的所述环是分离的或稠合的并且每个环具有3-20种元件，每种元件独立地选自c、ch、ch2、co、o、s、n和nh，(4)oh，(5)nrarb，(6)onrcrd，(7)cn，(8)卤根，(9)sh2，(10)srerf，(11)n(h)nh2，(12)rgcorh，(13)coori，(14)con(rj)(rk)，(15)r
l
n(rm)con(rn)(r’n
)，(16)(c
1-c
30
)-烯，(17)(c
1-c
30
)-炔，(18)n3，(19)roch(or
p
)(orq)，(20)rrch(srs)(sr
t
)，(21)rub(orv)(orw)，(22)cor
x
；和其中没有c、多个c之一独立地被替换为(c
3-c
30
)-环烷基、芳基、芳基-(c
1-c
30
)-烷基、nr
yrz
、co、o、s、s(o)、s(o2)、b、p和(o-ch
2-ch2)a；
[0212]
基团(o-ch
2-ch2)的下标a是介于1和500之间的整数；
[0213]
ra、rb、rc、rd、re、rf、rh、ri、rj、rk、rm、rn、r’n
、r
p
、rq、rs、r
t
、rv、rw、r
x
、ry和rz是独立地选自h、(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基-(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，任何它们中，除了h，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子所取代；
[0214]
rg、r
l
、ro、rr和ru是独立地选自(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基-(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代；
[0215]
条件是：(1)可能存在或不存在cl，以致如果不存在cl，则所述pls-ru基团和所述aa基团形成直接稳定的键。
[0216]
2.根据权利要求1所述的交联聚合物，其中所述下标v是介于1和5之间的整数并且每个x末端基团是-nh-。
[0217]
3.根据权利要求1-2任一项所述的交联聚合物，其中不存在cl。
[0218]
4.根据权利要求1-2任一项所述的交联聚合物，其中存在cl。
[0219]
5.根据权利要求3-4任一项所述的交联聚合物，其中
[0220]
paa是式(ii)的基团
[0221][0222]
aa是式(iii)的基团
[0223][0224]
其中
[0225]
m、n、o、p和q是独立地选自0到500的整数，并且其中m n o p q》1；
[0226]
r1到r6独立地选自：
[0227][0228]
每个x1和x2独立地选自h、n、nh2和z；
[0229]
每个x3和x4独立地选自h和z；
[0230]
每个y和y’是独立地选自0到3的整数，其中y y’＝2或3；
[0231]
每个y”和y
”’
是独立地选自0到2的整数，其中y” y
”’
＝1或2；
[0232]
z选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子；和
[0233]
r8到r
13
独立地选自h和-c
1-c4烷基；
[0234]
条件是：(1)当不存在cl时，所述aa基团通过所述paa基团的末端通过肽键结合到所述paa基团上；和(2)当存在cl时，所述aa基团通过所述aa基团的胺末端结合到cl上。
[0235]
6.根据权利要求3-4任一项所述的交联聚合物，其中
[0236]
paa是式(iv)的基团
[0237][0238][0239]
aa是式(v)的基团
[0240][0241]
其中，
[0242]
m、n、o、p和q是独立地选自0到500的整数，并且其中m n o p q》1；
[0243]
r1至r5独立地选自：
[0244][0245]r’6选自：
[0246]
[0247]
每个x1和x2独立地选自h、n、nh2和z；
[0248]
每个x3和x4独立地选自h和z；
[0249]
r1到r5的每个下标y和y’是独立地选自0到3的整数，其中y y’＝2或3；
[0250]
r1到r5的每个下标y”和y
”’
是独立地选自0到2的整数，其中y” y
”’
＝1或2；
[0251]r’6的每个下标y是1或2；
[0252]r’6的下标y’是0或1；
[0253]
每个z独立地选自h、金属抗衡离子和无机抗衡离子；
[0254]
r7是选自下列的基团：(c
1-c
500
)-烷基，其中一个或多个h被下列取代：(1)(c
1-c
500
)-烷基；(2)(c
3-c
30
)-环烷基，(3)衍生自具有1-6个环的环系统的c-基团，每个环是独立饱和的、部分不饱和的或芳族的，所述环系统的所述环是分离的或稠合的并且每个环具有3-20种元件，每种元件独立地选自c、ch、ch2、co、o、s、n和nh，(4)oh，(5)nrarb，(6)onrcrd，(7)cn，(8)卤根，(9)sh2，(10)srerf，(11)n(h)nh2，(12)rgcorh，(13)coori，(14)con(rj)(rk)，(15)r
l
n(rm)con(rn)(r’n
)，(16)(c
1-c
30
)-烯，(17)(c
1-c
30
)-炔，(18)n3，(19)roch(or
p
)(orq)，(20)rrch(srs)(sr
t
)，(21)rub(orv)(orw)，(22)cor
x
；和其中没有c、多个c之一独立地被替换为(c
3-c
30
)-环烷基、芳基、芳基-(c
1-c
30
)-烷基、nr
yrz
、co、o、s、s(o)、s(o2)、b、p和(o-ch
2-ch2)a；
[0255]
基团(o-ch
2-ch2)的下标a是介于1和500之间的整数；
[0256]
ra、rb、rc、rd、re、rf、rh、ri、rj、rk、rm、rn、r’n
、r
p
、rq、rs、r
t
、rv、rw、r
x
、ry和rz是独立地选自h、(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基-(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，任何它们中，除了h，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代；
[0257]
rg、r
l
、ro、rr和ru是独立地选自(c
1-c
30
)-烷基、(c
1-c
30
)-烷基苯基、苯基、(c
1-c
30
)-烷基和(c
3-c8)-环烷基的基团；其中，一个或多个碳任选地被选自o、s、s(o)、s(o2)、卤根、n、nh、p和co的杂原子取代；和
[0258]
r8到r
13
独立地选自h和(c
1-c4)-烷基；
[0259]
条件是：(1)当不存在cl时，所述aa基团通过所述paa基团的末端胺通过肽键结合到paa基团上；和(2)当存在cl时，所述基团aa通过r
’6结合到cl上。
[0260]
7.根据权利要求5所述的交联聚合物，其中r1＝r2＝r3＝r4＝r5＝r6。
[0261]
8.根据权利要求7所述的交联聚合物，其中所述r1＝r2＝r3＝r4＝r5＝r6选自：
[0262][0263]
其中z如权利要求5所定义。
[0264]
9.根据权利要求6所述的交联聚合物，其中r1＝r2＝r3＝r4＝r5和r
’6是所述r1＝r2＝r3＝r4＝r5对应的双基团。
[0265]
10.根据权利要求9所述的交联聚合物，其中所述r1＝r2＝r3＝r4＝r5选自：
[0266]
[0267]r’6选自：
[0268][0269]
和z如权利要求6所定义。
[0270]
11.根据权利要求5所述的交联聚合物，其中所述聚氨基酸是无规或嵌段共聚氨基酸。
[0271]
12.根据权利要求11所述的交联聚合物，其中r1、r2、r3、r4、r5和r6独立地选自：
[0272][0273]
z、x1到x4、y、y’、y”和y
”’
如权利要求5所定义。
[0274]
13.根据权利要求12所述的交联聚合物，其中r1、r2、r3、r4、r5和r6独立地选自：
[0275][0276]
z、x1到x4、y、y’、y”和y
”’
如权利要求5所定义。
[0277]
14.根据权利要求14所述的交联聚合物，其中所述聚氨基酸是无规或嵌段共聚氨基酸。
[0278]
15.根据权利要求14所述的交联聚合物，其中r1到r5独立地选自：
[0279][0280]r’6选自：
[0281][0282]
和z、x1到x4、y、y’、y”和y
”’
如权利要求6所定义。
[0283]
16.根据权利要求15所述的交联聚合物，其中r1到r5独立地选自：
[0284][0285]
和z、x1到x4、y、y’、y”和y
”’
如权利要求6所定义。
[0286]
17.根据权利要求6、9、10和14-16任一项所述的交联聚合物，其中r7选自h、co-(c
1-c
20
)-烷基、conh-(c
1-c
20
)-烷基和焦谷氨酸根。
[0287]
18.根据权利要求4-17任一项所述的交联聚合物，其中cl选自：
[0288][0289]
其中r1到r5和r7到r
13
独立地选自：
[0290][0291]
p
‘
和s’是独立地选自0到500的整数；和
[0292]
r6独立地选自h和(c
1-c4)-烷基。
[0293]
19.根据权利要求4-17任一项所述的交联聚合物，其中cl是-nh-ch(cooh)-(c
1-c
30
)-烷基-nh-。
[0294]
20.根据权利要求1-19任一项所述的交联聚合物，其中pls是选自透明质酸、果胶、壳聚糖和硫酸软骨素的多糖。
[0295]
21.根据权利要求3所述的交联聚合物，其中所述多糖是透明质酸，paa是聚谷氨酸根，aa是谷氨酸根，v介于2和4之间的整数并且x w是介于2和200之间的整数。
[0296]
22.根据权利要求4所述的交联聚合物，其中所述多糖是透明质酸，paa是聚谷氨酸根，aa是谷氨酸根，v＝1，x w是介于2和200之间的整数并且cl是-nh-ch(cooh)-(c
1-c4)-烷
基-nh-。
[0297]
23.一种缀合物，其包括如权利要求1到22任一项所定义的交联聚合物和结合到交联聚合物上的至少一种活性剂。
[0298]
24.根据权利要求23所述的缀合物，其中所述至少一种活性剂通过pls-(pls-ru)w基团和/或(paa)-(aa)
x
基团结合到交联聚合物上。
[0299]
25.根据权利要求23-24任一项所述的缀合物，其中所述至少一种活性剂选自活性药剂、显象剂及其组合。
[0300]
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述至少一种活性药剂选自疫苗、抗氧化剂、抗炎药、神经保护剂、维生素、紫外线过滤剂、离子、金属、生长因子、干细胞、天然提取物、化学治疗剂、rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂、蛋白质、解毒剂、止痛药、麻醉药、抗糖尿病药、抗生素、抗真菌药、抗组胺药、皮质激素、抗癌剂、抗转移剂、抗凋亡药、促凋亡药、神经保护剂、免疫刺激剂和免疫抑制剂。
[0301]
27.如权利要求25所定义的所述缀合物作为显象剂的用途。
[0302]
28.根据权利要求23-24任一项所述的缀合物，其中所述至少一种活性剂是美容剂。
[0303]
29.根据权利要求28所述的缀合物，其中所述至少一种美容剂选自能够触发组织修复和/或再生的制剂、胶束和维生素。
[0304]
30.一种药物、诊断或治疗诊断组合物，其包括至少一种如权利要求25-26任一项所定义的缀合物、和一种或多种分别在药学、诊断学和诊断治疗学上可接受的赋形剂或载体。
[0305]
31.如权利要求25-26任一项所定义的缀合物或如权利要求30所定义的药物组合物，其用于医学或治疗。
[0306]
32.如权利要求25所定义的缀合物或如权利要求30所定义的诊断组合物，其用于诊断学。
[0307]
33.一种(皮肤)化妆品组合物，其包括如权利要求1-22任一项所定义的交联聚合物或如权利要求28-29任一项所定义的缀合物、和一种或多种化妆品上可接受的赋形剂。
[0308]
34.一种细胞和/或组织的培养基，其包括如权利要求1-22任一项所定义的所述交联聚合物。
[0309]
35.一种培养细胞和/或组织的方法，其包括以如权利要求34所定义的培养基培养所述细胞和/或组织。
[0310]
实施例
[0311]
化学制品
[0312]
除非另有说明，否则下列实施例中使用的所有化学制品是试剂级的，无需进一步纯化即可使用，并且购自sigma-aldrich。
[0313]
当用于实施例中详述的化学反应时，不同mw(分子重量)的透明质酸购自saequim especialidades s.l.(aurora，50kda)，并且当用于实施例中比较目的时，其购自soliance(primalhyal300，200kda)。999单位/mg的透明质酸酶(haase)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(dmtmmcl)购自sigma aldrich。无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf，≥99.8％无水)、二甲基亚砜(dmso，≥99.8％无水)和四氢呋喃(thf，≥99.8％无水)
购自scharlab s.l.(西班牙巴塞罗那省)。硝酸钠、氢氧化钠、磷酸二氢钠和七水磷酸氢二钠得自vwr international。l-赖氨酸盐酸盐和12m的浓盐酸得自fisher scientific。花青5.5胺和dil染料分别购自lumiprobe和invitrogen。氧化氘购自deutero gmbh。在所有水性制品中使用电阻率18mω.cm的超纯水(超纯)。始于正丁胺的15kda的聚谷氨酸钠、和不同结构的3kda的聚谷氨酸钠(即，始于正丁胺或1,4-正丁二胺)的合成如其他地方所述(见，例如，deng，c.等，2014；lu，h.等，2014)。具有30kda mwco(分子量截留)的pes柱的切向流过滤(tff)型号设备900-1893由spectrum labs提供。vivaspin 100kda的mwco pes购自sartorius。
[0314]1h nmr光谱
[0315]
在27℃(300
°
k)下、在来自bruker(美国马萨诸塞州比勒利卡)的300ultrashield
tm
上记录1h nmr光谱。以软件topspin(bruker gmbh，德国卡尔斯鲁厄)处理数据。在氘代溶剂中以5mg/ml制备样品。
[0316]
sec-ri-mals
[0317]
在来自postnova analytics(德国兰茨贝格)的af2000系统中，在包含0.1m nano3和0.005％(w/w)叠氮化物作为添加剂的水性介质中进行sec测量。该系统配置为在具有等度泵(pn1130)、自动进样器(pn5300)、折射率(ri，pn3150)和21角度多角度光散射(mals，pn3621)的sec模式下工作。利用一个tskgel g6000pwxl柱在30℃下使用0.7ml/min的工作流速。折射率和多角度光散射用于检测和mw测定，通过定义明确的pululan(50kda)实现ri和mals检测器二者的校准，并用购自polymer standards service(pss)/德国美因茨的聚甲基丙烯酸钠盐(62.5kda pmass)标准品验证。为了表征napga/na-nbu(pga)2、naha和交联聚合物，每次注射30μl 5mg/ml的对应溶液。假定从色谱柱中95-100％的回收，dn/dc值由回收的质量确定，并且发现对于pga在0.185-0.195的范围内、和对于ha和交联聚合物在1.4-1.5的范围内。
[0318]
实施例1.透明质酸-聚-l-谷氨酸-l-赖氨酸-([ha]-[pga]-[lys])交联聚合物的设计与合成
[0319]
按照本领域技术人员熟知的常规肽偶联过程，使用l-赖氨酸作为连接分子合成两种不同的[ha]-[pga]代表性的交联聚合物(例如barz，m等，2013)。通过仔细地控制反应条件(例如试剂的摩尔比、ph、反应混合物浓度等)，合成方法提供了用于在复杂产品混合物中控制交联聚合物的交联度和富集的步骤。
[0320]
一般合成步骤
[0321]
制备下列溶液：
[0322]-将透明质酸钠(naha)溶解在蒸馏水中(溶液a)
[0323]-将始于正丁胺的聚-l-谷氨酸钠(na-nbupga)溶解在蒸馏水中(溶液b)
[0324]-将4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(dmtmmcl)溶解在蒸馏水中(溶液c)
[0325]-将l-赖氨酸盐酸盐(lys
·
hcl)溶解在蒸馏水中(溶液d)
[0326]
首先将溶液a和b混合。然后添加溶液c。将所得的反应混合物搅拌15分钟。然后，添加溶液d，并且在rt(室温)下过夜进行反应，然后调整ph。使用具有mwco 30kda膜的切向流过滤(tff)系统通过透析纯化获得的产品，该膜依次以ph7.5的5mm磷酸盐缓冲液(pb)和蒸
馏水洗涤。将溶液冻干并获得白色粉末。图1显示了用来制备上述溶液的原始材料(l-赖氨酸盐酸盐lys
·
hcl、聚-l-谷氨酸钠napga和透明质酸钠naha)的1h nmr光谱。
[0327][0328][0329]
方案1.用于实施例1a和1b的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物的合成的合成方法，其中m是126，n是100，和x y≤6.4。
[0330]
实施例1a.低交联度[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物
[0331]
按照前面描述的一般合成步骤合成低交联度[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物。每个反应中使用的试剂的量如下表1所详述。反应的总体积是1.165ml。反应在ph＝6-7下进行。
[0332]
表1
[0333]
化合物nahana-nbupga总羧酸盐lys
·
hcldmtmmclmw单体(da)401.31151.11-182.65276.72mol1.74e-011,22e-021.87e-015.58e-038.72e-02克70.001.8451-1.019524.1340
当量10.071.070.0320.5
[0334]
图1显示了通过消除侧残留物(side residue)纯化后在实施例1a中获得的合成的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物的1h nmr光谱。如1h nmr光谱所示，将pga残基并入所得交联聚合物的结构中(见虚线区域)。
[0335]
使用ri检测器获得商用naha与napga交联前(实线)和交联后(虚线)的色谱图。如图2所示，插图显示了在测定了绝对mw(折射率和光散射)之后ri信号和mw分布的重叠。下表2显示了经由naha和实施例1a中获得的交联聚合物的ri-mals分析对mw和pdi(多分散指数)的定量分析。通过与naha相比实施例1a中获得的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物mw的两倍增加证明了交联。
[0336]
表2
[0337]
化合物mw(kda)pdinaha50.41.37[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物101.41.68
[0338]
实施例1b.高交联度[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物
[0339]
按照前面描述的一般合成步骤合成高交联度[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物。每个反应中使用的试剂的量如上面表1所详述，但反应的总体积是840ml。反应在ph＝8.5下进行。
[0340]
如图1的实施例1b中获得的合成的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物的1h nmr光谱所示，将pga残基并入合成交联聚合物的结构中(见虚线区域)。
[0341]
使用ri检测器获得商用naha与napga残基交联之前(实线)和之后(虚线)的色谱图。如图2所示，插图显示了在测定了绝对mw(折射率和光散射)之后ri信号和mw分布的重叠。下表3显示了经由naha和实施例1b中获得的交联聚合物的ri-mals分析对mw和pdi的定量分析。通过与naha相比实施例1b中获得的[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物mw的三倍增加证明了交联。
[0342]
表3
[0343]
化合物mw(kda)pdinaha50.41.37[ha]-[pga]-[lys]交联聚合物145.71.37
[0344]
实施例2.自交联透明质酸-聚-l-谷氨酸([ha]-[pga])交联聚合物的设计与合成
[0345]
使用具有两个n末端反应性胺部分的双官能团且对称的pga基序合成代表性的[ha]-[pga]交联聚合物，并且按照其他地方描述的传统合成步骤。
[0346][0347][0348]
使用双官能团聚-l-谷氨酸盐，即由双官能团的正丁二胺(na-nbu(pga)2)起始的pga合成[ha]-[pga]交联聚合物的合成方法，其中m是126，n是100和≤6。
[0349]
一般合成步骤
[0350]
对于使用具有两个n末端反应性胺部分的双官能团且对称的pga基序合成自交联[ha]-[pga]交联聚合物，制备下列溶液：
[0351]-将透明质酸钠(naha)溶解在蒸馏水中(溶液a)
[0352]-将4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(dmtmmcl)溶解在蒸馏水中(溶液b)
[0353]-将起始于1,4-丁二胺(na-nbu(pga)2)的双官能团聚-l-谷氨酸钠溶解在蒸馏水
中(溶液c)
[0354]
在下表4中概述了以上溶液的使用量。
[0355]
表4
[0356]
化合物nahana-nbu(pga)2dmtmmclmw(da)401.323020276.72摩尔1.25e-033.74e-056.23e-04克0.50000.11290.1724当量10.030.50
[0357]
将溶液b添加到a上，并且用naoh将ph调整至7。将所得反应混合物搅拌15分钟。然后，添加溶液c，并在rt下过夜进行反应。将ph调整至8.5，和测量其为6-5.0。使用具有mwco 30kda膜的切向流过滤(tff)系统通过透析纯化获得的产品，该膜依次以ph为7.5的5mm pb和蒸馏水洗涤。将溶液冻干并获得白色粉末。图4显示了用来制备上述溶液的原始材料(用来制备上述溶液的聚-l-谷氨酸钠(na-nbu-(pga)2)和透明质酸钠(naha))的1h nmr光谱。如光谱中所示，pga残基并入合成交联聚合物的结构中(见虚线区域)。
[0358]
对于使用具有单个n末端反应性胺部分的单功能团的pga基序合成[ha]-[pga]交联聚合物，制备下列溶液(在上面表4中也概述了溶液的使用量)：
[0359]-将透明质酸钠(naha)溶解在蒸馏水中(溶液a)
[0360]-将4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(dmtmmcl)溶解在蒸馏水中(溶液b)
[0361]-将起始于正丁胺的单官能团聚-l-谷氨酸钠(na-nbupga)溶解在蒸馏水中(溶液c)
[0362]
将溶液b添加到a中，和以几微升1m的naoh将ph调整至7。将所得反应混合物搅拌15分钟。之后，添加溶液c和以几微升1m的naoh调整ph至8.5。在rt下过夜进行反应。然后，使用具有mwco 30kda膜的切向流过滤(tff)系统通过透析纯化产品，该膜首先以ph为7.5的5mm pb洗涤和用蒸馏水洗涤。将溶液冻干并获得白色粉末。
[0363]
为了检查双官能团pga通过两端胺部分有效地与ha交联，获得使用双官能团且对称的pga的对应的自交联[ha]-[pga]交联聚合物的尺寸排阻色谱分析(见图5，实线)。使用ri检测器也获得了对naha与pga交联之前(方线)和之后(十字线)的比较色谱图。插图显示了在测定绝对分子量(折射率和光散射)之后ri信号和mw分布的重叠。通过mw两倍的增加证明了双官能团pga的交联。下表5通过na-nbu(pga)2、ha和所得[ha]-[pga]交联聚合物的ri-mals分析显示了mww和pdi的定量分析。
[0364]
表5
[0365]
化合物mw(kda)pdinaha50.41.37na-nbu(pga)24.91.12[ha]-[pga]交联聚合物110.71.36
[0366]
作为对照实验，在交联反应中使用单官能团的pga。获得了对应的自交联[ha]-[pga]交联聚合物的尺寸排阻色谱分析(见图6，实线)。使用ri检测器用于商用透明质酸钠
(交叉线)和与单官能团的pga交联反应后(实线)的比较色谱图。插图显示了在测定绝对分子量(折射率和光散射)之后ri信号和mw分布的重叠。通过mw的小幅增加和色谱图更高的双峰性质证明了交联的缺乏。不像双官能团的pga，该单官能团的pga缺乏产生交联点的能力，并因此结果与存在ha-pga缀合物而不是交联结构匹配。下表6经由naha、na-nbupga、和所得自交联[ha]-[pga]交联聚合物的ri-mals分析显示了mw和pdi的定量分析，与来源ha相比其显示了mw小幅增加，这确定形成了ha-pga缀合物而不是交联聚合物。
[0367]
表6
[0368][0369][0370]
实施例4.流变学
[0371]
通过使用平行钢板-钢板结构(40mm直径)，在装备有珀尔帖温度控制配件的ta ar-g2流变仪上进行流变学测量。间隙距离固定为1,000nm。所测试的样品由实施例1a、1b的交联聚合物和商用naha(50kda和250kda)组成。样品在milliq水中在所需的条件下制备并老化24h。均匀的样品层放置在两个板之间。在20℃下进行频率和应力扫描步骤。
[0372]
在振荡实验下研究了粘弹性性质，并且结果如图7所示。在线性粘弹性范围(lvr)内以1hz的频率进行所有的测量。出于这个目的，通过运行应力扫描步骤(振荡应力：在1hz时为0.1-1,000pa)和频率扫描步骤(在0.2pa时为0.1-100hz)来测定实现lvr的实验条件。储能模量和损耗模量——与施加的频率和振荡应力独立——限定了lvr。结果表明，在所研究的浓度(5％wt)下，只有实施例1b的水凝胶显示出对于粘弹性水凝胶的预期流变学行为，即，储能模量(g
′
)高于损耗模量(g
″
)。实施例1a的交联聚合物的水凝胶和商用的50kda和250kda ha在获得的条件下表现出g
″
高于g
′
的粘性液体特性。这些结果表明实施例1b的交联聚合物的水凝胶——与实施例1a的交联聚合物的水凝胶相比具有略高的交联度——提供了商用和线性ha无法获得的粘弹性水凝胶。总的来说，令人意外地，这些结果显示了通过仔细地控制交联反应的条件和由此的最终交联聚合物的组成，可以实现对粘弹性性质的微调。
[0373]
在不同浓度的交联聚合物下进一步表征了实施例1b的交联聚合物的水凝胶。发现所有测试的样品在施加的压力范围内呈现出粘弹性行为，即储能模量(g
′
)高于损耗模量(g
″
)。如下表7中所示，储能模量随着浓度的增加而增加，屈服应力也增加，其中由于损耗模量更大的贡献(g
″
》g
′
)，粘弹性特性丢失。
[0374]
表7.在不同浓度和在15℃下，用于实施例1b的高交联度交联聚合物的流变参数
[0375]
浓度(％wt)屈服应力，σy(pa)ag’(pa)b0.50.81.311.63.12453.52014
53024
[0376]a如g’＝g”点处测定的。b在1pa的震荡力下测定的。“wt”代表重量
[0377]
数据显示，在使用的条件下，实施例1b的交联聚合物显示了粘弹性特性(g
′
》g
″
)，其中具有低交联度的实施例1a的交联聚合物和商用ha(250kda和50kda)在进行的震荡实验下表现为粘性液体(见图7)。
[0378]
实施例5.本发明的交联聚合物与化妆品制剂的相容性分析
[0379]
使用低粘度o/w(水包油)乳液作为常规化妆品制剂的代表性实例研究本发明的交联聚合物与化妆品制剂的相容性。具体地，所测试的交联聚合物是实施例1b中的交联聚合物。
[0380]
作为一般步骤，将油相和水相在80℃浴盆(海沙)中保持15分钟以确保温度均匀。将实施例1b的高交联度交联聚合物溶解在水相中并且将乳化剂包括在油相中。将水相放置于100ml的烧杯中，并使用配备25n-18g头的ultraturrax t25在5,000r.p.m.下搅拌。在10分钟时期内将油相添加到先前获得的水相中，此后保持搅拌，同时允许冷却至rt以生产待测试的化妆品制剂。下表7显示了用于其制备的相对量。如表7所示，一般地，实施例1b的交联聚合物的添加增加了所测试制剂的粘度。
[0381]
表8
[0382]
制剂[交联聚合物](％)水(ml)葵花籽油(ml)a&l粘度(pa.s)asv-yal-27-32161.002.3sv-yal-280.2532160.753.3sv-yal-290.5032160.754.5sv-yal-300.7532160.755.1sv-yal-321.0032160.759.0
[0383]a在1s-1
的剪切速率下测量的。“a&l”代表醇和月桂基硫酸钠
[0384]
通过在不同的温度(5到40℃的范围内)和在不同的r.p.m.(7,500到10,000rpm的范围内)下离心研究化妆品制剂的强制稳定性。实施例1b的交联聚合物的并入增加了该制剂针对离心力的稳定性(见图8)。
[0385]
实施例6.以透明质酸酶(haase)消化本发明的交联聚合物
[0386]
经由尺寸排阻色谱研究haase降解。最初，将3.75mg/ml的商用ha(250kda)和实施例1b的交联聚合物在37℃下在仪器自动进样器af2000中独自与透明质酸酶(0.005mg/ml，对应于5u/ml)温育。在需要的时间点注射30μl的每个样品。利用ri和mals检测——其采用从回收物质中测定的dn/dc——进行mw的测定。如图9所示，从sec-ri-mals测定mw揭示了商用ha的在前5h内的快速降解，这导致mw降至35kda，而交联聚合物的mw在以haase处理24h后几乎保持未改变。
[0387]
实施例7.交联聚合物作为药物递送系统：人体皮肤渗透测定
[0388]
为了研究在局部应用中本发明的交联聚合物的潜力，在人类皮肤上进行渗透研究。
[0389]
实施例7.1.交联聚合物作为聚合物胶束的药物递送系统
[0390]
评估交联聚合物溶液作为平台对于配置聚合物胶束为药物递送运载体的影响。
[0391]
材料和方法
[0392]
从商用嵌段共聚物经由共溶剂方法制备荧光标记的聚合物胶束。简要来说，将(20mg/ml)和荧光染料(dil-c18(3)，0.2mg/ml)溶解在thf中并且在rt下逐滴地添加到持续搅拌的milliq水中，直至有机溶剂蒸发。允许制剂在rt下平衡24小时，然后在1,000rpm下离心10分钟。上清液对milliq水透析，mwco＝1,000da。所得荧光标记的聚合物胶束独自在milliq水和在3.75mg/ml的实施例1a的交联聚合物溶液中配制。
[0393]
皮肤准备
[0394]
使用从整容手术中获得的全厚度人类皮肤研究皮肤渗透。为了减少个体间变异性和提供更好的比较结果，在所有实验中只使用一个供体的皮肤。将皮肤切成适合放置在改进的弗朗兹型扩散池上的块(4
×
4cm)。将覆盖有盐水润湿的过滤纸的皮肤用塑料薄膜和铝箔包裹，储存在-20℃中直至使用。在进行试验之前，通过解剖刀小心地去除皮下脂肪并允许皮肤恢复到rt。
[0395]
渗透研究
[0396]
所有的皮肤渗透研究使用具有0.95cm2扩散面积的改进的弗朗兹型扩散池。将皮肤小心的安装在上面的供体室和下面的受体室之间并且角质层朝上。然后以8ml磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph＝7.4)小心地充满受体室以避免膜下面捕集空气，在37℃的恒温下以600r.p.m.的速度搅拌。在平衡30分钟时间后，使用标准移液管将每个测试制剂的100μl引入供体室。在所有情况下，使用固定浓度的制剂(10mg/ml的荧光标记的聚合物胶束)。然后以和铝箔密封供体室。实验运行24小时。在预先设定的时间间隔下，从受体室中抽出全部受体介质并替换为相同体积的平衡至实验温度(37℃)的新鲜缓冲液。
[0397]
通过共聚焦激光扫描显微镜皮肤可视化
[0398]
将部分皮肤在10％福尔马林中固定24h，接着固定在30％蔗糖的磷酸盐缓冲液中。将皮肤在干冰上冷冻保存，然后使用切片机切成10微米厚的切片。在-20℃下冷冻皮肤片，从已处理的区域剪下0.2cm
×
0.5cm的片并包埋入最佳切割温度(oct)化合物。使用低温恒温器(leica cryostat cm3050s，韦茨拉尔，德国)制备皮肤的垂直横截面。获得每个样品九到十二个20μm厚的垂直截面并且储存在4℃下直至用显微镜分析。将切片放置到载玻片上，以福尔马林固定并以6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色。然后在共聚焦激光扫描显微镜下检查。dil-c18(3)在λex＝549nm处激发并在λem＝566nm处检测，并且以红色表示荧光发射信号。以来自蓝色二极管的405nm线激发dapi染色的细胞核。当在纯milliq水中配制时(图10a)，发现以dil-c18(3)染料(红色)标记的聚合物胶束优先积累到角质层上。相反，存在交联聚合物的情况下，如dil-c18(3)荧光(红色)在表皮区域的增加所揭示(以dapi染色的角质形成细胞的细胞核，蓝色)(图10b)，观察到渗透入表皮层的明显增强。
[0399]
实施例7.2.交联聚合物作为缀合活性分子的药物递送系统
[0400]
材料和方法
[0401]
花青5.5胺(cy5.5)购自lumiprobe。二甲基亚砜(dmso)、氢氧化钠和无水乙醇(》99％)得自scharlab。按照本领域技术人员熟知的常规方法合成偶联剂4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(dmtmmcl)。100kda mwco的vivaspin购自sartorius。
[0402]
缀合反应
[0403]
将实施例1b的交联聚合物(按照透明质酸钠的单位，401.33g/mol；100.00mg；0.2492mmol)添加到50ml的圆底烧瓶中并且在rt下以磁力搅拌器将其溶解在i型纯水(18ml)中。平行地，在具有磁力搅拌器的小瓶中，将偶联剂dmtmmcl(276.72g/mol；3.45mg；0.0125mmol；0.05当量透明质酸盐)溶解在i型纯水(1.5ml)中。将dmtmmcl溶液添加到交联聚合物溶液中，并且用几微升1m naoh将ph调整到7。允许通过dmtmmcl偶联激活羧酸以继续20-30分钟。此后，添加预先在dmso(0.5ml)和i型纯水(0.5ml)中制备的cy5.5溶液(753.88g/mol；1.88mg；0.0025mmol；0.01当量透明质酸盐)并且以几μl的1m naoh将ph调整到8.5。允许所得交联聚合物和cy5.5的缀合反应的蓝色溶液在rt下继续72h。
[0404]
缀合纯化
[0405]
此后，将缀合溶液添加到vivaspin 100kda mwco中并用ph7.5的200ml 5mm的pb洗涤以便去除反应的有机副产物(n-甲基吗啉(nmm)、dmtmmcl和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(cdmt))和dmso。用50ml i型纯水再次洗涤所得溶液以去除pb盐。然后，将所获溶液冷冻干燥并每次用45ml的无水乙醇洗涤所得的蓝色粉末五次和在真空下将乙醇去除。最后，得到干燥的蓝色粉末。
[0406]
通过uv-vis定量cy5.5
[0407]
在dmso中以2.5mg/ml制备cy5.5储备溶液。通过dmso储备溶液获得在i型纯水中的0.025mg/ml的cy5.5第二储备溶液。使用cy5.5作为标准品，以增加浓度(0.05到0.25μg/ml的cy5.5)测量λ＝676nm处的吸光度制备校准曲线。在ii型纯水中约在0.10μg/ml的cy5.5下制备与cy5.5缀合的实施例1b的交联聚合物溶液。测量λ＝676nm处的吸光度并且交联聚合物内cy5.5的负载量测定为1.1％w/w。
[0408]
图11，通过1h nmr和uv-vis显示了实施例1b的交联聚合物与cy5.5的缀合物的特性。1h nmr光谱显示了实施例1b的交联聚合物的典型信号，并且低cy5.5负载量阻碍了cy5.5相关的1h nmr信号的适当评估。然而，uv分析显示了交联聚合物-cy5.5缀合物内cy5.5的特征吸光度的存在。更重要的是，图12用ri和uv(676nm)检测器显示了交联聚合物-cy5.5缀合物的尺寸排阻色谱，其显示了沿着交联聚合物群cy5.5的均匀存在并因此确认了缀合物的身份和纯度。
[0409]
下表9显示了通过尺寸排阻色谱对商用50kd ha、实施例1b的交联聚合物和交联聚合物-cy5.5缀合物测定的mw。结果显示交联聚合物与cy5.5的缀合轻微地增加了对应交联聚合物的mw。
[0410]
表9
[0411]
化合物mw(kda)pdiha50.41.37实施例1b的交联聚合物145.71.37实施例1b的交联聚合物和cy5.5的缀合物186.21.41
[0412]
按照实施例7.1中描述的实验方法，通过上面描述的渗透实验使用在milliq水中10mg/ml浓度的缀合物评估交联聚合物-cy5.5缀合物局部递送到皮肤。
[0413]
通过共聚焦激光扫描显微镜皮肤可视化
[0414]
将皮肤在10％福尔马林中固定24h，接着固定在30％蔗糖的磷酸盐缓冲液中。然后将皮肤在干冰上冷冻保存，随后使用切片机切成10微米厚的切片。在-20℃下冷冻皮肤片，
从已处理的区域剪下0.2cm
×
0.5cm的片并嵌入最佳切割温度(oct)化合物。使用低温恒温器(leica cryostat cm3050s，韦茨拉尔，德国)制备皮肤的垂直横截面。获得每个样品九到十二个20μm厚的垂直截面并且储存在4℃下直至用显微镜分析。将切片放置到载玻片上，以福尔马林固定并以6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色。然后在共聚焦激光扫描显微镜下检查。交联聚合物-cy5.5缀合物在λex＝676nm处激发并在λem＝694nm处检测，并且以红色表示荧光发射信号。以来自蓝色二极管的405nm线激发dapi染色的细胞核。发现交联聚合物-cy5.5缀合物优先积累在角质层中，如图13所示，其明显渗透入表皮层，这表明意料之外地生成了在角质层处的交联聚合物的储库(reservoir)，其提供本发明的交联聚合物持续释放到表皮层。
[0415]
实施例8.交联聚合物作为细胞培养基组分以改善细胞活力。
[0416]
细胞活力试验
[0417]
为了进行体外细胞活力研究，使用成纤维细胞。在5％co2和37℃下的潮湿恒温箱中，使用的培养基是高dulbecco's改良eagle's培养基-高葡萄糖，补充有2％青霉素/链霉素和50ml胎牛血清(fbs)。
[0418]
步骤
[0419]
以2,000细胞/孔的浓度在96-孔板中接种50μl的细胞。在24小时后，添加每个处理50μl使孔中达到100μl最终体积。在添加到孔板前过滤所有处理(孔径0.45μm)。细胞与样品或对照一起温育72小时，然后进行mts试验。为此，分别以1：20的稀释添加20μl 90％的phenazine methosulfate minimum(pms，sigma，西班牙)溶液和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2h四唑)(mts，promega，西班牙)的盐。在温育3个小时后，使用victor2wallac
tm
板读取器读取490nm处的吸光度。用于实施例1a中所得的交联聚合物的检测浓度在5到0.02mg/ml的范围内。
[0420]
参考文献
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1.lavilla c,byrne m and heise a.block-sequence-specific polypeptides from α-amino acid n-carboxyanhydrides:synthesis and influence on polypeptide properties.macromolecules 2016,vol.49(8),pages 2941-2947.
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