一种农杆菌转化裂殖壶菌的方法和应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种农杆菌转化裂殖壶菌的方法和应用。


背景技术：

2.目前主要是通过电击将外源dna转化进入裂殖壶菌体内，但是电击转化的条件千差万别，已经报道的电击电压、电阻和电容各不相同，并且电击转化需要高浓度线性化处理的外源dna，工作量巨大。此外，电击转化的同源重组效率非常低，不利于基因敲除。
3.农杆菌转化系统是一种天然存在的基因转化系统，可将肿瘤诱导(ti)质粒上的t-dna转化进入植物细胞。t-dna两端存在两个25bp的重复序列，分别为左边界和右边界，转化过程还需要ti质粒上其它区域中的元件如毒性区(vir区)以及冠瘿碱代谢基因编码区参与辅助dna的转化。
4.当植物组织受伤时，伤口会分泌含有酚类物质的汁液，农杆菌感受到酚类物质的趋化性后开始向伤口部位迁移。迁移到伤口位置后，ti质粒上的各种毒力基因和辅助基因开始表达。其中，vird1和vird2在t-dna的右边界处切割产生单链dna缺口，vird2与切口处的t-dna单链末端结合，t-dna单链开始与互补链解链，vire2与解链部分的t-dna单链结合将其包裹，完全解链后最终形成t-复合体。t-复合体在一系列蛋白的协助下被转运到植物细胞内，接着进入细胞核插入到植物细胞的染色体中。
5.农杆菌不仅可以将t-dna转入植物细胞染色体，还可以对别的生物如细菌和真菌进行转化。例如，bundock等在1995年成功使用根癌农杆菌转化了酵母菌，de-groot等于1998年首次成功利用农杆菌侵染了黑曲霉(aspergillusniger)等6种丝状真菌。agl-1菌株是根癌农杆菌中重要的成员之一，据报道其已成功转化曲霉、木霉、侧耳等数十种真菌。裂殖壶菌(schizochytrium)又称裂壶藻，属于网粘菌门(labyrinthulomycota)、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。现有技术中报道的schizochytrium sp.hx-308是从海水中分离出的裂殖壶菌菌株，该菌株的生物量可达134.5g/l，油脂产量可达80.14g/l，有着巨大的商业应用价值，目前还没有在裂殖壶菌中形成一套完整的遗传操作系统及其定点敲除。


技术实现要素：

6.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种农杆菌转化裂殖壶菌的方法，本发明首次利用农杆菌将重组基因转化进入裂殖壶菌，为裂殖壶菌的dna转化和代谢工程改造提供了新的方法和有效的思路。
7.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种农杆菌转化裂殖壶菌的方法，使用农杆菌将外源基因转化进入裂殖壶菌体内，使裂殖壶菌获得导入外源基因的功能。
8.其中，所述农杆菌原始菌株为agl-1。
9.作为优选，所述农杆菌为被转入g418抗性基因表达盒的农杆菌agl-1。
10.其中，所述g418抗性基因表达盒的启动子为裂殖壶菌的内源性启动子p2845，所述
g418抗性基因为neor，所述g418抗性基因表达盒的终止子为裂殖壶菌的内源性终止子t2845。
11.其中，所述g418抗性基因表达盒的完整序列如序列seq id no.1所示。
12.其中，所述所述裂殖壶菌菌株为hx-308。
13.作为优选，所述农杆菌转化裂殖壶菌的方法具体包括如下步骤：
14.(1)重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845的构建：
15.以pzpk为骨架，插入了裂殖壶菌hx-308的启动子p2845(如序列seq id no.2所示)和终止子t2845(如序列seq id no.4所示)，在启动子和终止子中间插入g418抗性基因neor(如序列seq id no.3所示)，得到重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845；
16.(2)农杆菌agl-1待转化菌株的构建：
17.将重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845转化进入农杆菌体内，挑选出阳性单克隆，接种于液体培养基活化，活化完成后取适量农杆菌接种于含有乙酰丁香酮的液体培养基进行诱导；
18.(3)裂殖壶菌hx-308感受态的制备：
19.取甘油管保存的裂殖壶菌于平板上划线活化，挑取单克隆接种于液体培养基过夜活化，吸取活化菌液1-2ml接种于新的液体培养基再次活化；
20.(4)农杆菌agl-1和裂殖壶菌hx-308共培养：
21.吸取≥107个诱导后的农杆菌和≥106个活化好的裂殖壶菌，涂布于含有乙酰丁香酮的诱导固体培养基进行共培养，共培养时间≥24h；
22.(5)裂殖壶菌转化子的筛选：
23.使用涂布棒将共培养菌体冲洗下来，吸取0.3ml涂布于含有头孢噻肟钠和g418的固体培养基进行筛选，得到转化后的裂殖壶菌。
24.其中，所述步骤(4)中共培养时间≥24h，温度为28-30℃。
25.其中，所述步骤(5)中培养条件为28-30℃，培养时间为3-7天。
26.本发明所述的农杆菌转化裂殖壶菌的方法在裂殖壶菌的dna转化和代谢工程改造中的应用。
27.本发明首次使用农杆菌agl-1将外源抗性基因表达盒neor转化进入裂殖壶菌hx-308体内，成功赋予裂殖壶菌hx-308对药物g418的耐受性。实验证明获得neor表达盒的裂殖壶菌hx-308菌株可在含有浓度超过1mg/ml g418的培养基上正常生长，提取转化子dna验证也显示neror表达盒成功进入裂殖壶菌基因组。本发明提供了一种将外源dna转化进入裂殖壶菌的新的方法，使用此方法可将任意外源基因转化进入裂殖壶菌hx-308，为裂殖壶菌hx-308的后续改造提供了广阔的工业化应用前景。
28.本发明首次使用特定的农杆菌agl-1将特定的外源基因g418抗性基因转化进入特定裂殖壶菌hx-308，并构建了一个特定的转化方法，不仅实现了外源dna转化进入裂殖壶菌，同时实现了可完成外源基因表达盒的定点整合，并简化了遗传操作步骤；不同于现有常规电击转化的实验思路，只是通过随机整合过表达一系列基因，无法实现定点敲除。
29.本发明实验操作非常简单，有效节约了时间和成本，本发明不仅可以实现农杆菌转化裂殖壶菌，更重要的可以实现基因敲除，通过基因敲除，可以于在裂殖壶菌体内构建了一套完整的遗传操作系统。
30.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
31.(1)本发明构建的农杆菌agl-1转化裂殖壶菌hx-308的方法，可高效将外源基因如neor转化进入裂殖壶菌hx-308体内，使裂殖壶菌获得g418抗性，并且在后续的传代过程中保持稳定不丢失。
32.(2)农杆菌agl-1是一种高毒力的侵染菌株，可高效将外源基因转化进入裂殖壶菌hx-308体内，并且阳性率很高，没有假阳性。
33.(3)本发明使用左右臂分别为1kb和0.5kb同源臂的dna，即可完成neor表达盒的定点整合，整合效率约为4％，本发明使用较短的同源臂即可完成定点整合，在一般的真菌转化中可能需要2-3kb的同源臂，为简化裂殖壶菌的遗传操作奠定了基础。
附图说明
34.图1为重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845的结构图，其中p2845为启动子，t2845为终止子，neor表示g418的抗性基因。
35.图2为裂殖壶菌hx-308转化子基因组dna进行pcr鉴定neor抗性基因的琼脂糖胶图。
36.图3为裂殖壶菌hx-308转化子基因组dna进行pcr验证neor抗性基因定点整合的琼脂糖胶图。
具体实施方式
37.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
38.本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
39.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
40.本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
41.schizochytrium sp.hx-308该菌株的生物量可达134.5g/l，油脂产量可达80.14g/l，有着巨大的商业应用价值。(可参考文献sun xm,ren lj,bi zq,ji xj,zhao qy,huang h.adaptive evolution of microalgae schizochytrium sp.under high salinity stress to alleviate oxidative damage and improve lipid biosynthesis.bioresour technol.2018nov；267:438-444.)
42.农杆菌agl-1为常规的agl-1根癌农杆菌(购自北京兴华越洋生物)农杆菌化质粒是以pzpk为骨架，插入了裂殖壶菌hx-308编号为2845基因的启动子p2845和终止子t2845，在启动子和终止子中间插入g418抗性基因neor，构建出重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845。将构建出的重组质粒转化农杆菌agl-1后，将农杆菌与裂殖壶菌共培养，在诱导剂的作用下，农杆菌可将重组质粒上的neor表达盒转化进入裂殖壶菌，使裂殖壶菌获得对g418的抗性。
43.实施例1
44.一、目标基因的制备
45.根据基因组注释，找到组成型表达基因三磷酸甘油醛脱氢酶，其编号为2845，三磷
酸甘油醛脱氢酶起始密码子上游1kb为启动子p2845(seq id no.2)，终止密码子下游500bp为终止子t2845(seq id no.4)。
46.根据基因组测序获得的序列，设计相应的引物，p2845-f/r和t2845-f/r，序列如表一所示。以裂殖壶菌hx-308基因组为模板，使用上述引物进行pcr扩增，获得相应的启动子p2845和终止子t2845片段。
47.g418抗性基因neor其序列seq id no.3所示，根据neor的序列设计相应引物neor-f/r，以pzpk质粒为模板(sun w，yang x，wang x，et al.homologous gene targeting of a carotenoids biosynthetic gene in rhodosporidium toruloides by agrobacterium-mediated transformation[j].biotechnology letters，2017，39(7)：1001-1007.)，使用该引物对进行pcr扩增，获得相应的g418抗性基因neor的dna片段。上述pcr扩增体系和扩增程序分别如下表1和2所示，pcr后切胶回收电泳验证，扩增得到的启动子p2845，终止子t2845和g418抗性基因neor线性片段，所有引物序列详见表3。
[0048]
表1 pcr扩增体系
[0049]
试剂体积(μl)neor-f/p2845-f/t2845-f2neor-r/p2845-r/t2845-r2基因组1ddh2o202
×
taq master mix25
[0050]
表2 pcr扩增程序
[0051][0052]
表3 引物序列
[0053]
p2845-faattaacgccgaattgaatttttctcgacacttgtctccgp2845-raatccatcttgttcaatcatcttttctctcgcctctcgctt2845-fttcttgacgagttcttctgaaaagtcgcacgcgagcttttt2845-rtgctgcaggtcgactctagacgataaggctaccctagagcneor-fagcgagaggcgagagaaaagatgattgaacaagatggattneor-raaaagctcgcgtgcgacttttcagaagaactcgtcaagaa
[0054]
二、重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845的构建
[0055]
重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845是以pzpk为骨架，插入了裂殖壶菌hx-308编号为2845基因的启动子p2845和终止子t2845，在启动子和终止子中间插入g418抗性基因neor构建出来的。
[0056]
使用核酸内切酶ecori和hindiii对pzpk进行双酶切，胶回收获得线性化的质粒片段，将线性化后的质粒片段和上述扩增出的启动子p2845，终止子t2845和g418抗性基因neor共同孵育后，使用诺唯赞的一步克隆试剂盒ultra one step cloning kit进行一步克隆，构建出重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845。具体反应体系如下表4所示。
[0057]
表4 反应体系
[0058]
试剂体积(μl)p28451neor0.8t28450.5酶切质粒2ddh2o5.72
×
ultra one step cloning mix10
[0059]
反应体系50℃孵育30min，将孵育液转化大肠杆菌感受态(购自深圳康体生命有限公司)，具体操作如下：取-80℃冰箱中保藏的感受态细胞100μl，冰上解冻，取10μl孵育液注入感受态，轻敲管壁混匀，冰浴30min后转入42℃水浴热激90s，然后冰浴3min，加入0.5ml lb液体培养基，220rpm，37℃孵育1h，然后3000rpm离心3min，最后涂布于含有50μg/ml氨苄的lb固体培养基，于37℃培养箱中倒置培养，转化子进行培养后提取质粒得到重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845。
[0060]
实施例2
[0061]
重组农杆菌agl-1的构建
[0062]
将原始农杆菌agl-1划线接种于含有50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的yeb固体平板，28℃培养2天。2天后挑取单克隆接种于5ml含有50μg/ml羧苄青霉素的yeb液体培养基(含牛肉浸膏5g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨5g/l，蔗糖5g/l，mgso
4-7h2o0.5g/l)，28℃，220rpm过夜培养。吸取2ml过夜培养的菌液接种于新的5ml含有50μg/ml羧苄青霉素的yeb液体培养基，28℃，220rpm培养至od
600
＝0.5。取出菌液，冰上冰浴30min后，4℃，5000rpm离心5min收集菌体。用10ml 20mm cacl2重悬，冰浴15min。4℃，5000rpm离心5min再次收集菌体。弃上清液，用2ml 20mm cacl2(含15％甘油)悬浮菌体，每份100μl分装，液氮速冻后于-80℃保存。
[0063]
将保存于-80℃的100μl农杆菌感受态取出，置于冰上10min。加1μg实施例1制备的重组质粒pzpk-p2845-neor-t2845，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。液氮速冻5min，37℃温育5min，立即冰浴2min。加入1ml液体yeb，28℃，150rpm培养3h。8000rpm离心2min收集菌体。去掉上清后用100μl液体yeb重悬菌体并均匀涂布在yeb平板上(含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)，28℃培养3天。挑取转化子用3ml液体yeb(含50μg/ml carb和50μg/ml kan)，28℃，220rpm摇菌过夜，将含有重组质粒的重组农杆菌agl-1菌液保存于－80℃(含15％的甘油)。
[0064]
实施例3
[0065]
重组裂殖壶菌hx-308的构建
[0066]
取-80℃冰箱保存的裂殖壶菌hx-308于gpys(蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖50g/l，海盐20g/l)固体平板上划线活化，挑取单克隆接种于50ml液体种子培养基(味精
20g/l；na2so
4 10g/l；kh2po
4 4g/l；mgso
4 2g/l；(nh4)2so
4 0.8g/l；kcl 0.2g/l；cacl
2 0.1g/l；微量元素(g/l)：na2edta 6g/l；mncl2·
4h2o 0.86g/l；znso
4 0.8g/l；feso
4 0.29g/l；cocl2·
6h2o 0.01g/l；cuso4·
5h2o 0.6g/l；niso4·
6h2o 0.06g/l；na2moo4·
2h2o 0.01g/l)，28℃，170rpm过夜活化，200g，5min离心后去除上清，使用无菌水重悬菌体，将裂殖壶菌hx-308的浓度调制106个/ml。
[0067]
取-80℃冰箱保存的实施例2最后制备的含有重组质粒的重组农杆菌agl-1菌液，于yeb固体平板上划线，2天后挑取单克隆接种于5ml含有50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的yeb液体培养基，28℃，220rpm过夜培养，4000g离心5min获得菌体，将离心获得的菌体接种于5ml im液体培养基(glucose 2g,kh2po4 1.45g,k2hpo4 2.05g nh4no3 0.5g,cacl2 0.01g,mgso4.7h2o 0.6g,nacl 0.3g,z-salts(10ml z-salts包含：znso4.7h2o 0.001g,cuso4.5h2o 0.001g,h3bo4 0.001g,(nh4)2so4 0.5g,mnso4.h2o 0.001g，namoo4.h2o 0.001g)5ml，mes 8.7g,葡萄糖2g，甘油5g，乙酰丁香酮200μm，定容至1l)调整od
600
至0.2，28℃220rpm培养直至od
600
达到0.8。4000g，5min离心后去除上清，使用无菌水重悬，将重组农杆菌的浓度调制107个/ml。
[0068]
分别取100μl上述重组农杆菌菌液和100μl上述裂殖壶菌菌液，混匀后涂布于含200μm乙酰丁香酮的固体im培养基(glucose 2g,kh2po4 1.45g,k2hpo4 2.05g nh4no3 0.5g,cacl2 0.01g,mgso4.7h2o 0.6g,nacl 0.3g,z-salts(10ml z-salts包含：znso4.7h2o 0.001g,cuso4.5h2o 0.001g,h3bo4 0.001g,(nh4)2so4 0.5g,mnso4.h2o 0.001g，namoo4.h2o 0.001g)5ml，mes 8.7g,葡萄糖2g，甘油5g，乙酰丁香酮200μm，琼脂20g定容至1l)，28℃共培养24h。24h后加入2ml无菌水，使用涂布棒将平板上的共培养物全部冲洗下来，吸取0.3ml涂布于含有300μg/ml头孢噻肟钠和500μg/ml g418抗生素的gpys固体培养基进行筛选，28℃培养5天。挑选出筛选平板上生长出的单克隆菌株，提取基因组，使用抗性基因上的相应引物进行pcr验证琼脂糖电泳图，引物为表5中的test1-f和test1-r。
[0069]
表5 验证引物序列
[0070]
test1-ftgaacaagatggattgcacgtest1-rtaccgtaaagcacgaggaagtest2-ftacgtcatgtttgaggtcctest2-rccagcaagagttgccatgc
[0071]
上述pcr反应中所用pcr酶为takara的primestar maxdna聚合酶。上述pcr扩增体系如下：
[0072]
试剂使用量终浓度primestar max(2
×
)25ul1
×
primer 110-15pmol0.2-0.3umprimer 210-15pmol0.2-0.3umtemplate＜200ng 灭菌蒸馏水up to 50ul [0073]
上述pcr的程序如下：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复35个循环。
[0074]
在本次转化中，成功获得了53个转化子，图2为其中两个转化子体内抗性基因neor
的pcr验证琼脂糖电泳图，泳道1和2为转化子，有约800bp大小明亮的dna条带，泳道wt为野生型裂殖壶菌hx-308阴性对照，无条带，说明neor抗性基因成功整合进入了两个转化子的基因组，证明转化成功。
[0075]
由于neor使用的是启动子p2845和终止子t2845，启动子的长度为1000bp，终止子的长度为500bp，它们属于同一个基因的上下游，形成了一个天然的同源重组敲除片段。基因2845的长度约为1000bp，neor抗性基因长度约为800bp，使用同源臂外围引物对上述53个转化子的基因组进行pcr验证，引物为表5中的test2-f和test2-r，发现有两株转化子的dna电泳条带比野生型裂殖壶菌hx-308大(图3)，泳道1和2为转化子，有约2300bp大小的dna条带，泳道wt为野生型，有约2500bp大小明亮的dna条带，说明neor抗性基因成功整合到了转化子的2845基因位点，发生了定点整合，整合效率约为4％。本实施例说明本发明的方法不仅成功转化，而且发生了意想不到的定点整合，即特定基因的敲除，本发明的定点整合说明本发明的方法可以直接使用同源重组进行基因敲除，而不需要再开发crispr系统，效果十分突出。目前在真菌体内的同源重组来看，本发明的方法不需要crispr系统辅助的情况下可以达到4％较高整合效率，而很多真菌只通过同源重组是无法进行基因敲除。
[0076]
此外，本发明后续每次转化进行验证前都会在平板上至少传代3次，每次传代后均进行验证，均可扩增出抗性基因，并且阳性率很高，没有假阳性，说明本发明的方法在后续的传代过程中保持稳定不丢失。