一种具有降生物胺作用的菌株及用途的制作方法

1.本发明涉及食品微生物技术领域，特别是一种具有降生物胺作用的菌株及用途。


背景技术：

2.东北传统发酵酸菜是以白菜为原料经传统自然发酵的方法腌制而成，是东北地区的一种日常食用的特色美食，具有悠久历史。酸菜中不仅含有较多的有机酸，食用后可以促进唾液和胃酸的分泌，促进消化；而且含有丰富的乳酸菌资源，乳酸菌可在肠胃中存活，抑制有害菌群增殖。
3.生物胺是一类具有生物活性、含氨基的低分子量有机化合物，常存在于动植物体内及食品中。大多数食品尤其是发酵食品中都含有生物胺，不同种类食品或同类产品不同样品中的生物胺种类和含量有所不同，且受环境及发酵过程等多种因素影响。研究表明，机体自身合成的生物胺即可满足基本生理功能需求，人体中的生物胺会通过机体不断的生物合成和代谢分解，在细胞和组织中维持人体所需的正常浓度。而外源的过量摄入则会打破这种平衡，对人体产生不良反应，造成神经系统及心血管系统的损伤，主要症状有血压升高、呕吐、腹泻等。因此，降低发酵食品中的生物胺含量尤为重要。目前市场上控制生物胺的方法一般为使用食品添加剂、低温保藏和超高压处理，这些方法虽能控制食品中的生物胺含量，但不能降解已产生的生物胺，且会影响食品的质量和风味。一种新的降解食品中生物胺的方法有待于开发。最好的方法是通过微生物降解生物胺，利用微生物发酵剂来控制发酵食品中的生物胺含量具有高效安全、成本低等特点。


技术实现要素：

4.本发明的目的是要提供一种具有降生物胺作用的菌株及用途。
5.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
6.本发明的第一个目的是要提供一种具有降生物胺作用的菌株，该菌株为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)sc
‑
5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.22102，保藏日期为2021年3月31日。
7.本发明的第二个目的是要提供一种具有降生物胺作用的菌株的应用，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)sc
‑
5用于制备具有降生物胺作用的生物制剂。
8.优选地，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)sc
‑
5用于制备具有降解生物胺含量作用的发酵剂。
9.与现有技术相比，本发明的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)sc
‑
5具有较强的降解生物胺功能，对亚精胺的降解率达到了78.63％，对腐胺的降解率达到了56.1％，对尸胺的降解率达到了70.6％；本发明的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)sc
‑
5可以用于制备生物制剂如发酵剂，从而降低发酵食品中的生物胺。
附图说明
10.图1为本发明的植物乳杆菌sc
‑
5的菌落形态图。
11.图2植物乳杆菌sc
‑
5革兰氏染色的菌体形态图。
12.图3为各组酸菜样品中亚精胺的浓度。
13.图4为各组酸菜样品中腐胺的浓度。
14.图5为各组酸菜样品中尸胺的浓度。
具体实施方式
15.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
16.本实施例中的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)sc
‑
5来源于东北传统发酵酸菜样品中的筛选，最终筛选出一株对生物胺降解作用最强的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)sc
‑
5，具体筛选过程为：
17.用无菌生理盐水对酸菜样品进行十倍梯度稀释(10
‑5～10
‑8)，涂布于分离培养基(含2％碳酸钙)平板上，放于37℃培养箱中培养48h，挑选溶钙圈大的单菌落，接种于mrs液体培养基中，37℃摇床培养24h。分别在mrs固体培养基上多次划线分离纯化。将分离得到的乳酸菌菌悬液以1％(v/v)的接种量接种于的含亚精胺、腐胺、尸胺各500μg/ml的mrs培养基中，37℃培养箱下培养48h。测定菌液中生物胺含量，并以未接入乳酸菌的培养基为对照，得到生物胺降解率最高的菌株sc
‑
5。
18.将筛选得到的供试菌株sc
‑
5接种到mrs肉汤培养基中，活化两代，进行平板划线和革兰氏染色镜检。结果表明菌株为纯种，且菌体呈紫色，为革兰氏阴性菌(g
‑
)。将供试菌株sc
‑
5活化两代过夜培养后，按照ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒说明书在无菌条件下进行基因组dna的提取，用25μl反应体系对其16s rdna进行pcr扩增。反应完成后，使用1％琼脂糖进行凝胶电泳，在150v、100ma的条件下进行，电泳完成后，使用凝胶成像仪对凝胶进行观察。pcr产物电泳条件切割所需dna目的条带，pcr产物以7f 1540r、27f1492r为引物进行dna测序，引物序列如表1。
19.表1
[0020][0021]
琼脂糖凝胶电泳得到的pcr产物条带清晰，大小符合16s rdna片段的特征，可以对目的片段进行回收测序。采用16s rdna通用引用扩增菌株sc
‑
5的16s rdna序列，结果为：
[0022]
atcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcggcgataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagtttgaaagatggcttc
ggctatcacttttggatggtcccccggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagacgacagtggaactccatgtgtagccgtgaaatgcgtacatatatggaagaacaccagtcccgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgcgcactctggtgagactgccggtgacaaacccgaggaaggtgccgatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgcgctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccccgccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaaggtgggacagatgattagggtgaagtcgtaacaa；使用ncbi数据库中的blast软件将供试菌株sc
‑
5的16s rdna和gen bank数据库中已知的16s rdna基因序列进行比对，发现纯化得到的供试菌株sc
‑
5为植物乳杆菌，且菌株的16s rdna序列与登录号cp026743.1、cp025590.1等植物乳杆菌的相似性为100％。因此，从形态学和分子生物学鉴定结合判断，供试菌株sc
‑
5属于植物乳杆菌菌种，因此，命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)sc
‑
5。
[0023]
本发明的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)sc
‑
5可以用于制备生物制剂，本实施例以制备发酵剂为例，从而降低发酵食品中的生物胺，为了验证其降低发酵食品中的生物胺的效果，进行如下实验：
[0024]
1.发酵剂的制备
[0025]
在mrs液体培养基中将植物乳杆菌sc
‑
5活化三代，接种于液体mrs培养基中括大培养，用无菌生理盐水洗涤三次，调制成做成供试菌液，备用。
[0026]
2.酸菜的制备
[0027]
挑选优质大白菜，在室外晾晒3～4d，去除一定水分，又起到杀菌的作用。将白菜去根、去掉黄叶，清洗干净后放入酸菜坛中，每坛放4kg。试验分为两组：自然发酵(不接菌)和发酵剂发酵(接入109cfu/ml的植物乳杆菌sc
‑
5)，每组设置三个盐浓度梯度：1.5％、2.0％、2.5％，每种设三个平行样。分别于发酵第3d、7d、15d、30d、45d、60d取样，保藏于4℃冰箱待测。
[0028]
3.hplc法测定酸菜中生物胺含量
[0029]
3.1生物胺标准溶液的配置
[0030]
用分析天平准确称取亚精胺、腐胺、尸胺标准品各50mg，用0.1mol/l hcl溶液分别定容至500ml，制成浓度为100μg/ml标准溶液，4℃备用。分别移取0.025ml、0.10ml、0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.5ml、2.5ml、5.00ml于10ml离心管中，用0.1mol/l hcl溶液定容，得到浓度
为0.25μg/l、1.00μg/l、2.50μg/l、5.00μg/l、10.00μg/l、15.00μg/l、25.00μg/l、50.00μg/l的标准溶液。
[0031]
3.2衍生化及处理
[0032]
移取1.00ml生物胺标准溶液与10ml离心管，加入1.5ml ph为11的缓冲液(2mol/l naoh)、1.00ml dns
‑
cl溶液(20mg/ml，取200mg丹磺酰氯溶解于20ml丙酮)，加入nacl至饱和，在40℃下水浴暗反应45min～1h，加入0.2ml脯氨酸后静置0.5h，40℃下氮气吹干丙酮，加入1ml乙腈，过0.22μm滤膜后装载到高效液相色谱柱上进行测定。
[0033]
3.3色谱条件
[0034]
色谱柱为agilent xdb
‑
c18(250min x4.6mm，5μm)，流动相a为超纯水，流动相b为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见下表。流速为0.8ml/min，紫外检测波长为254nm，进样量20μl，梯度洗脱程序如表2所示。
[0035]
表2
[0036]
时间/min0.01110152530a/％353520101035b/％656580909065
[0037]
3.4标准曲线的绘制
[0038]
取标准溶液采用3.2方法衍生，8种不同浓度标准溶液重复测定3次。将三种生物胺以生物胺浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线如表3所示。
[0039]
表3
[0040]
生物胺线性回归方程亚精胺y＝15608x
‑
56680.66腐胺y＝10061.4x
‑
2249尸胺y＝5660.31x
‑
3994.18
[0041]
3.5样品中生物胺含量的测定
[0042]
将酸菜样品装入密封口袋，放入真空冷冻干燥24h，取出粉碎成粉末，称取1g样品于0.1mol/l hcl溶液中，震荡10～20min。8000r/min，4℃离心2min，收集上清液，沉淀部分按上述方法重新提取一次，合并两次上清液，用蒸馏水将收集的上清液稀释至50ml。取上清液1ml按3.2方法进行处理，最后装载到高效液相色谱柱上进行测定。
[0043]
hplc检测结果如图3、图4、图5所示，由图3、图4、图5可知：植物乳杆菌sc
‑
5对三种生物胺均有较高的降解能力，是较理想的高效降解生物胺的菌株。
[0044]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。