即用型单个核细胞分离处理试剂盒的制作方法

1.本实用新型属于医学临床检验及细胞培养器械技术领域，尤其涉及一种即用型单个核细胞分离处理试剂盒。


背景技术：

2.脐血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，脐血中不仅含有丰富的造血干细胞、间充质干细胞，还含有丰富的免疫细胞，如t细胞、nk细胞、树突状细胞等。最新研究发现：相对外周血液和骨髓中，nk细胞和nk祖细胞在脐带血中更为丰富。脐血来源丰富、采集方便，容易获得，对产妇及胎儿无任何痛苦和不良作用。与成人外周血、骨髓相比，脐血含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞，且更为原始，具有更强的分化能力。脐血免疫系统相对不成熟，脐血中含有丰富的抑止性t细胞，自然杀伤细胞活性较弱，移植后受体的排斥反应发生率和严重程度较骨髓低。脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的几率低。收集的脐血不仅可做异基因移植的供体，而且还可将之低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。脐带血中含有丰富的造血干细胞，已成为干细胞移植治疗的重要资源。
3.目前，研究人员对脐带血干细胞的生物学和免疫学特性已经部分了解，并建立了多种脐带血干细胞分离纯化培养扩增的方法，临床应用已在多系统疾病治疗中取得效果，研究说明今后在细胞工程和组织工程的应用中脐带血将有更广阔的前景。
4.但是，目前脐带血pbmc提取存在以下问题：
5.(1)温度环境问题，现有脐血分离方案大多为常温状态下分离，不利于脐血pbmc的细胞生物活性保持。因为脐血细胞群体与外周血细胞群相比成熟相对较低，在分离脐血pbmc过程中保持相对恒定的体内温度，能最大程度保留脐血pbmc的细胞生物活性，有利于脐血细胞在培养过程中的诱导和增殖及确保体外诊断的准确性。
6.(2)由于脐血细胞成熟程度与外周血相比会有较大差异，因此脐血pbmc与外周血pbmc在细胞大小、形态、密度、各细胞占比都会有一定的差异，所以使用普通离心管加外周血分离方法分离脐血效率不高且幼嫩的红细胞会大量残留pbmc层，吸取样本时干扰过大，在脐血细胞培养过程中对诱导和增殖造成一定影响。
7.(3)大量幼嫩的脐血红细胞残留会造成分离效率低，增加脐血样本使用量。
8.(4)现有脐血分离方法操作频繁，且时间过长影响细胞活性剂培养效果，增加污染风险。


技术实现要素：

9.本实用新型所要解决的技术问题是提供一种即用型单个核细胞分离处理试剂盒，结构简单、使用安全方便，能够节约样本用量，实现高效分离。
10.为解决上述技术问题，本实用新型所采取的技术方案是：
11.一种即用型单个核细胞分离处理试剂盒，包括用于安装三根分离管的恒温分离
箱，所述恒温分离箱的顶部设有三个用于安装三根分离管的样品槽，三根分离管分别为血浆采集管、血沉管及分离管，所述血沉管内盛有红细胞沉降液，所述分离管内盛有淋巴细胞分离液，所述血浆采集管、血沉管及分离管分别用于分离血浆、沉降红细胞及分离pbmc。
12.优选的，所述恒温分离箱的底部设有加热模块，所述样品槽的四周环绕导热模块。
13.优选的，所述恒温分离箱的顶部样品槽前后对应设有三个观察窗。
14.优选的，所述血浆采集管内设有血液加样管和血浆收集管，所述血液加样管及血浆收集管均贯穿血浆采集管的管盖设置，所述血液加样管及血浆收集管的顶部内孔均设有露于管盖外部的管塞，所述血浆收集管的上部为伸缩结构、且其顶部设有调节旋钮，用于调节血浆收集管的长度。
15.优选的，所述血沉管内设有第一加样管和第一收集管，所述第一加样管和第一收集管均贯穿血沉管的管盖设置，所述第一加样管和第一收集管的顶部内孔均设有露于管盖外部的管塞；所述第一收集管的上部为伸缩结构、且其顶部设有调节旋钮，用于调节第一收集管的长度。
16.优选的，所述分离管内设有第二加样管、第二收集管及分离板，所述分离板包括调节臂及其下端的两块过滤板，两块过滤板设置于分离管内；所述第二加样管、第二收集管及调节臂均贯穿分离管的管盖设置，所述第二加样管和第二收集管的顶部内孔均设有露于管盖外部的管塞；所述第二收集管及调节臂的上部为伸缩结构、且其顶部均设有调节旋钮，用于调节第二收集管及调节臂的长度
17.优选的，所述过滤板呈半椭圆状，两块过滤板的弧形相背设置在挡板上，其中一块过滤板的上端设置在调节臂的下端，且两块过滤板间的最小间隙为0.1cm。
18.优选的，所述血浆采集管、血沉管及分离管内均为无菌密封包装。
19.优选的，所述血浆采集管、血沉管及分离管的管底均为上大下小的圆锥体。
20.优选的，所述恒温分离箱呈方体状，尺寸为：长15.0cm、宽4.5cm、高7.5cm；所述样品槽的内孔直径为3.0cm、深度为7.5cm；所述血浆采集管、血沉管及分离管的长度均为11.5cm、直径为2.9cm；所述血浆采集管、血沉管及分离管的管盖的直径均为3.3cm、高1.3cm；所述血沉管内的红细胞沉降液及分离管内的淋巴细胞分离液均为20ml。
21.采用上述技术方案所产生的有益效果在于：与现有技术相比，本实用新型利用恒温分离箱来保证三根分离管在恒温条件下对脐血进行单个核细胞分离，能够减少环境温度变化对细胞活性功能的影响，为后需细胞培养及检测提供有效保障；利用血浆采集管、血沉管及分离管来分离血浆、沉降红细胞及分离pbmc；血沉管及分离管内预先密封相应的分离液，能够实现高效分离脐血细胞，避免污染，节约脐血用量，提高细胞收获率，有效减少了大量红细胞干扰。
附图说明
22.下面结合附图和具体实施方式对本实用新型作进一步详细的说明。
23.图1是本实用新型实施例提供的一种即用型单个核细胞分离处理试剂盒的结构示意图；
24.图2是图1中分离板的结构示意图；
25.图中：1-恒温分离箱；2-血浆采集管，21-血液加样管，22-血浆收集管；3-血沉管，
31-第一取样管，32-第一收集管；4-分离管，41-第二取样管，42-第二收集管，43-分离板，431-调节臂，432-过滤板,433-挡板；5-调节旋钮；6-管盖。
具体实施方式
26.下面结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
27.参见图1，本实用新型提供的一种即用型单个核细胞分离处理试剂盒，包括用于安装三根分离管的恒温分离箱1，所述恒温分离箱1的顶部设有三个用于安装三根分离管的样品槽，三根分离管分别为血浆采集管2、血沉管3及分离管4，所述血沉管3内盛有红细胞沉降液，所述分离管4内盛有淋巴细胞分离液，所述血浆采集管2、血沉管3及分离管4，分别用于分离血浆、沉降红细胞及分离pbmc。其中，所述血浆采集管2、血沉管3及分离管4内均为无菌密封包装，在血沉管及分离管内预先密封相应的分离液，能够实现高效分离脐血细胞，避免污染，节约脐血用量，提高细胞收获率，有效减少了大量红细胞干扰。
28.作为一种优选结构，所述恒温分离箱1的底部设有加热模块(图中未画出)，所述样品槽的四周环绕导热模块(图中未画出)，可将恒温分离箱内部温度控制在37℃，用于模拟人体内的恒温环境。在37℃恒温环境下进行脐血单个核细胞分离，以减少环境温度变化对细胞活性功能的影响，为后需细胞培养及检测提供有效保障。另外，为了方便观察三个分离管内的分离情况，在恒温分离箱的顶部样品槽前后对应设有三个观察窗(图中未画出)。
29.在本实用新型的一个具体实施例中，如图1所示，所述血浆采集管2内设有血液加样管21和血浆收集管22，所述血液加样管21及血浆收集管22均贯穿血浆采集管2的管盖6设置，所述血液加样管21及血浆收集管22的顶部内孔均设有露于管盖6外部的管塞，用于穿刺加样与取样；所述血浆收集管22的上部为伸缩结构、且其顶部设有调节旋钮5，用于调节血浆收集管22的长度，进而调整血浆收集管的取样位置。
30.在本实用新型的一个具体实施例中，如图1所示，所述血沉管3内设有第一加样管31和第一收集管32，所述第一加样管31和第一收集管32均贯穿血沉管3的管盖6设置，所述第一加样管31和第一收集管32的顶部内孔均设有露于管盖外部的管塞；所述第一收集管32的上部为伸缩结构、且其顶部设有调节旋钮5，用于调节第一收集管32的长度。
31.在本实用新型的一个具体实施例中，如图1、2所示，所述分离管4内设有第二加样管41、第二收集管42及分离板43，所述分离板43包括调节臂431及其下端的两块过滤板432，两块过滤板432设置于分离管4内；所述第二加样管41、第二收集管42及调节臂431均贯穿分离管4的管盖6设置，所述第二加样管41和第二收集管42的顶部内孔均设有露于管盖6外部的管塞；所述第二收集管42及调节臂431的上部为伸缩结构、且其顶部均设有调节旋钮5，用于调节第二收集管4及调节臂431的长度。其中，过滤板432呈半椭圆状，两块过滤板432的弧形相背设置在挡板433上，其中一块过滤板432的上端设置在调节臂431的下端，且两块过滤板432间的最小间隙为0.1cm。
32.具体制作时，所述血浆采集管2、血沉管3及分离管4的管底均为上大下小的圆锥体，便于细胞富集。其中，所述恒温分离箱1呈方体状，尺寸为：长15.0cm、宽4.5cm、高7.5cm；
所述样品槽的内孔直径为3.0cm、深度为7.5cm，三个样品槽的内孔间距为1.0cm。
33.三根分离管的具体尺寸如下：血浆采集管2、血沉管3及分离管4的长度均为11.5cm、直径为2.9cm；所述血浆采集管2、血沉管3及分离管4的管盖6的直径均为3.3cm、高1.3cm。其中，血浆采集管2的血液加样管21长12cm、直径0.5cm，血浆收集管22长10cm,直径0.5cm；血沉管3的第一加样管31长12cm、直径0.5cm，第一收集管32长10cm、直径0.5cm；分离管4的第二加样管41长6cm、直径0.5cm，第二收集管42长10cm、直径0.5cm。
34.另外，在制作血浆收集管2、第一收集管32级第二收集管42时，上部可采用伸缩管，调节旋转通过与之螺纹配合的丝杆驱动下部管体升降。具体操作时，通过调节旋转5调节血浆收集管2、第一收集管32级第二收集管42的长度最长可达10cm。
35.同时，所述血沉管3内的红细胞沉降液及分离管4内的淋巴细胞分离液均为20ml。其中，红细胞沉降液的主要成分为明胶及球蛋白(0.1％)；ph:7.0-7.5,渗透压：280-340；淋巴细胞分离液的主要成分为ficoll分离液。另外，血浆采集管2不含有液体，其可承载血液体积为5-50cm。
36.本实用新型的具体使用方法如下：
37.1、分离血浆：
38.1.1使用50ml注射器抽取脐血(体积＜50ml)往血液加样管中缓慢注入脐血至血浆采集管中，室温500xg条件下离心时间为10min；
39.1.2待离心结束后可明显分为两层，上层为血浆层，下层为脐血细胞层。
40.1.3旋动血浆收集管旋钮至适宜取样长度，使用50ml注射器，取出血浆层至新的离心管中(血浆层可进行灭活处理，用作细胞营养添加剂)。
41.2、沉降红细胞：
42.2.1使用50ml注射器通过血浆收集管的血液加样管抽取余下成分，记为a液。
43.2.2将抽取的a液通过血沉管的第一加样管缓慢添加至血沉管中，轻轻振荡摇匀，室温100xg条件下离心10min；
44.2.3待离心结束后可明显分为两层，上层为pbmc层，下层为红细胞层。
45.分离pbmc：
46.3.1使用50ml注射器从第一收集管中取血沉管内的上清层,倾斜缓慢往高效分离管的第二加样管中添加至淋巴细胞分离液上方，室温800xg条件下离心时间为20min。
47.3.2待离心结束后明显可分为四层,第二层为白膜层。
48.制备pbmc：
49.4.1旋动高效分离板旋钮可调节脐血pbmc层至挡板上部，再旋动第二收集管旋钮到适宜的取样位置；
50.4.2使用10ml注射器取离心后高效分离管内的中间(乳白色)pbmc细胞层，即为pbmc细胞。
51.在上面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本实用新型，但是本实用新型还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本实用新型内涵的情况下做类似推广，因此本实用新型不受上面公开的具体实施例的限制。