凝血因子XI(FXI)结合蛋白的制作方法

凝血因子xi(fxi)结合蛋白
技术领域
1.本发明涉及医药生物领域，公开了针对凝血因子xi(fxi)的单域抗体及其衍生蛋白。具体而言，本发明公开了一种衍生自针对凝血因子xi(fxi)的单域抗体的凝血因子xi(fxi)结合蛋白及其用途。
2.发明背景
3.凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。它们部分由肝生成。可以为香豆素所抑制。为统一命名，世界卫生组织按其被发现的先后次序用罗马数字编号，有凝血因子i、ii、iii、iv、v、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii等。
4.凝血因子xi(fxi)是由相同的80kda亚单位构成的二聚体，且各亚单位由n端开始由四个apple结构域(a1、a2、a3和a4)和催化结构域组成。fxi是与高分子量激肽原(hk)复合循环的酶原。hk结合fxi中的a2结构域并且是用于fxi至fxia的fxiia活化的生理辅因子。fxi中的剩余apple结构域还介导重要生理功能。例如，fix结合外位点定位于a3中，然而fxiia结合位点在a4中。对于fxi二聚化关键的残基还定位于a4中。
5.研究已表明fxi在血栓形成的病理性过程中起关键作用，对于止血的贡献相对较少，且因此是血栓的有前景的目标。在ionis pharmaceuticals inc.fxi反义寡核苷酸(aso)ii期试验中(buller等人,n engl j med 2015,372:232-240)，在经历全膝关节造形术的患者中，与依诺肝素相比，fxi aso在出血较少的趋势下导致静脉血栓栓塞(vte)的显著减轻。人类遗传学和流行病研究(duga等人,semin thromb hemost 2013；chen等人,drug discov today 2014；key,hematology am soc hematol educ program 2014,2014:66-70)指示重度fxi缺乏(血友病c)使缺血性中风和深层静脉栓塞的风险降低；相反，fxi水平增加与vte和缺血性中风的较高风险相关。此外，多项临床前研究表明fxia抑制或功能丧失介导血栓保护，而不会损害止血(chen等人,drug discov today 2014)。值得注意的是，在狒狒av支路血栓形成模型中，单克隆抗体14e11和1a6产生了显著的血栓减轻(美国专利号8,388,959；tucker等人,blood 2009,113:936-944；cheng等人,blood 2010,116:3981-3989)。此外，14e11(在其与小鼠fxi交叉反应)在小鼠急性缺血性中风的实验模型中提供保护(leung等人,transl stroke res 2012,3:381-389)。也已报导临床前模型中的另外的靶向fxi的mab研究，其确认fxi作为抗血栓靶标，其具有微小出血风险(van montfoort等人,thromb haemost 2013,110；takahashi等人,thromb res 2010,125:464-470；van montfoort,ph.d.thesis,university of amsterdam,amsterdam,netherlands,2014年11月14日)。抑制fxi因此是新型抗血栓治疗的有前景的策略，与当前标准抗凝血剂相比具有改善的益处-风险比。
6.附图简述
7.图1.示出fxi单域抗体fc融合蛋白对fxi的阻断活性(atpp检测)。
8.图2.示出人源化fxi单域抗体fc融合蛋白对fxi的阻断活性(atpp检测)。
9.图3.示出hufe双特异性抗体fc融合蛋白对人fxi活性的抑制效果。
10.图4.示出hufe双特异性抗体fc融合蛋白对人全血浆的aptt的抑制活性。
11.图5.示出hufe双特异性抗体fc融合蛋白对猴全血浆的aptt的抑制活性。
12.图6.示出hufe双特异性抗体fc融合蛋白对兔全血浆的aptt的抑制活性。
13.图7.示出fxi单域抗体fc融合蛋白以及双特异性抗体对兔子静脉血栓的影响。
具体实施方式
14.定义
15.除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如sambrook等人,“molecular cloning:a laboratory manual”(第2版),第1-3卷,cold spring harbor laboratory press(1989)；lewin,“genes iv”，oxford university press,new york,(1990)；及roitt等人,“immunology”(第2版),gower medical publishing,london,new york(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
16.除非另有说明，否则可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如vhh结构域或vh/vl结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“vhh序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
17.如本文所用，术语(多肽或蛋白的)“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
18.如本文所用的术语“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征。
19.如本文所用的术语“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“fr1”、“框架区2”或“fr2”、“框架区3”或“fr3”、及“框架区4”或“fr4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“cdr1”、“互补决定区2”或“cdr2”、及“互补决定区3”或“cdr3”的三个“互补决定区”或“cdr”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
20.如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变结构域”是指能够在不与其他免疫球蛋白可变结构域配对的情况下特异性结合抗原表位的免疫球蛋白可变结构域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变结构域的一个实例为“结构域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变结构域vh及vl(vh结构域及vl结构域)。免疫球蛋白单一可变结构域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“vhh结构域”(或简称为“vhh”)。
[0021]“vhh结构域”，亦称为重链单域抗体、vhh、vhh结构域、vhh抗体片段和vhh抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(hamers-casterman c,atarhouch t,muyldermans s,robinson g,hamers c,songa eb,bendahman n,hamers r.:“naturally occurring antibodies devoid of light chains”；nature 363,446-448(1993))。使用术语“vhh结构域”以将所述可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(其在本文中称为“vh结构域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(其在本文中称为“vl结构域”)进行区分。vhh结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规4链抗体中的vh或vl结构域相反，在该情况下表位由vl结构域与vh结构域一起识别)。vhh结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
[0022]
在本发明的上下文中，术语“重链单域抗体”、“vhh结构域”、“vhh”、“vhh结构域”、“vhh抗体片段”、以及“vhh抗体”可互换使用。
[0023]
例如riechmann及muyldermans,j.immunol.methods 231,25-38(1999)的图2中所示，对于骆驼科的vhh结构域所应用的氨基酸残基，可以根据kabat等人给出的vh结构域的一般编号法来编号(kabat et al.,sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))。
[0024]
本领域中已知对vh结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，所述替代方法还可以类似地应用于vhh结构域。例如，chothia cdr指的是结构环的位置(chothia and lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))。abm cdr代表的是kabat超变区和chothia结构环的折中，并且在oxford molecular's abm抗体建模软件中使用。“接触(contact)”cdr则基于对可获得的复合物晶体结构的分析。来自每种方法的cdr的残基描述如下：
[0025][0025][0026]
抗体的cdr还可以是imgt-cdr，这是一种基于imgt抗体编码的cdr定义方式，该编码通过综合超过5000个序列的结构信息后获得。在imgt的vh cdr编码中，cdr1：27-38；cdr2：56-65；cdr3：105-117。
[0027]
然而应注意，如本领域中对于vh结构域及vhh结构域所公知的，各cdr中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据kabat的编号可能对应或可能不
对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
[0028]
例如，cdr可以包括“扩展的(extended)cdr”，例如：在vl中的24-36或24-34(lcdr1)，46-56或50-56(lcdr2)以及89-97或89-96(lcdr3)；在vh中的26-35(hcdr1)，50-65或49-65(hcdr2)以及93-102、94-102或95-102(hcdr3)。
[0029]
vhh结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。
[0030]
vhh结构域及含有其的多肽的其他结构特性及功能性质可总结如下：
[0031]
vhh结构域(其已经天然“设计”以在不存在轻链可变结构域且不与轻链可变结构域相互作用的情况下与抗原功能性结合)可用作单一且相对较小的功能性抗原结合结构单元、结构域或多肽。此区分vhh结构域与常规4链抗体的vh及vl结构域，这些vh及vl结构域自身通常不适于作为单一抗原结合蛋白或免疫球蛋白单一可变结构域进行实际应用，但需要以某种形式或另一形式组合以提供功能性抗原结合单元(如以诸如fab片段等常规抗体片段的形式；或以由与vl结构域共价连接的vh结构域组成的scfv的形式)。
[0032]
由于这些独特性质，使用vhh结构域—单独或作为较大多肽的一部分—提供许多优于使用常规vh及vl结构域、scfv或常规抗体片段(例如fab-或f(ab’)2-片段)的显著优势：仅需要单一结构域以高亲和力及高选择性结合抗原，从而使得既不需要存在两个单独结构域，也不需要确保该两个结构域以适当空间构象及构型存在(例如scfv一般需要使用经特别设计的接头)；vhh结构域可自单一基因表达且不需要翻译后折叠或修饰；vhh结构域可容易地改造成多价及多特异性格式(格式化)；vhh结构域高度可溶且无聚集趋势；vhh结构域对热、ph、蛋白酶及其他变性剂或条件高度稳定，且因此可在制备、储存或运输中不使用冷冻设备，从而达成节约成本、时间及环境；vhh结构域易于制备且相对廉价，甚至在生产所需的规模上亦如此；vhh结构域与常规4链抗体及其抗原结合片段相比相对较小(大约15kda或大小为常规igg的1/10)，因此相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，显示较高的组织渗透性且可以较高剂量给药；vhh结构域可显示所谓腔结合性质(尤其由于与常规vh结构域相比其延长的cdr3环)，从而可到达常规4链抗体及其抗原结合片段不可到达的靶及表位。
[0033]
获得结合特定抗原或表位的vhh的方法，先前已公开于以下文献中：r.van der linden et al.,journal of immunological methods,240(2000)185
–
195；li et al.,j biol chem.,287(2012)13713
–
13721；deffar et al.,african journal of biotechnology vol.8(12),pp.2645-2652,17june,2009和wo94/04678。
[0034]
源自骆驼科的vhh结构域可通过以人常规4链抗体vh结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始vhh序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而经“人源化”(本文中亦称为“序列优化”，除人源化外，“序列优化”也可涵盖通过提供vhh改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化vhh结构域可含有一个或多个完全人框架区序列。人源化可以使用蛋白表面氨基酸人源化(resurfacing)的方法和/或人源化通用框架cdr移植法(cdr grafting to a universal framework)完成，例如，如实施例中所示例。
[0035]
如本文所用，术语“表位”或可互换使用的术语“抗原决定簇”指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基
酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性”表位或“构象”表位。参见，例如，epitope mapping protocols in methods in molecular biology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
[0036]
可使用本领域中熟知的许多表位定位技术鉴别给定抗原的表位。参见例如epitope mapping protocols in methods in molecular biology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。举例而言，线性表位可通过例如以下方法来确定：在固体支持物上同时合成大量肽，其中这些肽对应于蛋白质分子的各部分，且使这些肽在仍然与支持物连接的情况下与抗体反应。这些技术在本领域中为已知的且描述于例如美国专利第4,708,871号；geysen等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa 81:3998-4002；geysen等人(1986)molec.immunol.23:709-715中。类似地，构象表位可通过诸如通过例如x射线结晶学及2维核磁共振确定氨基酸的空间构形加以鉴别。参见例如epitope mapping protocols(同上)。
[0037]
可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请wo03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的抗体分子竞争结合fxi上的相同表位的抗体及其抗原结合片段。
[0038]
一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变结构域)可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合蛋白的亲和力和/或亲合力确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(kd)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：kd值越小，表位与抗原结合蛋白之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为缔合常数(ka)，其为1/kd)。如本领域技术人员将了解，取决于具体感兴趣的抗原，可以以已知方式测定亲和力。亲合力为抗原结合蛋白(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变结构域或含有其的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与以下两者有关：与其抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合蛋白上的相关结合位点的数目。
[0039]
如本文所用，术语“凝血因子xi(fxi)结合蛋白”意指任何能够特异性结合凝血因子xi(fxi)的蛋白。fxi结合蛋白可以包括针对fxi的如本文定义的抗体。fxi结合蛋白还涵盖免疫球蛋白超家族抗体(igsf)或cdr移植分子。
[0040]
本发明的“fxi结合蛋白”可以包含至少一个结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域如vhh。在一些实施方案中，本发明的“fxi结合分子”可以包含2、3、4或更多个结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域如vhh。本发明的fxi结合蛋白除结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如peg)和/或fc区。在一些实施方案中，本发明的“fxi结合蛋白”还涵盖双特异性抗体，其含有结合不同抗原或相同抗原不同区域(如不同表位)的免疫球蛋白单一可变结构域。
[0041]
通常，本发明的fxi结合蛋白将以如于biacore或kinexa或fortibio测定中测量的优选10-7
至10-10
摩尔/升(m)、更优选10-8
至10-10
摩尔/升、甚至更优选10-9
至10-10
或更低的解离常数(kd)，和/或以至少107m-1
、优选至少108m-1
、更优选至少109m-1
，更优选至少10
10
m-1
的缔合常数(ka)结合所要结合的抗原(即fxi)。任何大于10-4
m的kd值一般都视为指示非特异性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的表面等离子体共振术(spr)测定、scatchard测定和/或竞争性结合测定(例如放射免疫测定(ria)、酶免疫测定(eia)及夹心式竞争性测定。
[0042]
氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸编码加以表示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与另一序列相比，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、pro及gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：asp、asn、glu及gln；(iii)极性带正电残基：his、arg及lys；(iv)较大脂族非极性残基：met、leu、ile、val及cys；及(v)芳族残基：phe、tyr及trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：ala被gly或ser取代；arg被lys取代；asn被gln或his取代；asp被glu取代；cys被ser取代；gln被asn取代；glu被asp取代；gly被ala或pro取代；his被asn或gln取代；ile被leu或val取代；leu被ile或val取代；lys被arg、gln或glu取代；met被leu、tyr或ile取代；phe被met、leu或tyr取代；ser被thr取代；thr被ser取代；trp被tyr取代；tyr被trp或phe取代；val被ile或leu取代。
[0043]
两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用ncbi数据库的blast程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：computational molecular biology,lesk,a.m.,ed.,oxford university press,new york,1988；biocomputing:informatics and genome projects,smith,d.w.,ed.,academic press,new york,1993；computer analysis of sequence data,part i,griffin,a.m.,and griffin,h.g.,eds.,humana press,new jersey,1994；sequence analysis in molecular biology,von heinje,g.,academic press,1987和sequence analysis primer,gribskov,m.and devereux,j.,eds.,m stockton press,new york,1991。
[0044]
相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，当其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中通常与之相关的其他组分(例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离时，多肽或核酸分子视为“分离的”。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“分离的”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“分离的”多肽或核酸分子优选基本上为均质的。
[0045]“有效量”意指本发明的fxi结合蛋白或药物组合物的量能导致疾病症状的严重性
降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。
[0046]
如本文所用，“血栓形成”是指在血管内形成或存在凝块(也称为“血栓”)，从而阻碍血液流经循环系统。血栓形成通常由血液组成、血管壁的质量和/或血流的性质的异常所引起。凝块的形成通常由血管壁损伤(诸如来自创伤或感染的血管壁损伤)和通过损伤点的血流的减缓或停滞所引起。在一些情况下，凝血异常引起血栓形成。
[0047]
如本文所用，“不损害止血”意味着在向对象施用本发明额fxi结合蛋白或药物组合物后在对象中观察到极少或没有可检测的出血。在靶向fxi的情况下，抑制fxi转化为fxia或抑制fxiia对fix的活化在不出血的情况下抑制凝血和相关血栓形成。
[0048]
如本文所用的术语“对象”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。
[0049]
本发明的fxi结合蛋白
[0050]
在一方面，本发明提供了一种fxi结合蛋白，其包含至少一个能够特异性结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域。
[0051]
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1-23中任一所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3。所述cdr可以是kabat cdr、abm cdr、chothia cdr或imgt cdr。
[0052]
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自以下的一组cdr1、cdr2和cdr3：
[0053][0054]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白中的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域是vhh。在一些实施方案中，所述vhh包含seq id no:1-23中任一氨基酸序列。
[0055]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白中的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域是人源化的vhh。
[0056]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白中的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域是人源化的vhh，所述人源化的vhh包含与seq id no:1-23中任一序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述人源化的vhh的氨基酸序列与seq id no:1-23中任一相比包含一或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。
[0057]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白中的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域是人源化的vhh，其中所述人源化的vhh包含seq id no:300-335中任一氨基酸序列。
[0058]
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple2
结构域内的表位。fxi的apple2结构域的示例性氨基酸序列如seq id no:338所示。例如，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4、seq id no:10或seq id no:14中任一所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含选自seq id no:60-62、seq id no:63-65、seq id no:66-68、seq id no:69-71、seq id no:132-134、seq id no:135-137、seq id no:138-140、seq id no:141-143、seq id no:180-182、seq id no:183-185、seq id no:186-188、seq id no:189-191的一组cdr1、cdr2和cdr3。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4、seq id no:10或seq id no:14中任一所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:306-323中任一所示的氨基酸序列。
[0059]
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域不结合fxi的apple2结构域内的表位。在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域不结合fxi的apple2结构域。在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域不结合分离的fxi的apple2结构域多肽。
[0060]
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple3结构域内的表位。fxi的apple3结构域的示例性氨基酸序列如seq id no:339所示。例如，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含选自seq id no:216-218、seq id no:219-221、seq id no:222-224、seq id no:225-227的一组cdr1、cdr2和cdr3。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:324-329中任一所示的氨基酸序列。
[0061]
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple4结构域内的表位。fxi的apple4结构域的示例性氨基酸序列如seq id no:340所示。例如，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含选自seq id no:24-26、seq id no:27-29、seq id no:30-32、seq id no:33-35的一组cdr1、cdr2和cdr3。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:300-305中任一所示的氨基酸序列。
[0062]
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple1-2区域(apple1结构域和apple2结构域之间的区域)内的表位。fxi的apple1-2区域的示例性氨基酸序列如seq id no:341所示。
[0063]
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple2-3区域(apple2结构域和apple3结构域之间的区域)内的表位。fxi的apple2-3区域的示例性氨基酸序列如seq id no:342所示。例如，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含选自seq id no:252-254、seq id no:255-257、seq id no:258-260、seq id no:261-263的一组cdr1、cdr2和cdr3。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:330-335中任一所示的氨基酸序列。
[0064]
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple3-4区域(apple3结构域和apple4结构域之间的区域)内的表位。fxi的apple3-4区域的示例性氨基酸序列如seq id no:343所示。
[0065]
在一些实施方案中，所述fxi结合蛋白包含一个特异性结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域。
[0066]
在一些实施方案中，所述fxi结合蛋白包含至少两个，例如2、3、4或更多个特异性结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域。
[0067]
在一些实施方案中，所述至少两个免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的相同区域或表位，或竞争结合或部分竞争结合fxi的相同区域或表位，例如，所述至少两个免疫球蛋白单一可变结构域是相同的。
[0068]
在一些实施方案中，所述至少两个免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的不同区域或表位，或不竞争结合fxi的相同区域或表位。
[0069]
两个抗体或免疫球蛋白单一可变结构域是否结合或竞争结合相同区域或表位可以通过生物膜干涉技术bli进行epitope binning来确定，如本技术实施例所示例。
[0070]
在一些实施方案中，所述至少两个特异性结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域直接相互连接。
[0071]
在一些实施方案中，所述至少两个特异性结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域通过接头相互连接。所述接头可以是长1-20或更多个氨基酸、无二级以上结构的非功能性氨基酸序列。例如，所述接头是柔性接头，例如ggggs、gs、gap、(ggggs)x 3等。
[0072]
在一些实施方案中，所述fxi结合蛋白包含能够特异性结合fxi的第一免疫球蛋白单一可变结构域和能够特异性结合fxi的第二免疫球蛋白单一可变结构域，其中所述第一免疫球蛋白单一可变结构域和所述第二免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi上的不同表位。
[0073]
在一些实施方案中，第一免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple2结构域内的表位，且第二免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple3结构域内的表位；或者
[0074]
第一免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple2结构域内的表位，且第二免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple4结构域内的表位；或者
[0075]
第一免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple2结构域内的表位，且第二免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple2-3区域内的表位；或者
[0076]
第一免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple3结构域内的表位，且第二免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple4结构域内的表位；或者
[0077]
第一免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple3结构域内的表位，且第二免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple2-3区域内的表位；或者
[0078]
第一免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple4结构域内的表位，且第二免疫球蛋白单一可变结构域结合fxi的apple2-3区域内的表位。
[0079]
在一些实施方案中，所述fxi结合蛋白包含第一免疫球蛋白单一可变结构域和第二免疫球蛋白单一可变结构域，其中，
[0080]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4所示的vhh中的cdr1、cdr2和
cdr3；或
[0081]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0082]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0083]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0084]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0085]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0086]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0087]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0088]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0089]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0090]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0091]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0092]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0093]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17所示的vhh中的cdr1、cdr2和
cdr3；或
[0094]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0095]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0096]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0097]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0098]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0099]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0100]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3。
[0101]
在一些实施方案中，其中seq id no:1、4、9、10、14、17或20所示的vhh中的cdr1、cdr2和cdr3如下表所示：
[0102][0103]
在一些实施方案中，所述fxi结合蛋白包含第一免疫球蛋白单一可变结构域和第二免疫球蛋白单一可变结构域，其中，
[0104]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1、300-305之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4、306-311之一所示的氨基酸序列；或
[0105]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1、300-305之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的氨基酸序列；或
[0106]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1、300-305之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10、312-317之一所示的氨基酸序列；或
[0107]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1、300-305之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14、318-323之一所示的氨基酸序列；或
[0108]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1、300-305之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17、324-329之一所示的氨基酸序列；或
[0109]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:1、300-305之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20、330-335之一所示的氨基酸序列；或
[0110]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4、306-311之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的氨基酸序列；或
[0111]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4、306-311之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10、312-317之一所示的vhh中的氨基酸序列；或
[0112]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4、306-311之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14、318-323之一所示的氨基酸序列；或
[0113]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4、306-311之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17、324-329之一所示的氨基酸序列；或
[0114]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:4、306-311之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20、330-335之一所示的氨基酸序列；或
[0115]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10、312-317之一所示的氨基酸序列；或
[0116]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14、318-323之一所示的氨基酸序列；或
[0117]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17、324-329之一所示的氨基酸序列；或
[0118]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:9所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20、330-335之一所示的氨基酸序列；或
[0119]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10、312-317之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14、318-323之一所示的氨基酸序列；或
[0120]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10、312-317之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17、324-329之一所示的氨基酸序列；或
[0121]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:10、312-317之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20、330-335之一所示的氨基酸序列；或
[0122]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14、318-323之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17、324-329之一所示的氨基酸序列；或
[0123]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:14、318-323之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20、330-335之一所示的氨基酸序列；或
[0124]
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:17、324-329之一所示的氨基酸序列，且第二免疫球蛋白单一可变结构域包含seq id no:20、330-335之一所示的氨基酸序列。
[0125]
在一些实施方案中，其中所述第一免疫球蛋白单一可变结构域位于所述第二免疫球蛋白单一可变结构域的n端。在另一些实施方案中，其中所述第二免疫球蛋白单一可变结构域位于所述第一免疫球蛋白单一可变结构域的n端。
[0126]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白，除了至少一个能够特异性结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域外，还包含免疫球蛋白fc区。在本发明的fxi结合蛋白中包含免疫球蛋白fc区可以使所述结合分子形成二聚体。可用于本发明的fc区可以来自不同亚型的免疫球蛋白，例如，igg(例如，igg1、igg2、igg3或igg4亚型)、iga1、iga2、igd、ige或igm。
[0127]
在一些实施方案中，可以在野生型的fc序列上引入突变用于改变fc介导的相关活性。所述突变包括但不限于：a).改变fc介导的cdc活性的突变；b).改变fc介导的adcc活性的突变；或c).改变fcrn介导的体内半衰期的突变。此类突变描述于下列文献中：leonard g presta,current opinion in immunology 2008,20:460
–
470；esohe e.idusogie et al.,j immunol 2000,164:4178-4184；raphael a.clynes et al.,nature medicine,2000,volume 6,number 4:443-446；paul r.hinton et al.,j immunol,2006,176:346-356。例如，可以通过突变ch2区上的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸用于增加或去除fc介导的adcc或cdc活性或是增强或减弱fcrn的亲和力。此外，可以通过突变铰链区的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸增加蛋白的稳定性。
[0128]
在一些实施方案中，fc序列上可以引入突变，从而使得突变的fc更容易形成同二聚体或者异二聚体。如ridgway,presta et al.1996以及carter 2001中提到的利用fc接触界面氨基酸侧链基团空间作用的knob-hole模型，使得不同fc突变之间更容易形成异二聚体；再比如如cn 102558355a或者cn 103388013a中，通过改变fc接触界面氨基酸所带的电荷，进而改变fc接触界面之间的离子相互作用力，使得不同的fc突变对之间更容易形成异二聚体(cn 102558355a)，亦或是具有相同突变的fc之间更容易形成同二聚体(cn 103388013a)。
[0129]
所述免疫球蛋白fc区优选是人免疫球蛋白fc区，例如是人igg1、igg2、igg3、或
igg4的fc区。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白fc区的氨基酸序列示于seq id no:336。
[0130]
在一些具体实施方案中，本发明的fxi结合蛋白中，所述免疫球蛋白fc区(例如人igg1的fc区)直接或通过接头(如肽接头)间接连接至所述免疫球蛋白单一可变结构域(如vhh)的c端。
[0131]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白包含一个特异性结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域，其直接或通过接头与免疫球蛋白fc区连接，所述免疫球蛋白fc区允许所述fxi结合蛋白形成包含两个fxi结合结构域的二聚体分子。这样的fxi结合蛋白也称为二价fxi结合蛋白。在一些实施方案中，所述二聚体是同二聚体。
[0132]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白包含直接或通过接头相互连接的两个特异性结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域和一个免疫球蛋白fc区，所述免疫球蛋白fc区允许所述fxi结合蛋白形成包含四个fxi结合结构域的二聚体分子。这样的fxi结合蛋白也称为四价fxi结合蛋白。在一些实施方案中，所述二聚体是同二聚体。在一些实施方案中，所述fxi结合蛋白中的两个特异性结合fxi的免疫球蛋白单一可变结构域分别结合fxi的不同区域或不同表位。
[0133]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白能够抑制fxi的活性。在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白能够抑制fxi的凝血功能。
[0134]
核酸、载体、宿主细胞
[0135]
在另一方面中，本发明涉及编码本发明的fxi结合蛋白的核酸分子。本发明的核酸可为rna、dna或cdna。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的核酸。
[0136]
本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或yac。载体可尤其为表达载体，即可提供fxi结合蛋白体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。针对在特定宿主中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。对本发明的fxi结合蛋白的表达有用或必需的调控元件及其他元件的具体实例，例如启动子、增强子、终止子、整合因子、选择标记物、前导序列、报告基因。
[0137]
本发明的核酸可基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息通过已知的方式(例如通过自动dna合成和/或重组dna技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。
[0138]
在另一方面中，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的fxi结合蛋白和/或含有本发明的核酸或载体的重组宿主细胞。本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
[0139]
适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(escherichia coli)菌株、变形杆菌属(proteus)菌株及假单胞菌属(pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(bacillus)菌株、链霉菌属(streptomyces)菌株、葡萄球菌属(staphylococcus)菌株及乳球菌属(lactococcus)菌株)的细胞。
[0140]
适合的真菌细胞包括木霉属(trichoderma)、脉孢菌属(neurospora)及曲菌属(aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(saccharomyces)(例如酿酒酵母
(saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(pichia methanolica))及汉森酵母属(hansenula)的物种的细胞。
[0141]
适合的哺乳动物细胞包括例如hek293细胞、cho细胞、bhk细胞、hela细胞、cos细胞等。
[0142]
然而，本发明也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。
[0143]
本发明还提供产生本发明的fxi结合蛋白的方法，所述方法通常包含以下步骤：
[0144]-在允许表达本发明的fxi结合蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞；及
[0145]-从培养物回收由所述宿主细胞表达的fxi结合蛋白；及
[0146]-任选进一步纯化和/或修饰本发明的fxi结合蛋白。
[0147]
本发明的fxi结合蛋白可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞质中、在周质中或在包涵体中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。
[0148]
用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的fxi结合蛋白的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。
[0149]
然而，本发明的fxi结合蛋白也可以通过本领域已知的其它产生蛋白质的方法获得，例如化学合成，包括固相或液相合成。
[0150]
药物组合物
[0151]
另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的fxi结合蛋白。这样的组合物可以包含一种或组合的(例如两种或多种不同的)本发明的fxi结合蛋白。例如，本发明的药物组合物可以含有结合靶抗原(fxi)上的不同表位的抗体分子组合。
[0152]
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
[0153]
本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(bha)、丁羟甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
[0154]
这些组合物还可含有如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
[0155]
可以通过灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单
硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
[0156]
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
[0157]
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
[0158]
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
[0159]
可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，例如大约0.1％至大约70％，或大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。
[0160]
可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
[0161]
对于抗体分子的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至30mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重、20mg/kg体重或30mg/kg体重，或在1-30mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。
[0162]
或者，抗体分子也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，
直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。
[0163]
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素
[0164]
本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明fxi结合蛋白的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
[0165]
或者，本发明的fxi结合蛋白也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
[0166]
疾病治疗和/或预防
[0167]
在一方面，本发明还提供了治疗和/或预防对象中的血栓栓塞病症或疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本发明的fxi结合蛋白或本发明的药物组合物。
[0168]
在一些实施方案中，所述对象患有或有风险患有：心肌梗塞、缺血性中风、肺血栓栓塞、静脉血栓栓塞(vte)、心房纤维性颤动、弥漫性血管内凝血、医疗装置相关的血栓栓塞病症、重度全身性炎性反应综合症、体外循环(如心肺转流术，血液透析和ecmo)中形成的血栓栓塞、动脉血栓、晚期肾病、抗磷脂综合征、脑卒中、转移性癌症或感染性疾病。
[0169]
在一些实施方案中，所述对象具有fxi的病理性活化。
[0170]
在一方面，本发明进一步提供了本发明的fxi结合蛋白或本发明的药物组合物在制备用于治疗和/或预防血栓栓塞病症或疾病的药物中的用途。
[0171]
在一些具体实施方案中，所述血栓栓塞病症或疾病是心肌梗塞、缺血性中风、肺血栓栓塞、静脉血栓栓塞(vte)、心房纤维性颤动、弥漫性血管内凝血、医疗装置相关的血栓栓塞病症、重度全身性炎性反应综合症、体外循环(如心肺转流术，血液透析和ecmo)中形成的血栓栓塞、动脉血栓、晚期肾病、抗磷脂综合征、脑卒中、转移性癌症或感染性疾病。
[0172]
在一方面，本发明提供了抑制对象中的fxi活化(例如通过因子xiia(fxiia))的方法，其包括：(a)选择需要治疗的对象，其中需要治疗的对象具有血栓形成或有血栓形成风险；和(b)向对象施用有效量的本发明的fxi结合蛋白或本发明的药物组合物，由此抑制fxi的活化。
[0173]
在一些实施方案中，需要治疗的对象是患有或有风险患有以下疾病的对象：心肌梗塞、缺血性中风、肺血栓栓塞、静脉血栓栓塞(vte)、心房纤维性颤动、弥漫性血管内凝血、医疗装置相关的血栓栓塞病症、重度全身性炎性反应综合症、体外循环(如心肺转流术，血液透析和ecmo)中形成的血栓栓塞、动脉血栓、晚期肾病、抗磷脂综合征、脑卒中、转移性癌症或感染性疾病。
[0174]
在一些实施方案中，需要治疗的对象是具有fxi的病理性活化的对象。
[0175]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白或本发明的药物组合物的有效量是足以使fxi的活化抑制至少10％、20％、30％、40％、50％的量。
[0176]
在另一方面，本发明提供了抑制有需要的对象中的凝血和相关的血栓形成而不损害止血的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本发明的fxi结合蛋白或本发明的药物组合物，由此抑制对象中的凝血和相关的血栓形成而不损害止血。
[0177]
在一些实施方案中，所述对象患有或有风险患有：心肌梗塞、缺血性中风、肺血栓栓塞、静脉血栓栓塞(vte)、心房纤维性颤动、弥漫性血管内凝血、医疗装置相关的血栓栓塞病症、重度全身性炎性反应综合症、体外循环(如心肺转流术，血液透析和ecmo)中形成的血栓栓塞、动脉血栓、晚期肾病、抗磷脂综合征、脑卒中、转移性癌症或感染性疾病。
[0178]
在一些实施方案中，所述对象是具有fxi的病理性活化的对象。
[0179]
在另一方面，本发明还提供了本发明的fxi结合蛋白或本发明的药物组合物在制备用于抑制凝血和相关的血栓形成而不损害止血的药物中的用途。
[0180]
在本发明各个方面的一些实施方案中，通过肠胃外施用向对象施用本发明的fxi结合蛋白或本发明的药物组合物。
[0181]
检测
[0182]
在另一方面本发明还提供检测生物学样品中fxi的存在和/或量的方法，包括在本发明的fxi结合蛋白与fxi之间能够形成复合物的条件下，使所述生物学样品和对照样品接触本发明的fxi结合蛋白。然后检测复合物的形成，其中所述生物学样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中fxi的存在和/或量。
[0183]
在一些实施方案中，本发明的fxi结合蛋白还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。
[0184]
试剂盒
[0185]
本发明的范围内还包括用于本发明的方法的试剂盒，该试剂盒包括本发明的fxi结合蛋白，以及使用说明。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。
[0186]
实施例
[0187]
下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。
[0188]
实施例1、针对fxi重链单域抗体的筛选
[0189]
1.1文库的构建
[0190]
免疫前收集5ml双峰驼动脉血于真空采血管，收集上清作为免疫前血清。初次免疫，选取一只健康的2岁新疆双峰驼，取300μg重组人xi因子(hfxi，自行制备，序列参考uniprot数据库，登录号p03951)作为抗原与完全弗氏佐剂等体积均匀混合，使蛋白完全乳化后，对双峰驼采用颈部肌肉多点注射；后期免疫，每次采用等量的抗原与不完全弗氏佐剂等体积均匀混合；每周免疫一次，后期共对双峰驼免疫六次。最后一次免疫结束时，收集5ml双峰驼动脉血于真空采血管内，收集上清作为免疫后血清。
[0191]
利用密度梯度离心法分离出淋巴细胞，使用qiagen公司提供的rna提取试剂盒提
取总rna。使用super-script iii first strandsupermix试剂盒按照说明书将提取的rna全部反转录为cdna，用巢式pcr扩增编码重链抗体的可变区的核酸片段。
[0192]
回收目标重链单域抗体核酸片段，并使用限制性内切酶(购自neb)psti及noti将其克隆进入噬菌体展示用载体pmecs中。产物随后电转化至大肠杆菌电转感受态细胞tg1中，构建抗重组人xi因子的免疫单域抗体噬菌体展示文库并对文库进行检定。通过梯度稀释铺板，计算库容的大小为1.5
×
108。为检测文库的插入率，随机挑选50个克隆测序检测，具有正确的外源片段插入的克隆为50个，正确率为100％。通过对测序克隆的dna和氨基酸序列分别分析比对，证实所有序列均为骆驼vhh序列，可估测其多样性在95％以上。
[0193]
1.2针对fxi的重链单域抗体淘选
[0194]
第一次筛选，用蛋白happle-chis(自行制备，序列参考uniprot数据库，登录号p03951，选取前387位氨基酸序列，并在序列c端加入his-tag用于纯化)5μg/孔包被平板，4℃放置过夜。第二天用2％脱脂奶室温封闭2小时后，加入100μl噬菌体(约10
8-109pfu，来自1.1hfxi-chis单域抗体展示文库)，在室温下作用2小时。之后用pbst(pbs中含有0.05％吐温20)洗25遍，以洗掉不结合的噬菌体。最后用glycine(100mm,ph 2.0)将与happle-chis特异性结合的噬菌体解离下。
[0195]
第二次筛选，用蛋白mapple-chis(自行制备，序列参考uniprot数据库，登录号q91y47，选取前389位氨基酸序列，并在序列c端加入his-tag用于纯化)3μg/孔包被平板，4℃放置过夜。第二天用2％脱脂奶粉室温封闭2小时后，加入100μl噬菌体(约10
8-109pfu，来自1.1的hfxi-chis单域抗体展示文库)，在室温下作用2小时。之后用pbst(pbs中含有0.05％吐温20)洗25遍，以洗掉不结合的噬菌体。最后用glycine(100mm,ph 2.0)将与mapple-chis特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌tg1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。第2轮用蛋白happle-chis 10μg/孔包被平板，其余操作同上。
[0196]
由此，阳性的克隆被富集，达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中fxi特异抗体的目的。
[0197]
1.3用酶联免疫方法(elisa)筛选特异性单个阳性克隆
[0198]
将以上淘选后获得的fxi结合阳性的噬菌体感染空白大肠杆菌并铺板。随后随机挑选190个单菌落，分别命名为ife 1至ife 190，分别接种至2ty-ag，培养至od600约0.8时，加入iptg终浓度约1mm，25℃过夜诱导表达，单域抗体表达于大肠杆菌周质中，次日收菌，裂解菌体，上清用于elisa检测。分别用hfxi、happle和mapple包被平板4℃过夜，将获得的样品裂解上清液(对照组为空白大肠杆菌裂解上清)加入，室温下反应2小时。洗涤之后加入二抗goat anti-ha tag hrp(购自abcam)，室温反应2小时。洗涤之后加入tmb显色液，读取450nm和650nm波长吸收值，450nm波长的吸光度值减去650nm波长的吸光度值为最终的吸光度值。当样品孔od值大于对照孔od值2倍以上时，判为阳性克隆孔。将阳性克隆送金唯智测序。
[0199]
根据序列比对软件bioedit分析各个克隆的蛋白序列。把cdr1、cdr2、cdr3序列同源性>90％的克隆视为同一抗体株。最终共获得23株不同的抗体。结合检测结果见下表1，可知ife96、ife97、ife148、ife163、ife166、ife168同时与hfxi、happle和mapple结合，ife29、ife30、ife5、ife7、ife13、ife15、ife35、ife56、ife11、ife17、ife22、ife43、ife49、ife50、
ife70、ife108、ife128与hfxi和happle结合，不与mapple结合。
[0200]
表1、23株抗体的结合特性
[0201][0202]
1.4阳性克隆的原核表达以及纯化
[0203]
将1.3中筛选获得的阳性克隆单菌落(大肠杆菌tg1表达体系，载体为pmecs，含有ha和his标签)在2ty-ag中培养过夜的种子液转接到50ml 2ty-ag培养基中，37℃培养至od600约0.8时，加入iptg终浓度约1mm，25℃过夜诱导表达。次日收获菌体，并用tris缓冲液重悬并超声破菌，获得的上清利用单域抗体上的his标签，使用ni柱亲和层析法进行纯化，得到相应的目标蛋白。
[0204]
1.5原核表达蛋白对happle和mapple的亲和力检测
[0205]
以0.5μg/孔的量用happle和mapple蛋白分别包被平板，4℃过夜。加入1.4获得的、带有his和ha标签的候选单域抗体的梯度稀释系列，室温下反应2小时。洗涤之后加入辣根过氧化物酶标记的鸡抗ha标签的二抗(streptavidin-hrp，abcam)，室温反应2小时。洗涤之后加入显色液，读取450nm和650nm波长的吸光度值，450nm波长的吸光度值减去650nm波长的吸光度值为最终的吸光度值。应用软件sotfmax pro v5.4进行数据处理和作图分析，通过四参数拟合，得到针对fxi的候选单域抗体与happle和mapple的结合曲线及ec50值，以反映这些候选抗体对happle和mapple的亲和能力。
[0206]
结果见表2，可知这些候选单域抗体均与happle结合，其中ife43、ife50、ife96与蛋白happle的亲和力较弱；而且ife96、ife97、ife148、ife163、ife166、ife168同时与mapple结合。
[0207]
表2、候选抗体对happle和mapple的结合亲和力
[0208]
sampleec
50
(ng/ml)：与happleec
50
(ng/ml)：与mappleife532.9——ife718.7——
ife1143.6——ife1319.5——ife1519.7——ife1731.4——ife22116.0——ife2923.8——ife3024.0——ife3524.1——ife43结合很弱，最高od<0.5——ife491160——ife50结合很弱，最高od<0.5——ife56323.0——ife7060.3——ife961250(20ug/ml时od1.3)20ug/ml时od0.8ife97735.01230(20ug/ml时od1.4)ife10743.3——ife12854.7——ife148263255ife16316.212.9ife16649.846.8ife16820.558.4
[0209]
实施例2、用哺乳动物细胞制备fxi单域抗体的fc融合蛋白
[0210]
2.1制备fxi单域抗体的fc融合质粒
[0211]
设计引物进行pcr扩增fxi单域抗体vhh片段(氨基酸序列见seq id no:1-23；其中为了提高蛋白的稳定性，将部分序列fr2区上的个别氨基酸进行突变)，与编码人igg1-fc的dna片段(氨基酸序列seq id:336)融合，并克隆至常规哺乳动物表达载体，获得用于在哺乳动物中表达fxi单域抗体-fc融合蛋白的重组质粒。其中使用通用引物扩增不同vhh片段，与人igg1-fc的dna片段融合。通用引物如下：
[0212]
上游引物cccaccggtcaggtgcagctgcaggagtc
[0213]
下游引物cccggatcctgaggagacggtgacctgg
[0214]
2.2制备fxi单域抗体的fc融合蛋白
[0215]
将2.1构建获得载体转染至hek293细胞进行抗体的瞬时表达。将重组表达质粒用freestyle293培养基稀释并加入转化所需pei(polyethylenimine)溶液，将每组质粒/pei混合物分别加入hek293细胞悬液中，放置在37℃，5％co2，悬浮培养。培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过protein a亲和层析法，纯化得到目标fxi单域抗体-fc融合蛋白。通过sds-page以及sec-hplc初步检测所获得的蛋白纯度。各蛋白表达情况和纯度分析见下表3。
[0216]
表3、所获得的抗fxi单域抗体-fc融合蛋白瞬转后一步纯化结果
[0217]
抗体表达量(mg/l)sds-page纯度％sec纯度％
ife5-fc413>95％99.1ife7m-fc3.8————ife13-fc367>95％99.4ife15m-fc16————ife17ereg-fc42.9>95％——ife29m-fc25————ife30m-fc50————ife35-fc397>95％98.4ife49-fc495>95％99.3ife56-fc412>95％97.5ife96-fc412>95％97.9ife97-fc378>95％99ife148-fc418>95％97.4ife163-fc292>95％93.2ife166-fc486>95％98.3ife168-fc368>95％98.3
[0218]
可见，fxi单域抗体-fc融合蛋白ife7m-fc、ife15m-fc、ife17ereg-fc、ife29m-fc、ife30m-fc表达量很低，其余表达量均在290mg/l以上，且经过protein a亲和层析柱一步纯化后，获得了具有稳定浓度以及高纯度的目的蛋白质。
[0219]
实施例3、鉴定fxi单域抗体-fc融合蛋白的功能
[0220]
3.1fxi单域抗体-fc融合蛋白对mapple和happle的结合曲线
[0221]
分别用蛋白mapple和happle包被平板，0.5μg/孔，同时设置空白对照，4℃过夜。加入实施例2.2所得的fxi单域抗体-fc融合蛋白的梯度稀释系列，室温下反应2小时。洗涤之后加入goat anti-human igg-hrp(购自sigma)，室温反应2小时。洗涤之后加入显色液，读取450nm和650nm波长吸收值，450nm波长的吸光度值减去650nm波长的吸光度值为最终的吸光度值。应用软件sotfmax pro v5.4进行数据处理和作图分析，通过四参数拟合，得到抗体对mapple和happle结合曲线及ec50值，以反映抗体对mapple和happle的亲和能力。
[0222]
结果见表4，抗体均与蛋白happle有很好的结合，其中抗体ife96、ife97、ife148、ife163、ife166、ife168与蛋白mapple也有很好的结合。
[0223]
表4、fxi单域抗体-fc融合蛋白对mapple和happle的结合
[0224]
[0225]
3.2检测fxi单域抗体-fc融合蛋白的亲和力(生物膜干涉技术bli)
[0226]
上述实施例获得的fxi单域抗体-fc融合蛋白针对重组蛋白happle和mapple的结合动力学，通过生物膜干涉(biolayerinterferometry，bli)技术，使用分子相互作用仪测量。fxi单域抗体-fc融合蛋白ife5-fc、ife13-fc、ife35-fc、ife56-fc、ife97-fc、ife5-fc稀释至终浓度10μg/ml直接固化到proteina biosensor上，对动力学测量，将happle用0.02％pbst20稀释至200nm、100nm、50nm、25nm、12.5nm 5个浓度，将mapple稀释至50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.13nm 5个浓度，进样150s，解离时间为900s，10mm glycine-hcl(ph1.7)再生5s。使用简单一对一languir结合模型(octet k2数据分析软件9.0版(data analysis 9.0))，计算结合速率(kon)和解离速率(kdis)。平衡解离常数(kd)以比率kdis/kon计算。
[0227]
结果见表5和表6，其中表5显示fxi单域抗体-fc融合蛋白与happle结合力相当，表6显示抗体ife97-fc和ife148-fc与mapple亲和力更好。
[0228]
阳性对照14e11参照专利wo2010080623中的序列进行基因合成后，根据上述方法通过293细胞进行瞬时表达制备获得。
[0229]
表5、与happle亲和力
[0230]
抗体kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)阳性对照14e112.10e-099.55e 042.01e-04ife5-fc1.77e-096.41e 041.14e-04ife13-fc6.59e-099.86e 046.50e-04ife35-fc2.02e-083.95e 047.98e-04ife56-fc2.27e-083.33e 047.55e-04ife97-fc1.61e-091.50e 052.43e-04ife148-fc9.52e-091.09e 051.03e-03
[0231]
表6、与mapple亲和力
[0232]
抗体kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)ife97-fc<1.0e-125.17e 05<1.0e-07ife148-fc3.14e-113.60e 051.13e-05
[0233]
3.3检测fxi单域抗体-fc融合蛋白与apple蛋白结合的不同表位(生物膜干涉技术bli：epitope binning)
[0234]
利用in-tandem方法，分别将happle-chis-biotin和mapple-chis-biotin用0.02％pbst20稀释至10ug/ml固化到sa biosensor上，固化时间为100s，高度约1nm。将fxi单域抗体-fc融合蛋白用0.02％pbst20稀释至200nm，将其分成两组，抗体结合时间均为
300s，再生液为10mm glycine-hcl(ph1.7)；第一个抗体(饱和抗体)结合到sensor上至饱和状态，之后第二个抗体(竞争抗体)以同样浓度与第一个抗体进行竞争，计算百分比。百分比计算公式为ab2 with ab1/ab2 without ab1。
[0235]
测量结果见表7、表8和表9。综合以上结果，由表7可知，ife13-fc、ife35-fc和14e11存在竞争，ife13-fc表位与14e11重叠，ife35-fc表位与14e11部分重叠；ife56-fc和ife35-fc存在竞争，ife56-fc表位与14e11有部分位阻；ife5-fc和ife30-fc存在竞争，表位相同，且与14e11不重叠；由表8和表9可知，ife97-fc和ife163-fc存在竞争，表位相同，且与14e11不重叠；ife148-fc同时识别人与小鼠，表位与其他单域抗原以及14e11都不重叠。
[0236]
表7 happle
[0237][0238]
表8 happle
[0239][0240]
表9 mapple
[0241][0242]
3.4检测fxi单域抗体-fc融合蛋白与空细胞的非特异结合
[0243]
chok1空细胞和293f空细胞重悬于3％bsa-pbs，调整细胞数至6
×
106细胞/ml，根据实施例3.1的结果选取fxi单域抗体-fc融合蛋白终浓度为100μg/ml，同时设置阴性对照和空白对照，冰浴60min。洗涤后加入biolegend二抗fitc anti-human igg fc，冰浴30min。洗涤后将细胞重悬于300μl的1％pbs-bsa buffer中，流式细胞仪进行检测。
[0244]
结果见表10和表11，候选抗体与空白细胞均没有非特异性结合。
[0245]
表10
[0246]
[0247]
3.5鉴定fxi单域抗体fc融合蛋白对fxi的阻断活性(atpp检测)
[0248]
利用光学检测法，将预温的血浆与试剂快速混合孵育，在波长660nm处检测其吸光值，随着孵育时间的延长，纤维蛋白原变成纤维蛋白而使混合物的浊度增加，从而引起散射光强度的变化，仪器检测因样品的浊度增加而变化的散射光强度，从而测定凝固时间。商品化凝血因子xi作为标准品，使用标准曲线的凝固法，以凝固时间为y轴，参考血浆的活性百分比为x轴，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的活性。
[0249]
将抗体用乏fxi血浆分别稀释至1μg/ml，同时用buffer作为阴性对照，分别取50μl处理好的样品37℃孵育2h，然后上样至全自动凝血仪，与dade actin activated cephaloplastin reagent、calcium chloride solution和factor ix deficient试剂自动混合、孵育后，在波长660nm处检测其吸光值。结果见下表11，ife15、ife29、ife96、ife166、ife168没有阻断活性。
[0250]
表11
[0251]
样品名称凝血时间(s)活性未加抗体60.988.6％ife13-fc69.948.1％ife15m-fc6188.0％ife29m-fc62.280.7％ife30m-fc67.257.2％ife56-fc70.446.6％ife5-fc64.966.8％ife35-fc7047.7％ife96-fc62.579.0％ife97-fc67.954.7％ife148-fc64.270.1％ife163-fc68.452.9％ife166-fc61.982.5％ife168-fc61.783.7％
[0252]
根据表11的结果，将抗体ife13、ife35、ife97、ife5、ife148、ife56、ife30用标准人血浆做系列稀释，分别检测活性曲线，同时设置阳性对照14e11，结果如图1，可知ife5、ife13、ife35、ife56、ife97的抑制剂效果明显优于阳性对照14e11；其余的抗体ife148、ife30抑制效果与阳性对照相当。
[0253]
3.6fxi单域抗体对于不同apple domain的结合
[0254]
选取上述实施例获得的fxi单域抗fc融合蛋白，以及阳性对照14e11，通过生物膜干涉(biolayerinterferometry，bli)技术考察其对不同人apple domain蛋白的结合动力学。不同的apple domain蛋白的序列来自uniprot(登陆号p03951)，且有的apple结构域都在其c端加入his-tag用于纯化(名称中带有chis)，有的在c端加入小鼠fc片段用于纯化(名称中带有mufc)。蛋白通过293细胞瞬时转染后，进一步通过imac纯化获得。具体操作过程与前述相似，检测物分别使用自行制备的happle1-2mufc，happle2-3mufc，happle3-4mufc，happle2-chis，happle4-chis，happle1-mufc，happle3-mufc。
[0255]
候选fxi单域抗体fc融合蛋白对不同apple结构域的结合情况见下表12和表13。
[0256]
表12
[0257] happle1-2mufchapple2-3mufchapple3-4mufchapple1-mufchapple4-chis14e11结合结合不结合不结合不结合ife5-fc不结合不结合结合不结合结合ife13-fc结合结合不结合不结合不结合ife35-fc结合不结合不结合不结合不结合ife56-fc结合结合不结合不结合不结合ife97-fc不结合结合结合不结合不结合ife148-fc不结合结合不结合不结合不结合
[0258]
表13
[0259] happle2-chis(kd，m)happle4-chis(kd，m)happle3-mufc(kd，m)14e112.15e-09不结合不结合ife5-fc不结合4.29e-10不结合ife13-fc7.71e-10不结合不结合ife35-fc8.20e-07不结合不结合ife56-fc3.02e-09不结合不结合ife97-fc不结合不结合<1.0e-12ife148-fc不结合不结合不结合
[0260]
实施例4、fxi单域抗体的人源化
[0261]
人源化方法采用蛋白表面氨基酸人源化(resurfacing)的方法及vhh人源化通用框架移植法(cdr grafting to a universal framework)完成。
[0262]
人源化步骤如下：对抗体株ife5、ife13、ife35、ife56、ife97和ife148进行同源建模，建模软件为modeller9。参考同源序列为nbbcii10抗体(pdb编号为：3dwt)，并根据蛋白三维结构计算氨基酸的相对溶剂可及性(relative solvent accessibility)。如抗体株ife5、ife13、ife35、ife56、ife97和ife148的某个氨基酸暴露在溶剂内，则替换为参考人抗体10hq序列相同位置的氨基酸，最终完成全部替换。
[0263]
vhh人源化通用框架移植法具体步骤如下：首先获取c
é
cile vincke等人根据序列同源性设计完成的通用性人源化vhh框架hnbbcii10fgla(pdb编号为：3eak)，该框架设计基于纳米抗体nbbcii10抗体(pdb编号为：3dwt)，参考人源抗体10hq进行蛋白表面氨基酸人源化，并改造vhh序列框架1(framework1)的部分氨基酸vlp、vhh序列框架2(framework2)的部分氨基酸gl、vhh序列框架3(framework3)的部分氨基酸rskraav和vhh序列框架4(framework4)的氨基酸l完成。我们直接使用hnbbcii10fgla作为框架，将cdr替换为抗体株
ife5、ife13、ife35、ife56、ife97和ife148的cdr区，完成抗体的人源化。
[0264]
对抗体株ife5、ife13、ife35、ife56、ife97和ife148进行人源化，分别获得6种抗体株的人源化变体hufe。这些人源化变体的序列分别适于seq id no:300-335。
[0265]
实施例5、人源化单域抗体的fc融合蛋白的制备
[0266]
5.1制备人源化单域抗体的fc融合质粒
[0267]
将实施例4中的hufe人源化序列委托苏州泓讯生物科技有限公司进行基因合成，并在两端加上酶切位点。
[0268]
双酶切hufe单域抗体vhh片段，与编码人igg1fc的dna片段融合，并克隆至常规哺乳动物表达载体，获得用于在哺乳动物中表达hufe单域抗体fc融合蛋白的重组质粒。
[0269]
5.2制备人源化单域抗体的fc融合蛋白
[0270]
将4.1构建获得载体转染至hek293细胞进行抗体的瞬时表达。将重组表达质粒用freestyle293培养基稀释并加入转化所需pei(polyethylenimine)溶液，将每组质粒/pei混合物分别加入hek293细胞悬液中，放置在37℃，5％co2，130rpm中培养。四小时后补加excell293培养基，2mm谷氨酰胺，130rpm培养。24小时后加3.8mm vpa，72小时后加入4g/l葡萄糖。培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过protein a亲和层析法，纯化得到目标hufe单域抗体fc融合蛋白。蛋白通过sdspage以及sechplc初步考察纯度。各蛋白的表达量都超过350mg/l且一步纯化后的sec纯度都大于95％。
[0271]
实施例6、鉴定hufe单域抗体-fc融合蛋白的功能
[0272]
6.1hufe单域抗体fc融合蛋白的亲和力
[0273]
上述实施例获得的hufe单域抗体fc融合蛋白针对happle-chis蛋白的结合动力学，通过生物膜干涉(biolayerinterferometry，bli)技术，使用分子相互作用仪测量。将实施例5.2所得的hufe单域抗体fc融合蛋白稀释至终浓度10μg/ml直接固化到ahc biosensor上，对动力学测量，将happle-chis蛋白分别稀释至200nm、100nm、50nm、25nm、12.5nm 5个浓度，基线60s，结合120s，解离900s。稀释液为kinetic buffer，再生液为glycine-hcl(ph1.7)，中和液为稀释液。biosensor为proteina。使用简单一对一languir结合模型(octet k2数据分析软件9.0版(data analysis 9.0))，计算结合速率(kon)和解离速率(kdis)。平衡解离常数(kd)以比率kdis/kon计算。
[0274]
测量的hufe单域抗体fc融合蛋白对happle-chis蛋白的亲和力见表14。
[0275]
表14
[0276]
[0277][0278]
上述实施例获得的hufe单域抗体fc融合蛋白针对hfxi-chis蛋白的结合动力学，通过生物膜干涉(biolayerinterferometry，bli)技术，使用分子相互作用仪测量。具体操作过程与前述相同，检测物使用hfxi-chis蛋白。4e11(如前述)以及b1213790-f11a(根据wo2018134184中的序列自行制备)作为对照。
[0279]
测量的hufe单域抗体fc融合蛋白对hfxi-chis蛋白的亲和力见表15。
[0280]
表15
[0281]
samplekd(m)samplekd(m)hufe35huv1-ld-fc1.02e-08hufe35huv2-ld-fc2.55e-08hufe13huv1-ld-fc8.84e-09hufe13huv2-ld-fc1.05e-08hufe56huv1-ld-fc3.97e-09hufe56huv2-ld-fc4.21e-09hufe97huv1-ld-fc2.67e-09hufe97huv2-ld-fc2.51e-09hufe148huv1-ld-fc2.64e-09hufe148huv2-ld-fc4.56e-09hufe5huv1-ld-fc6.56e-10hufe5huv2-ld-fc6.12e-10hufe35huv3-ld-fc9.65e-09hufe35huv4-ld-fc3.13e-08hufe13huv3-ld-fc6.84e-09hufe13huv4-ld-fc8.84e-09hufe56huv3-ld-fc5.97e-09hufe56huv4-ld-fc3.97e-09hufe97huv3-ld-fc1.98e-09hufe97huv4-ld-fc2.67e-09hufe148huv3-ld-fc3.45e-09hufe148huv4-ld-fc2.64e-09hufe5huv3-ld-fc4.56e-10hufe5huv4-ld-fc6.56e-10hufe35huv5-ld-fc1.02e-08hufe35huv6-ld-fc1.02e-08hufe13huv5-ld-fc8.84e-09hufe13huv6-ld-fc8.84e-09hufe56huv5-ld-fc3.97e-09hufe56huv6-ld-fc3.97e-09hufe97huv5-ld-fc2.67e-09hufe97huv6-ld-fc2.67e-09hufe148huv5-ld-fc2.64e-09hufe148huv6-ld-fc2.64e-09hufe5huv5-ld-fc6.56e-10hufe5huv6-ld-fc6.56e-1014e113.02e-09b1213790-f11a4.12e-09
[0282]
结果表明人源化的单域抗体-fc融合蛋白与happle-chis结合以及与hfxi-chis结
合都很好，各种人源化版本之间没有显著差别。且与两个对照抗体相比的结合力相当。
[0283]
选取部分上述实施例获得的hufe单域抗fc融合蛋白，通过生物膜干涉(biolayerinterferometry，bli)技术考察其对新西兰兔fxi蛋白的结合动力学。具体操作过程与前述相同，检测物使用自行制备的新西兰兔fxi蛋白(相关蛋白序列参考uniprot数据库登陆号q95me7)
[0284]
测量的hufe单域抗体fc融合蛋白对rabfxi-apple-chis蛋白的亲和力见下表16。
[0285]
表16
[0286]
samplekd(m)samplekd(m)hufe35huv1-ld-fc/hufe35huv2-ld-fc/hufe13huv1-ld-fc2.95e-08hufe13huv2-ld-fc3.15e-08hufe56huv1-ld-fc/hufe56huv2-ld-fc/hufe97huv1-ld-fc8.78e-10hufe97huv2-ld-fc9.60e-10hufe148huv1-ld-fc7.83e-09hufe148huv2-ld-fc7.21e-09hufe5huv1-ld-fc2.87e-07hufe5huv2-ld-fc4.51e-07
[0287]
选取部分上述实施例获得的hufe单域抗fc融合蛋白，通过生物膜干涉(biolayerinterferometry，bli)技术考察其对食蟹猴fxi蛋白的结合动力学。具体操作过程与前述相同，检测物使用自行制备的食蟹猴fxi蛋白(相关蛋白序列参考uniprot数据库登陆号a0a2k5vvk2)
[0288]
测量的hufe单域抗体fc融合蛋白对食蟹猴fxi-chis蛋白的亲和力见表17。
[0289]
表17
[0290]
samplekd(m)samplekd(m)hufe35huv1-ld-fc<1.0e-12hufe35huv2-ld-fc1.24e-12hufe13huv1-ld-fc1.27e-08hufe13huv2-ld-fc2.06e-08hufe56huv1-ld-fc5.93e-09hufe56huv2-ld-fc7.23e-09hufe97huv1-ld-fc<1.0e-12hufe97huv2-ld-fc<1.0e-12hufe148huv1-ld-fc9.87e-10hufe148huv2-ld-fc8.25e-10hufe5huv1-ld-fc/hufe5huv2-ld-fc/
[0291]
上述实验结果表明大部分候选抗体都能同时识别人、新西兰兔、以及食蟹猴的凝血f11因子。但是对于新西兰兔的结合相对有所降低。且35与56号抗体在新西兰兔中基本没有活性，而5号抗体在食蟹猴中基本没有活性。各种不同人源化版本的蛋白之间活性没有明显差异。
[0292]
选取部分上述实施例获得的hufe单域抗fc融合蛋白，通过生物膜干涉(biolayerinterferometry，bli)技术考察其对活化的人11因子蛋白(hfxia)的结合动力学。具体操作过程与前述相同，检测物使用市售的hfxia。14e11(如前述)以及b1213790-f11a(如前述)作为对照。
[0293]
测量的hufe单域抗体fc融合蛋白对hfxia蛋白的亲和力见表18。
[0294]
表18
[0295]
samplekd(m)
hufe35huv1-ld-fc4.55e-08hufe13huv1-ld-fc6.93e-09hufe56huv1-ld-fc2.88e-08hufe97huv1-ld-fc1.42e-09hufe148huv1-ld-fc5.05e-0914e115.73e-10b1213790-f11a6.85e-11
[0296]
由上述结果可知，人源化的fxi单域抗体fc融合蛋白能有效结合活化的fxi因子。其结合力低于直接结合fxi因子活化位点的b1213790-f11a。
[0297]
同时，结合之前对未活化的fxi因子的结合结果还发现，同样是结合apple结构域(apple2)的14e11，其对于活化的fxia的结合性有所提高。而本发明的候选抗体对于活化fxia的结合与未活化的fxi的结合活性则保持相当，或者对活化fxia的结合有所降低。该结果从另一方面说明了，本发明的候选抗体，即使有个别与14e11在结合表位上有一定的交叉，但是其结合模式是有明显差异的。
[0298]
6.2hufe单域抗体fc融合蛋白对人fxi因子活性的抑制效果
[0299]
标准人血浆(who购买)中人fxi的活性为92％，配合乏fxi血浆，检测加入不同单域抗体fc融合蛋白及对照品(14e11)后，血浆中fxi因子活性被抑制的效果。fxi因子与不同抗体混合后的活性结果见表19和图2。这些人源化的fxi抗体都具有较好的对fxi因子的抑制活性结果。14e11蛋白作为阳性对照。
[0300]
表19
[0301][0302]
实施例7、用哺乳动物细胞制备hufe双特异性抗体的fc融合蛋白
[0303]
7.1制备hufe双特异性抗体的fc融合质粒
[0304]
将实施例4中获得的hufe单域抗体fc融合蛋白的基因通过分子克隆方式，获得用于在哺乳动物中表达hufe双特异性抗体fc融合蛋白的重组质粒，用于制备双特异性抗体蛋白：hufe97n13-ld-fc，hufe13n97-ld-fc，hufe97n56-ld-fc，hufe56n97-ld-fc，hufe97di-ld-fc，hufe56n13-ld-fc，hufe13n56-ld-fc，hufe97n148-ld-fc，hufe148n97-ld-fc，hufe5n97-ld-fc，hufe97n5-ld-fc，hufe148n5-ld-fc，hufe5n148-ld-fc，hufe148n56-ld-fc，hufe56n148-ld-fc，hufe56n5-ld-fc，hufe5n56-ld-fc，hufe5n13-ld-fc，hufe13n5-ld-fc。
[0305]
同时hufe97di-ld-fc的四价单特异性抗体也通过上述方法或者，作为对照抗体。
[0306]
7.2制备hufe双特异性抗体的fc融合蛋白
[0307]
将7.1构建获得载体转染至hek293细胞进行抗体的瞬时表达。将重组表达质粒用freestyle293培养基稀释并加入转化所需pei(polyethylenimine)溶液，将每组质粒/pei
混合物分别加入hek293细胞悬液中，放置在37℃，5％co2，中悬浮培养。培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过protein a亲和层析法，纯化得到目标hufe双特异性抗体fc融合蛋白。蛋白通过sdspage以及sechplc初步考察纯度。
[0308]
所有蛋白的表达水平都在250mg/l到400mg/l之间，一步纯化之后sec的纯度都在95％以上。该结果初步证明这些双特异性抗体的可溶性稳定性都比较出色，适合作为药物候选分子。
[0309]
实施例8、hufe双特异性抗体-fc融合蛋白高温加速
[0310]
上述实施例获得的hufe双特异性抗体fc融合蛋白各取12mg，超滤浓缩至10mg/ml，pbs溶液。之后之后放置于40℃，定期取样检测其蛋白含量，sec纯度等变化，以考察其稳定性。结果见下表20和21。
[0311]
表20加速后7个蛋白od280nm检测蛋白含量
[0312][0313]
表21 se-hplc检测
[0314][0315]
结论：高温20天后，纯度有所降低，但是在可接受的范围内。
[0316]
实施例9、鉴定hufe双特异性抗体-fc融合蛋白的功能
[0317]
9.1hufe双特异性抗体fc融合蛋白的亲和力
[0318]
上述实施例获得的hufe双特异性抗体fc融合蛋白针对happle-chis以及hfxi-chis蛋白的结合动力学，通过生物膜干涉(biolayerinterferometry，bli)技术，使用分子相互作用仪测量。将实施例7.2所得的hufe双特异性抗体fc融合蛋白稀释至终浓度10μg/ml直接固化到ahc biosensor上，对动力学测量，将happle-chis或者hfxi-chis蛋白分别稀释5个浓度，基线60s，结合120s，解离900s。稀释液为kinetic buffer，再生液为glycine-hcl(ph1.7)，中和液为稀释液。biosensor为proteina。使用简单一对一languir结合模型(octet k2数据分析软件9.0版(data analysis 9.0))，计算结合速率(kon)和解离速率(kdis)。平衡解离常数(kd)以比率kdis/kon计算。
[0319]
测量的hufe双特异性抗体fc融合蛋白对hfxi-chis蛋白的亲和力见下表22。
[0320]
表22
[0321] kd(m)huef13n97-ld-fc6.70e-10huef56n97-ld-fc6.74e-10huef97n13-ld-fc1.31e-09huef97n56-ld-fc5.51e-10huef97n148-ld-fc4.48e-10huef148n13-ld-fc1.81e-09huef13n148-ld-fc1.93e-09huef148n56-ld-fc1.66e-09huef56n148-ld-fc2.31e-09huef148n97-ld-fc4.64e-10huef5n13-ld-fc1.25e-09huef13n5-ld-fc9.52e-10huef5n97-ld-fc4.50e-10huef97n5-ld-fc2.16e-10huef56n5-ld-fc5.77e-10huef5n56-ld-fc6.11e-10huef148n5-ld-fc1.71e-09huef5n148-ld-fc2.01e-09
[0322]
测量的hufe双特异性抗体fc融合蛋白对happle-chis蛋白的亲和力见下表23。
[0323]
表23
[0324] kd(m)huef13n97-ld-fc<1.0e-12huef56n97-ld-fc<1.0e-12huef97n13-ld-fc<1.0e-12huef97n56-ld-fc<1.0e-12huef97n148-ld-fc<1.0e-12huef148n13-ld-fc9.04e-11huef13n148-ld-fc<1.0e-12huef148n56-ld-fc1.59e-10huef56n148-ld-fc2.31e-10huef148n97-ld-fc<1.0e-12huef5n13-ld-fc<1.0e-12huef13n5-ld-fc<1.0e-12huef5n97-ld-fc<1.0e-12huef97n5-ld-fc<1.0e-12huef56n5-ld-fc2.46e-10huef5n56-ld-fc1.11e-10
huef148n5-ld-fc4.59e-10huef5n148-ld-fc2.01e-10
[0325]
上述结果表明，所有的候选fxi双特异性抗体都表现出对于人fxi因子蛋白以及人apple结构域很好的亲和力，且比母本单特异性抗体要高。
[0326]
9.2hufe双特异性抗体fc融合蛋白的特异性
[0327]
选取上述实施例获得的fxi双特异性抗体，通过生物膜干涉(biolayerinterferometry，bli)技术考察其对其他凝血相关蛋白的非特异性结合。将抗体蛋白固化到ahc芯片上，考察的蛋白为市售的fvii、fix、fv、fxii、pro-thrombin、α-kallikrein、fviia、fixa、fva、fxiia、thrombin。实验结果表明所有的双特异性抗体与fvii、fix、fv、fxii、pro-thrombin、α-kallikrein、fviia、fixa、fva、fxiia、thrombin均无结合。
[0328]
9.3hufe双特异性抗体fc融合蛋白的抑制效果
[0329]
9.3.1对人fxi活性的抑制效果
[0330]
标准人fxi(who)的活性为92％，标准人血浆(sigma购买)中fxi的活性为87.5％。配合乏fxi血浆，检测加入不同单域抗体fc融合蛋白及对照品(14e11，maa868-f11)后，血浆中fxi因子活性被抑制的效果。fxi因子与不同抗体混合后的活性结果见图3。这些fxi抗体都具有较好的对fxi因子的抑制活性结果，且都优于对照阳性抗体。其中14e11蛋白(制备同上)，与maa868-f11(根据专利申请us15/739414制备)作为阳性对照。
[0331]
9.3.2对人全血浆的aptt的抑制活性
[0332]
用标准人血浆(sigma购买)稀释fxi抗体至不同浓度，37度孵育3min后检测全血aptt时间。14e11以及b1213790-f11a为阳性对照。
[0333]
图4显示了aptt时间随抗体浓度的变化。该结果展示候选fxi抗体蛋白都能有效延长全血aptt凝血时间；且双特异性抗体表现出更优的抑制凝血的效果。
[0334]
9.3.3对猴全血浆的aptt的抑制活性
[0335]
用猴血浆(sigma购买)稀释fxi抗体至不同浓度，37度孵育3min后检测全血aptt时间。14e11以及b1213790-f11a为阳性对照。
[0336]
结果见图5。
[0337]
9.3.4对兔全血浆的aptt的抑制活性
[0338]
用兔血浆(sigma购买)稀释施例fxi抗体fc融合蛋白及标准品至不同浓度，检测全血aptt时间。14e11以及b1213790-f11a为阳性对照。
[0339]
结果见图6。
[0340]
上述实验结果说明大部分的fxi候选抗体，无论是否双特异性都能在人或猴的血浆中显示出较好的aptt抑制活性。部分抗体在兔子中没有活性。
[0341]
候选抗体在人血浆中的活性，基本都优于对照阳性抗体。而双特异性抗体的活性往往优于单特异性。
[0342]
9.4fxi单域抗体fc融合蛋白以及双特异性抗体对兔子静脉血栓的影响
[0343]
隔夜禁食兔子，通过耳缘静脉采集血液，耳缘静脉注射麻醉剂进行麻醉，在颈静脉远心端和近心端结扎，两根结扎线之间的间隔统一保持在3.0cm左右。造模前15min，耳缘静脉注射1mg/kg供试品(施例5.2所得的hufe单域抗体fc融合蛋白)或者pbs阴性对照品(见表
24)。动脉夹分别夹住颈静脉的近心端和远心端，用注射器从面静脉抽尽血管内的血液，再将0.3ml 5mg/ml的激动剂注射入封闭段血管中，激动剂孵育5分钟后将激动剂用注射器抽出，用生理盐水冲洗2次，松开动脉夹，使血液恢复流通，控制血管直径在0.8mm.诱导血栓形成。血液恢复流通25分钟后，用动脉夹夹紧封闭段的静脉远心端和近心段，并系紧之前结扎的静脉近心段和远心端手术线，剪开封闭静脉，取出血栓，立即称血栓湿重并记录。将血栓置于60度烘箱中烘干20h后，称取血栓干重并记录数据(见表25)。
[0344]
观察指标为血栓重量，实验数据用x
±
sd表示，应用graphpad prism 5 1way anova进行显著性检验(见图7)。
[0345]
收到不同抗体与兔子种属交叉性的影响，只有部分抗体展示出较好的血栓抑制效果。后续将选择种属交叉性更好的猴子展开相应体内活性检测。
[0346]
表24
[0347][0348]
表25
[0349][0349][0350]
序列信息
[0351]
23个重链单域抗体的氨基酸序列及相应cdr序列
[0352]
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