7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌呤(PreQ1)的制备方法与流程

7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(preq1)的制备方法
技术领域
1.本发明涉及核苷的制备领域，特别涉及7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(preq1)的制备方法。


背景技术：

[0002]7‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(preq1)是q核苷(queuosine)合成的重要原料,q核苷是一种类似于胍的高度修饰的核苷，它广泛存在于细菌和真核生物的某些trna中，并且被报道在t
‑
rna合成中优先使用，但其内在机制尚未完全理解。q核苷在原核生物中被报道具有辅酶的作用，并且在高等动物中可作为益生菌(生长促进物质)的潜在作用。q核苷是由微生物
‑
宿主相互作用而产生一种新颖的化合物，人体自身无法合成，而其来源主要是人体共生微生物。q核苷的碱叫q碱(queuine)，该碱的主要构成是7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(preq1)。无论是在q核苷的生物合成或化学制备中，7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤都是其必需的原料。
[0003]
preq1的已有制备方法包含酶法以及化学合成法：
[0004]
酶法：生物体内合成preq1时，以三磷酸鸟苷(gtp)作为起始原料，需要五步酶(gchi/qued/quee/quec/quef)转化才能得到preq1。因此路线长，整体收率低，迄今为止还没有报道利用该方法进行放大制备。
[0005]
化学合成法：preq1的化学制备也有少量研究，但是需要大量的官能团保护、脱保护以及复杂的化学转化才能实现(需要7步以上化学反应)，其工业制备可能性低。
[0006]7‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌酶法制备路线太长，很难实现有效的体外酶催化工艺；而其化学制备制备需要对多个官能团进行保护及脱保护，整体路线长，化学制备过程中需要用到多种有毒有害试剂(如：特戊酰氯、tmstf、乙酸铯等),所以生产过程中安全系数低，环境兼容性低，再加上整体收率并不高；所以最终生产成本高。
[0007]
随着大众对工业生产中的个人安全、自然环境保护的重视，绿色化学工业是其发展的必然趋势。因此，提供一种化学酶法制备7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(preq1)具有重要的现实意义。


技术实现要素：

[0008]
有鉴于此，本发明针对7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(preq1)酶催化及化学合成制备方法的优点及缺陷，开发了化学酶结合制备的方法，这不仅缩短了制备路线，同时也大大提高了每步转化的效率，与此同时，由于酶催化的参与，也将整个制备路线的废物排放大大降低，从而在保证市场竞争力的同时提高其工业生产中安全及绿色指数。
[0009]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0010]
本发明提供了7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(preq1)的制备方法，包括如下步骤：
[0011]
步骤1：制备获得7
‑
羧基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(cdg)；
[0012]
步骤2：经酶解，制备获得7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq1)。
[0013]
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1采用的原料包括甲酸甲酯、氯乙酸甲酯和
2,4
‑
二氨基
‑6‑
羟基嘧啶。
[0014]
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1具体为：
[0015]
步骤1
‑
1：甲酸甲酯与氯乙酸甲酯在碱性条件下缩合生成中间体2
‑
氯
‑3‑
氧丙酸甲酯(化合物1)；
[0016]
步骤1
‑
2：取所述中间体在水溶液中与2,4
‑
二氨基
‑6‑
羟基嘧啶缩合成环得到7
‑
甲酸甲酯
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(化合物2)；
[0017]
步骤1
‑
3：在弱碱性条件下酯水解得7
‑
羧基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(cdg)。
[0018]
在本发明的一些具体实施方案中，甲酸甲酯、氯乙酸甲酯与2,4
‑
二氨基
‑6‑
羟基嘧啶的摩尔比为：(10～12)：(1.5～2.5)：(0.9～1.2)。
[0019]
作为优选，甲酸甲酯、氯乙酸甲酯与2,4
‑
二氨基
‑6‑
羟基嘧啶的摩尔比为：35:6:3。
[0020]
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1
‑
1中所述缩合的温度为
‑
10～10℃，时间为1.5～4.0h；
[0021]
步骤1
‑
2中所述缩合的温度为80～100℃，时间为0.5～2.0h；
[0022]
步骤1
‑
3中所述酯水解的温度为90～120℃，时间为2～4h。
[0023]
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1
‑
1中所述碱性条件由甲醇钠提供；
[0024]
步骤1
‑
3中所述弱碱性条件为ph值12～14。
[0025]
在本发明的一些具体实施方案中，所述7
‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤合成酶的酶活为75～120u/mg，所述氰基还原酶的酶活为150～300u/mg。
[0026]
在本发明的一些具体实施方案中，还包括多聚磷酸激酶ppk或ptdh中的一种或两种。
[0027]
在本发明的一些具体实施方案中，所述酶解还包括反应原料三磷酸腺苷(atp)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)。
[0028]
本发明利用廉价工业化学品(甲酸甲酯、氯乙酸甲酯以及2,4
‑
二氨基
‑6‑
羟基嘧啶)作为原料，先通过三步简单的化学转化制备7
‑
羧基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(cdg),然后利用两步方便的酶反应高效专一的将7
‑
羧基转化成7
‑
氨甲基从而得到最终产品7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq1)。该化学
‑
酶结合法利用了化学催化的多样性以及酶法的选择性，从而实现了preq1制备路线的优化，这不仅缩短了路线，提高最终产率，同时也有效的提高了其规模化生产的绿色指数。
附图说明
[0029]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0030]
图1示本发明化学酶法制备路线；
[0031]
图2示实施例1中7
‑
甲酸甲酯
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(化合物2)的化学制备路线；
[0032]
图3示实施例2中7
‑
甲酸
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(cdg)的化学制备路线；
[0033]
图4示实施例3中cdg酶制备7
‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq0)；
[0034]
图5示实施例4中preq0酶(quef1)制备7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq1)；
[0035]
图6示实施例5中preq0酶(quef2)制备7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq1)；
[0036]
图7示实施例6中cdg酶直接制备7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq1)(quec quef 1)。
具体实施方式
[0037]
本发明公开了7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(preq1)的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0038]
酶相关信息：
[0039]7‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤合成酶(quec synthase):来源于大肠杆菌(uniprot id:p77756,ec 6.3.4.20)；
[0040]
氰基还原酶(nitrile reductase,quef1):来源于胡萝卜软腐果胶杆菌(pectobacterium carotovorum，uniprot id:c6dah4,ec 1.7.1.13)；
[0041]
氰基还原酶(nitrile reductase,quef2):来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis,uniprot id:o31678,ec 1.7.1.13)；
[0042]
多聚磷酸激酶(ppk):来源于苜蓿根瘤菌(rhizobium meliloti,uniprot id:q92sa6,ec 2.7.4.1)；
[0043]
亚磷酸氧化酶(ptdh):是以施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)体内一个亚磷酸脱氢酶为模板改造而来(uniprot id:o69054,ec 1.20.1.1)。
[0044]
酶的发酵生产：
[0045]
本发明所需的酶都是通过公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得；其具体包含以下步骤：将以上酶所对应的基因进行序列优化后在下单到通用生物公司合成(安徽滁州),再引进ndei/xhoi酶切位点并亚克隆到pet 28a表达载体上。确认序列正确的质粒转入e.coli(bl21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。其具体包含单菌落转入5ml含50μm卡那霉素的lb培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的lb培养液中，同样生长到对数期时转入5l培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5l发酵罐培养中，当细胞od～20时加入0.5mm异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代吡喃半乳糖苷(iptg)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm,20min)获得酶过量表达湿细胞40
‑
70g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)缓冲液(50mm,ph 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑sds
‑
page凝胶电泳(十二烷基磺酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与tris.hcl缓冲液(50mm,ph 8.0)在低温混合均匀(以～10g湿细胞:200ml缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm,45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在150～300u/ml,u是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。lb培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％nacl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
[0046]
表1
[0047]
[0048][0049]
表2
[0050]
[0051]
[0052]
[0053][0054]
[0055]
本发明化学酶法制备路线如图1所示：
[0056]
本发明首先利用甲酸甲酯与氯乙酸甲酯在碱性条件下缩合生成2
‑
氯
‑3‑
氧丙酸甲酯(化合物1)，然后该中间体在水溶液中与2,4
‑
二氨基
‑6‑
羟基嘧啶缩合成环得到7
‑
甲酸甲酯
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(化合物2)，在弱碱性条件下酯水解得7
‑
羧基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(cdg)；最后7
‑
羧基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤在7
‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤合成酶(quec synthase,ec 6.3.4.20)催化下生成7
‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(pre q0),preq0在专一性的氰基还原酶(nitrile reductase,quef，ec 1.7.1.13)作用下制备得到最终化合物7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq1)。由于最后两步酶反应需要用到三磷酸腺苷(atp)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph),两种辅酶的适时再生则可以进一步降低生产成本并提高产品品质。
[0057]
随着大众对工业生产中的个人安全、自然环境保护的重视，绿色化学工业是其发展的必然趋势。考虑到单一制备方法无法实现7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌的高效制备，因此通过结合利用化学
‑
酶两种转化的各自独特的优势成为一个重要的选择；同时由于酶催化的环境兼容特性，还可以大大减少制备过程中的废物生成。本专利结合利用preq1化学与酶制备工艺，通过有效优化整合，形成一个最佳的制备路线，该路线不仅大大降低了生产成本，同时也更适宜于规模化工业催化。
[0058]
本发明提供的7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(preq1)的制备方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。
[0059]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0060]
实施例1：7
‑
甲酸甲酯
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(化合物2)的化学制备
[0061]
路线图如图2所示。
[0062]
将甲酸甲酯21.2g(350mmol)溶入200ml无水的四氢呋喃(thf)，然后在冰浴下搅拌冷却；4℃分批加入甲醇钠4.32g(80mmol),加完后搅拌30分钟，然后用滴液漏斗缓慢滴加氯乙酸甲酯6.52g(60mmol)。滴加完后4℃拌2小时，然后缓慢升至25℃继续搅拌1小时。最后加入冰水进入反应体系淬灭未反应的甲醇钠，该混合溶液再利用旋转蒸发仪减压抽掉低沸点的未反应的原料甲酸甲酯以及溶剂thf，剩余的水溶液即为产物2
‑
氯
‑3‑
氧丙酸甲酯(化合物1)的水溶液，该化合物可不分离直接进行下一步转化。具体步骤是将该水溶液加热90℃然后加入2,4
‑
二氨基
‑6‑
羟基嘧啶3.6g(30mmol)加热维持90℃搅拌30分钟，然后将溶液中生成的固体进行过滤干燥，得到5.55g 7
‑
甲酸甲酯
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(化合物2)白色固体(总收率89％)。
[0063]
实施例2：7
‑
甲酸
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(cdg)的化学制备
[0064]
路线图如图3所示。
[0065]
将10g 7
‑
甲酸
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(48mmol)混合到由h2o(500ml)和dmso(100ml)组成的混合溶液中，然后加入6ml(5n)的氢氧化钠水溶液，并将该混合液100℃流2小时。最后将溶液冷却至25℃在此过程中有白色固体析出，过滤抽干该固体(8.5g，91％收率)，此即为目标化合物7
‑
甲酸
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(cdg)。
[0066]
实施例3：从cdg酶制备7
‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq0)
[0067]
路线图如图4所示。
[0068]
在500ml含有100mm ph 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)溶液中先后加入9.7g 7
‑
甲酸
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(cdg，100mm)、3.2g氯化胺(120mm)、1.4g三磷酸腺苷二钠盐atp
(5mm)、8.4g偏六磷酸钠(27.5mm)、0.48g氯化镁(10mm)、0.75g氯化钾(20mm)；待ph值调节到8.0后，1000u 7
‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤合成酶quec(8.3～13.3mg)以及1500u多聚磷酸激酶ppk(5.0～7.5mg)加入溶液启动反应，在反应过程中通过添加0.1n的hcl或naoh水溶液维持反应体系ph值在6.5～9.0,室温搅拌5小时后反应完全，随后加hcl酸化沉淀反应酶(调节溶液ph值到1.5并快速搅拌)，离心除去蛋白杂质，调节溶液ph值到7.0后利用反渗透除盐，最后利用d201阴离子交换树酯除含磷酸杂质(用去离子水做洗脱液，7
‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌与树脂结合弱直接流出),冻干后粗品通过纯水:乙醇1:3v/v结晶，最后得到7.4g白色固体(最终收率84％)。
[0069]
实施例4：从preq0酶(quef1)制备7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq1)
[0070]
路线图如图5所示。
[0071]
同样在1000ml含有50mm ph 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)溶液中先后加入17.5g 7
‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌(100mm),1.5gβ
‑
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp

)单钠盐(0.2mm),52g五水亚磷酸钠(240mm)以及200ml异丙醇。调节反应液ph值到8.0后，加入2000u quef1以及4000u ptdh(27～67mg)启动反应，该反应液在室温下缓慢搅拌4小时，在反应过程中通过添加hcl或naoh水溶液维持体系ph值在7.0
‑
8.5之间。反应结束后加hcl溶液沉淀蛋白并高速离心除去，最后利用反渗透膜除盐浓缩后利用乙醇/水结晶得到15.6g白色固体(收率89％)。
[0072]
实施例5：从preq0酶(quef2)制备7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq1)
[0073]
路线图如图6所示。
[0074]
与上述实施例4类似，这次用的是quef2酶而非quef1酶。同样在500ml含有50mm ph 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)溶液中先后加入4.37g7
‑
氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌(50mm),0.75gβ
‑
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp

)单钠盐(0.2mm),13g五水亚磷酸钠(120mm)以及100ml异丙醇。调节反应液ph值到8.0后，加入3000u quef2(10～20mg)以及4000u ptdh启动(ptdh 27
‑
67mg)反应，该反应液在室温下缓慢搅拌8小时，在反应过程中通过添加hcl或naoh水溶液维持体系ph值在7.0
‑
8.5之间。反应结束后加hcl溶液沉淀蛋白并高速离心除去，最后利用反渗透膜除盐浓缩后利用乙醇/水结晶得到2.7g白色固体(收率61％)。
[0075]
实施例6：从cdg直接酶制备7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌(preq1)(quec quef 1)
[0076]
路线图如图7所示。
[0077]
在500ml含有100mm ph 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)溶液中先后加入4.9g 7
‑
甲酸
‑7‑
脱氮鸟嘌呤(cdg，50mm)、1.6g氯化胺(60mm)、0.7g三磷酸腺苷二钠盐atp(2.5mm)、4.2g偏六磷酸钠(13.8mm)、0.48g氯化镁(10mm)、0.75g氯化钾(20mm)、0.75gβ
‑
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp

)单钠盐(0.2mm),13g五水亚磷酸钠(60mm)以及100ml异丙醇；待溶液ph值调节到8.0后，1000u 7
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氰基
‑7‑
脱氮鸟嘌呤合成酶quec(8.3～13.3mg)、1000u quef1(3.3～6.7mg)、2000u多聚磷酸激酶ppk(6.7～10mg)以及3000u ptdh(20～50mg)加入溶液启动反应，该反应液在室温下缓慢搅拌6小时，同时在反应过程中间隔性的添加hcl或naoh稀水溶液维持体系ph值在7.0
‑
8.5之间。如上述酶反应后处理相同，反应结束后通过加入稀盐酸水溶液沉淀蛋白并高速离心除去，待溶液ph调回中性后利用反渗透膜除盐，d201阴离子交换树酯除含磷酸杂质，最后得到的7
‑
氨甲基
‑7‑
脱氮鸟嘌粗水溶液浓缩
后利用乙醇/水结晶得到4.1g白色固体(两步收率91％)。
[0078]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。