一种简便快速的高通量基因组裸DNA提取方法

一种简便快速的高通量基因组裸dna提取方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种简便快速的高通量基因组裸dna提取方法。


背景技术：

2.dna是遗传信息的主要载体，是生命科学领域研究的主要对象。人类多种疾病的发生和发展都与宿主基因组dna的变异相关。研究基因组变异与疾病发生的分子机制也是生命科学领域的主要研究内容。所以基因组dna提取是最基本的也是最为重要的分子生物学实验之一，是进行下游pcr技术、southern blot、fish等多种检测手段的前提。
3.近年来随着新型基因编辑技术的出现，实现了在基因组dna水平上的单个碱基的编辑，为基因组dna突变等相关疾病的基因治疗提供了强有力的工具。目前以crispr-cas9为首的新型基因编辑技术，虽然与传统技术相比极大的提高了基因编辑的效率，但是仍然需要从数以百计，甚至千计的由单个细胞形成的集落中筛选到编辑完全的纯合子，其中最为耗时的步骤为等待这些单个细胞扩增到足够数量后，提取其基因组dna，进行下游的鉴定。
4.目前可用的微量基因组dna提取试剂盒要求细胞起始量至少为2万个细胞，那么从单个细胞扩增到2万个细胞，即使是生长速度较快的肿瘤细胞也需要至少7天的时间，而对于生长速度较慢的细胞可能需要20天左右的时间。因此等待细胞扩增到足够数量用于基因组dna的提取，是一个实验周期的限速步骤。
5.此外，目前可用的基因组dna提取方法多是基于磁珠、吸附柱或是酚抽提等，酚和异丙醇等为有毒的有机溶剂，对工作人员以及环境均有危害，有违绿色科学的导向。同时这些方法都需要转移样品于不同的容器中，步骤繁琐，对于十几个样品来说，工作量尚可，一旦需要同时处理成百上千个样品，工作量过于繁重，而且需要对如此庞大数量的样品进行转移和标记，不仅非常容易造成样品之间的混淆和污染，同时也会耗费大量的实验用耗材，产生大量的实验垃圾，造成环境的污染。
6.近年来也出现了可以同时提取96个样品的商品化试剂和方法，但是均存在高样本起始量、仍需转移样品等不足和缺点。细胞起始量一般要求为5万个以上，需要转移样品于不同的容器中，步骤繁琐，易造成样本之间的污染。此外成本极高，一个用于96个样品的基因组dna提取试剂盒高达千元以上，这对科研工作造成了极大的经费负担。此外，鉴于目前可用的基因组dna提取方法均要求较高的细胞起始量，还没有可用于384微孔板内细胞基因组dna提取的方法。
7.为了简化实验流程，提高实验效率和准确性，降低科研成本，发明一种简单快捷的、低样本起始量的、同时可以处理大量样本的高通量基因组dna的提取方法仍然是需要解决的重要问题。


技术实现要素：

8.本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种简便快速的高通量基因组裸dna提取方法。
9.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：本发明包括以下步骤：s1：贴壁性生长细胞在孔板内生长融合率达到30-90%，去除细胞培养液；s2：加入细胞裂解液，放入湿盒内，并放入烘箱内；s3：从湿盒内拿出孔板，待温度降至室温后，加入dna沉淀液，静置；s4：使用离心机进行离心，倾倒上清，加入dna清洗液，再次离心；重复一次；s5：倾倒上清后，超净台内放置，待乙醇挥发完全后，加入dna溶解液，室温放置或者冰箱过夜进行溶解，通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对基因组dna进行浓度和纯度的测定；s6：选取适量体积的基因组dna用于后续实验。
10.本发明的有益效果在于：本发明是一种简便快速的高通量基因组裸dna提取方法，可用于哺乳动物细胞基因组dna的提取，与现有技术相比，本发明的方法简便快速，极大的提升了基因组dna的提取效率；灵敏度高，对细胞起始量要求极低，500个以上细胞即可成功提取基因组dna；可用于96孔板和384微孔板内细胞基因组dna的提取，因此在短时间内可以高通量的完成数以千计、万计样品基因组dna的提取；同时也可用于常规细胞培养皿、6孔板、12孔板、24孔板和48孔板等细胞培养板内基因组dna的提取；整个提取过程均在同一细胞培养容器内进行，无需转移样品，提取过程中无需震荡，避免了孔间污染；适用于贴壁性和悬浮生长细胞基因组dna的提取；本发明的方法安全无毒而且成本极低，用于提取96个样品基因组dna的试剂费用仅为10元左右。此外本方法提取的基因组dna为裸dna，没有蛋白和rna等的污染，可以用于下游pcr扩增和southern blot等方法的检测。
附图说明
11.图1是细胞加入裂解液前后的明场显微镜成像图；图2是加入dna沉淀液后明场显微镜成像图；图3是基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图；图4是通过pcr法对孔板内细胞的基因组dna编辑效果的鉴定图；图5是6孔板内基因组dna提取图。
具体实施方式
12.下面结合附图对本发明作进一步说明：（1）本发明需要配置如下溶液：细胞裂解液（5~10 mm tris/cl ph 7.5, 5~10 mm edta, 5~10 mm nacl, 0.2~1% sds, 0.2~1mg/ml蛋白酶k，5~20
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g/ml rna酶a）； dna沉淀液为含有5~10mm nacl的无水乙醇。dna清洗液为70%的乙醇；dna溶解液（10 mm tris-hcl ph 8.0， 0.1mm edta）。注：上述溶液配方均为工作液浓度，细胞裂解液中的蛋白酶k和rna酶a需要在溶液使用前新鲜加入， dna沉淀液和dna清洗液需要使用前在-20度冰箱预冷。
dna溶解液4度冰箱保存即可。
13.（2）细胞来源为通过crispr-cas9技术进行基因编辑，经过流式细胞分选仪器筛选得到的96个单细胞克隆。细胞种类为人乳腺癌细胞系hcc1806细胞，该细胞为贴壁性生长细胞。待细胞在96孔板内生长融合率达到30-90%左右，去除细胞培养液。如果细胞贴壁性较好，用100
µ
l pbs洗一次，如果贴壁性较差，弃掉培养液上清即可。
14.（3）加入50
µ
l 细胞裂解液，放入湿盒内，在55度烘箱内放置15min-4h（图1）。图1是细胞加入裂解液前后的明场显微镜成像图，a图为细胞加入细胞裂解液之前,使用明场显微镜在10倍物镜下的成像图，b为加入细胞裂解液5min之后使用明场显微镜在10倍物镜下的成像图，结果显示细胞在5min内已经裂解的非常充分；（4）从湿盒内拿出孔板，待温度降至室温后，加入100
µ
l dna沉淀液，静置15min（图2）。图2是加入dna沉淀液后明场显微镜成像图，在图2中，96孔板内的a5、b5和c5孔内加入dna沉淀液，室温放置15min后，使用明场显微镜在4倍和20倍物镜下进行成像，可以观察到丝状的基因组dna；（5）使用离心机进行离心，3000rpm，离心5min。
15.（6）倾倒上清，加入150
µ
l dna清洗液，再次离心。重复一次。
16.（7）倾倒上清后要倒扣在吸水纸巾上，轻拍，最大程度去除乙醇。放置于超净台内，待乙醇挥发完全后，加入30
µ
l dna溶解液，室温放置10min或者4度冰箱过夜进行溶解。通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对基因组dna进行浓度和纯度的测定（图3）。图3是基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图。在图3中，图2的基因组dna溶解后，通过紫外分光光度计对dna浓度和纯度进行测定。a5、b5和c5孔内的dna浓度分别为278ng/
µ
l、226ng/
µ
l 和293ng/
µ
l,od260/od280分别为1.85，1.89和1.87，dna浓度和纯度均很高。琼脂糖凝胶电泳每孔的上样量约为50ng，通过凝胶成像设备进行成像，结果显示基因组完整性非常好。
17.（8）选取适量体积的基因组dna用于后续实验。如用于pcr鉴定，可以取2
µ
l作为pcr反应模板，扩增结果见图4。通过pcr法对孔板内细胞的基因组dna编辑的效果进行鉴定。使用了2
×
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pcr master mix（yeason）常规pcr预混合溶液，所用引物的扩增片段约为350bp，pcr反应体系为10
µ
l，取5
µ
l用于琼脂糖凝胶电泳。n 代表阴性对照，即不加入基因组dna模板的pcr反应管； p代表阳性对照，是加入了商业化的基因组dna模板的pcr反应管； a1-a11， b1-b11， c1-c11， d1-d11， e1-e11， f1-f11， g1-g11， h1-h11， a12-h12为分别加入96孔板内基因组dna模板的pcr反应管。结果显示阴性对照没有pcr条带扩增，阳性对照有350bp 的pcr条带扩增， 96个反应管均有条带扩增出，其中扩增条带大小与阳性对照相比，发生位移的细胞均为发生基因编辑后的细胞克隆，其余与阳性对照相比，扩增条带的大小无明显区别的，需通过t7核酸酶内切酶或者一代测序进行鉴定。
18.本发明方法较为灵活，可以在2，4，6，7步骤暂停后放于-20度冰箱过夜。
19.本发明方法的基因组dna提取效率很高，如果对在底面积大于4平方厘米的培养器皿如6孔板等培养的细胞进行基因组dna的提取，基因组dna在加入dna沉淀液后已经肉眼可见，可以用灭菌牙签挑出，放入1.5ml离心管后进行后续清洗以及溶解工作（图5）。图5是6孔板内基因组dna提取图，肉眼可见丝状的基因组dna，可挑出后放于1.5ml离心管内，用于后续的清洗和溶解步骤。
20.本发明方法适用于贴壁性生长细胞和悬浮生长细胞。上述方法和步骤是针对96孔
板内贴壁性生长细胞，如果细胞为悬浮生长细胞，细胞裂解液配置浓度为上述工作液浓度的6倍，根据细胞培养液起始体积，加入1/5倍细胞培养液体积的细胞裂解液，后续步骤液体的体积根据上述步骤等比例进行使用。除96孔板外，本发明方法同样也可用于常规细胞培养皿、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板和394微孔板等细胞培养板内基因组dna的提取，可根据其与96孔板的细胞培养面积比例，等比例使用本发明方法内的溶液。
21.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。