一种基于PCR-CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测方法

一种基于pcr-crispr/cas13a的梅毒螺旋体检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于pcr-crispr/cas13a的梅毒螺旋体检测方法，特别涉及一种用于梅毒螺旋体检测，阿奇霉素耐药基因检测，以及基因分型的方法，属于分子诊断技术领域。


背景技术：

2.梅毒是一种在世界范围内常见的性传播疾病，主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液播散全身，可使几乎所有的机体组织及器官受累，临床症状根据不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期，临床表现多样且极具迷惑性，容易造成漏诊或误诊。实验室检测对梅毒诊断至关重要，但现有的基于核酸扩增的检测方法临床敏感性和特异性有限，并且由于梅毒螺旋体体外培养和金标准兔感染试验均不能在临床实践中常规开展，因此目前临床诊断主要依赖于血清学试验。然而，血清学实验仅对二期，三期梅毒具有较高敏感性，对一期梅毒的检测敏感性低下，无法对梅毒所有阶段进行有效的检测。近年，梅毒的发病率在全球范围内快速上升，如果能在检测出不同阶段的梅毒患者同时获取梅毒分子流行病学相关的信息(阿奇霉素耐药信息，分型的信息)，将有益于对梅毒螺旋体的进一步防治。同时，梅毒“血清固定”现象的存在，即经正规抗生素治疗后，血清学梅毒非特异性抗体仍呈阳性或滴度未能下降四倍，极大影响治疗效果的评估。因此，一种高敏感性的直接梅毒螺旋体检测方法对临床检测和疗效评估都具有极大的价值。
3.2017年美国的实验研究人员基于crispr/cas13a技术开发了sherlock(specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking)检测平台，利用cas13a的附属切割活性，结合rpa(recombinase polymerase amplification)等温扩增技术，通过模板的两次放大实现了单拷贝级别的检测。由于sherlock良好的可移植性与优秀的性能，大量基于此方案的检测平台被开发出来。但是rpa对于靶标的扩增会受到靶标序列的复杂程度的影响，比如gc含量，复杂的二级结构等，具有一定的局限性。pcr相对于这种等温扩增技术，能够更加灵活的针对不同的模板进行设计与扩增，大大增加可应用的范围。
4.目前，还没有基于pcr-crispr/cas13a在梅毒诊断方面的相关报道。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于pcr-crispr/cas13a的梅毒螺旋体检测试剂盒。
6.本发明的另一目的在于提供一种基于pcr-crispr/cas13a的梅毒螺旋体检测方法。该方法是一种具有高敏感性、高特异性的基于pcr-crispr/cas13a的针对梅毒螺旋体的检测、耐药基因识别、基因分型的分子检测方法。
7.本发明通过将pcr与crispr/cas13a结合，实现能够针对不同模板的具有高敏感性与特异性的体外检测技术。根据梅毒螺旋体的tpp47，23s rrna，tp0548基因分别设计了对
应的pcr扩增引物与crrna实现实现梅毒螺旋体的检测，阿奇霉素耐药基因的识别，分子流行病学的基因分型。这套便捷、快速、性能优异的分子诊断工具能够实现对梅毒的检测、分子流行病检测和治疗药物选择建议上提供具有价值的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.一种基于pcr-crispr/cas13a的梅毒螺旋体检测试剂盒，包括cas13a、梅毒螺旋体检测引物f1/r1、梅毒螺旋体检测crrna、报告rna；
10.或者，包括cas13a、梅毒螺旋体耐药识别引物f3/r3、梅毒螺旋体耐药识别crrna1、报告rna；
11.或者，包括cas13a、梅毒螺旋体分型引物f4/r4、梅毒螺旋体分型crrna-nichols、梅毒螺旋体分型crrna-ss14、报告rna；
12.优选的，所述试剂盒还包括tris-hcl、rntps、rna酶抑制剂、t7 rna聚合酶、mgcl2。
13.优选的，所述的cas13a为lwcas13a。
14.进一步的，
15.用于检测梅毒螺旋体的检测靶点为tpp47基因；设计的引物对为梅毒螺旋体检测引物f1/r1，设计的crrna为梅毒螺旋体检测crrna；
16.梅毒螺旋体检测引物f1：5
′‑
gaaattaatacgactcactatagggtacccaccgtgtctaccacaa-3
′
；
17.梅毒螺旋体检测引物r1：5
′‑
cagttgcggttcctcatgaat-3
′
；
18.梅毒螺旋体检测crrna：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaactaagacaatgctcactgaggatagtttt-3
′
；
19.所述的梅毒螺旋体检测引物f1/r1，用于扩增出能够进一步通过t7 rna聚合酶转录出含有与梅毒螺旋体检测crrna互补的rna核酸片段的dna核酸片段。
20.用于检测梅毒螺旋体耐药识别的检测靶点为23s rrna基因；设计的引物对为梅毒螺旋体耐药识别引物f3/r3，设计的crrna为梅毒螺旋体耐药识别crrna1；进行梅毒螺旋体阿奇霉素耐药位点a2058g与a2059g点突变的识别。
21.梅毒螺旋体耐药识别引物f3：5
′‑
gaaattaatacgactcactatagggacgcgagactcggtgaaatttatgtaccgg-3
′
；
22.梅毒螺旋体耐药识别引物r3：5
′‑
tcccacctatactacacatggtaaaccaagt-3
′
；
23.梅毒螺旋体耐药识别crrna1：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtctccccgtctaactatgggtaacc-3
′
；
24.所述的梅毒螺旋体检测引物f3/r3，用于扩增出能够进一步通过t7 rna聚合酶转录出含有与梅毒螺旋体耐药识别crrna1互补的rna核酸片段的dna核酸片段。
25.用于检测梅毒螺旋体分型的检测靶点为tp0548基因；设计的引物对为梅毒螺旋体分型引物f4/r4，设计的crrna为梅毒螺旋体分型crrna-nichols和梅毒螺旋体分型crrna-ss14；
26.梅毒螺旋体分型引物f4：5
′‑
gaaattaatacgactcactataggggcaaagaactttggctcaaatgagccgaac-3
′
；
27.梅毒螺旋体分型引物r4：5
′‑
gcagcccgagactgaacaaaaacgcataca-3
′
；
28.梅毒螺旋体分型crrna-nichols：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacg
tgttcgacttggcaactgtttgttt-3
′
；
29.梅毒螺旋体分型crrna-ss14：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtttgacgtcgctatcctttgttttta-3
′
；
30.所述的梅毒螺旋体检测引物f4/r4，用于扩增出能够进一步通过t7 rna聚合酶转录出含有与梅毒螺旋体分型crrna-nichols和/或梅毒螺旋体分型crrna-ss14互补的rna核酸片段的dna核酸片段。
31.本发明中，报告rna的序列不受特别限制，包含有多个连续碱基u以及荧光基团和淬灭基团的单链rna都可以进行。
32.优选的，所述的报告rna：5
′‑
fam-uuuuu-bhq1-3
′
。
33.一种基于pcr-crispr/cas13a的梅毒螺旋体检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
34.(1)提取待测样本的核酸，利用所述的梅毒螺旋体检测引物f1/r1、梅毒螺旋体耐药识别引物f3/r3或梅毒螺旋体分型引物f4/r4对待测样本的核酸进行pcr反应，得到pcr反应产物；
35.(2)将步骤(1)得到的pcr反应产物，所述的梅毒螺旋体检测crrna、梅毒螺旋体耐药识别crrna1，或者，梅毒螺旋体分型crrna-nichols和梅毒螺旋体分型crrna-ss14，所述的lwcas13a、报告rna，以适当比例混合于适当体系中进行反应，得到反应产物；
36.(3)将步骤(2)得到的反应产物进行荧光检测。
37.优选的，步骤(1)中所述的pcr反应的反应体系为25μl体系，ddh2o 9μl，premix 2x 12.5μl，10μm引物对f1/r1或f3/r3或f4/r4各1.25μl，待测样本的核酸1μl。
38.优选的，步骤(1)中所述的pcr反应的反应条件为：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。
39.优选的，步骤(2)中所述的反应体系为25μl体系，40mm tris-hcl(ph 7.5)，9mm mgcl2，1mm rntps，2000u/ml rna酶抑制剂，1500u/ml t7 rna聚合酶，225nm crrna或crrna1或crrna-nichols和crrna-ss14，45nm lwcas13a，125nm报告rna，0.5～2μl pcr反应产物。
40.优选的，步骤(3)中，检测所使用的的荧光激发波长为490nm，吸收波长为520nm，检测条件为37℃，每5min检测1次，总共连续检测37次。
41.本发明中，制备取待测样本的核酸的方法不受特别限制，可以采用任何已知的核酸提取制备的方法或试剂盒进行。
42.本发明中，制备crrna的方法不受特别限制，可以采用任何已知的转录或是直接合成的方法。
43.本发明中，荧光检测使用的荧光检测仪器不受特别限制，可以采用市面上能够包含激发波长为490nm，吸收波长为520nm的仪器进行检测。
44.本发明的机理是：
45.首先由pcr引物对对应的模板进行扩增，由于前向引物含有t7启动序列，pcr扩增产物为带有t7启动序列的目的片段。将pcr产物放入含有对应crrna，报告rna，t7 rna聚合酶，rntp，rna酶抑制剂，缓冲液的混合溶液中进行检测。使用能采集荧光的仪器进行荧光值读取，通过荧光信号判断检测结果。
46.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
47.(1)本发明以梅毒螺旋体的特异性核酸序列为靶基因，根据靶基因序列设计带有t7启动序列的pcr扩增引物，同时根据靶基因序列设计crispr/cas13a系统介导的crrna。通过pcr扩增以及体外转录两步得到cas13a能够识别的rna，crrna与cas13a蛋白会形成复合体对可识别rna进行切割同时激活附属切割能力，即能非特异性切割周围的带有荧光基团与淬灭基团的单链rna，当此单链rna被切割断裂后会导致荧光值的累积，荧光值的累积增长与是否检测到病原体存在对应关系。本发明具有出色的可靠性，极高的敏感性、特异性，在梅毒的诊断以及分子监测中具有巨大的应用潜力。
48.(2)本发明由于经过pcr与t7 rna聚合酶两轮模板放大，相较于传统核酸检测或其他临床检测具有更高的检测灵敏度和更低的检测下限，同时针对单个样本能够在短时间内获取较多的流行病学信息，是一种高敏感性、高特异性的能够用于临床检测、治疗药物选择建议和分子流行病学监测的梅毒分子诊断工具。
附图说明
49.图1为本发明的原理示意图。
50.图2为本发明基于梅毒螺旋体tpp47检测的敏感性结果图。
51.图3为本发明基于梅毒螺旋体tpp47检测的特异性结果图。
52.图4为本发明基于梅毒螺旋体23s rrna所设计的不同长度的crrna的检测效果图。
53.图5为本发明基于梅毒螺旋体23s rrna检测的敏感性结果图。
54.图6为本发明基于梅毒螺旋体23s rrna检测的特异性结果图。
55.图7为本发明进行梅毒螺旋体分型检测的结果图。
具体实施方式
56.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
57.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中试验，均设置三次重复实验。
58.下述实例中涉及的试剂及其来源如下：
59.本发明公开了一种基于pcr-crispr/cas13a的梅毒螺旋体分子诊断工具，包括了pcr引物与crrna，其中：q5高保真dna聚合酶(neb)，t7 rna聚合酶(neb)，rna酶抑制剂(neb)，rntp mix(neb)，cas13a(广州博徕斯)，报告rna(上海生工)。
60.将设计好的引物与crrna委托生工生物工程(上海)股份有限公司上海合成部进行合成。
61.实施例中所用的单纯疱疹病毒ⅰ型在文献“胡丽庆,褚金国,董晓燕,徐鑫宇,葛玉梅.21445例就诊者血清torch筛查结果分析[j].中国卫生检验杂志,2021,31(07):862-865.”中公开；
[0062]
单纯疱疹病毒ⅱ型在文献“黄进梅,郑和平,曾维英,吴兴中,薛耀华.梅毒患者合并hiv、hcv和hsv病毒感染状况分析[j].岭南皮肤性病科杂志,2009,16(06):406-408.”中
公开；
[0063]
白色念珠菌在文献“王小方,冯红燕,汪磊,李爱香,王国戗.白色念珠菌感染引起机体免疫功能变化研究[j].医药论坛杂志,2021,42(05):1-3 8.”中公开；
[0064]
阴道毛滴虫在文献“石正琪,郑和平,李国明.男性非淋球菌引起的尿道炎病原学研究进展[j].皮肤性病诊疗学杂志,2012,19(03):189-191 194.”中公开；
[0065]
解脲支原体、人型支原体均在文献“林丽英,马芙蓉,郭旭光,夏勇.解脲支原体和人型支原体的液体培养法和固体培养法比较及耐药性分析[j].检验医学与临床,2021,18(19):2791-2794.”中公开；
[0066]
淋病奈瑟菌、沙眼衣原体均在文献“王洪琳,蔡于茂,王峰,叶健滨,张春来,翁榕星,黄俊新,洪福昌,陈祥生.深圳市诊疗机构淋病奈瑟菌和生殖道沙眼衣原体检测能力分析[j].中国艾滋病性病,2021,27(09):1008-1011.”中公开；
[0067]
大肠埃希氏菌在文献“汪碧琼,陶华林.肿瘤科住院患者感染大肠埃希氏菌的特征分析[j].中外医学研究,2018,16(28):175-177.doi:10.14033/j.cnki.cfmr.2018.28.086.”中公开；
[0068]
梅毒螺旋体nichols株在文献“马金翠,木柯达斯.梅毒螺旋体nichols株的液氮冷冻保存及不同传代周期的结果观察[j].中国皮肤性病学杂志,2001(05):32.”中公开；
[0069]
梅毒螺旋体ss14株在文献“魏然,柯吴坚,陈文韬,谭玲俏,刘雅慧,吕萍,黄涛,张君,张晓辉,王柳苑,车雅敏.基于tp0136蛋白异质性建立一种新的苍白密螺旋体分子分型方法[j].中华皮肤科杂志,2020,53(07):546-550.”中公开。
[0070]
本发明的原理示意图如图1所示。
[0071]
实施例1、基于tpp47靶点的梅毒螺旋体pcr-crispr/cas13a检测方法
[0072]
1.本实施例以体外合成的含有tpp47靶点的dna为敏感性检验对象，同时以不同菌种的dna提取物作为特异性检验对象。
[0073]
2.体外模板dna的合成方法
[0074]
根据tpp47靶序列的保守区域，使用一对能够覆盖pcr引物扩增区域序列的引物f/r对梅毒螺旋体dna提取物进行pcr扩增，扩增的体系为：ddh2o 9μl，premix 2x 12.5μl，10μm引物对f/r各1.25μl，待测模板dna 1μl。扩增条件：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。扩增完成的产物使用2％的琼脂糖凝胶电泳进行dna条带的纯化。
[0075]
f：5
′‑
acccatagttgataccacac-3
′
；
[0076]
r：5
′‑
cttcatggttgacagcgagg-3
′
。
[0077]
3.pcr扩增反应
[0078]
反应体系：ddh2o 9μl，premix 2x 12.5μl，10μm引物对f1/r1各1.25μl，待测模板dna 1μl。扩增条件：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。
[0079]
梅毒检测引物正向引物f1：5
′‑
gaaattaatacgactcactatagggtacccaccgtgtctaccacaa-3
′
；
[0080]
梅毒检测引物反向引物r1：5
′‑
cagttgcggttcctcatgaat-3
′
。
[0081]
4.crispr/cas13a检测体系
[0082]
总共25μl体系中，40mm tris-hcl(ph 7.5)，9mm mgcl2，1mm rntps，2000u/ml rna
酶抑制剂，1500u/ml t7 rna聚合酶，225nm crrna，45nm lwcas13a，125nm报告rna，1.25μl pcr扩增反应产物。检测条件为37℃，每5min检测1次，总共连续检测37次，检测所使用的的荧光激发波长为490nm，吸收波长为520nm。
[0083]
梅毒检测crrna：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaactaagacaatgctcactgaggatagtttt-3
′
；
[0084]
报告rna：5
′‑
fam-uuuuu-bhq1-3
′
。
[0085]
5.结果判读
[0086]
每个样本执行三次技术重复，在阴性对照正常的情况下，三次中至少有一次试验出现荧光值的积累则判定为该样本检测为阳性；若在阴性对照正常的情况下，均未出现荧光值的积累则判定为该样本检测为阴性；否则为试验污染。
[0087]
6.分析实验包括：基于tpp47靶点的pcr-crispr/cas13a方法的敏感性测试；基于tpp47靶点的pcr-crispr/cas13a方法的特异性测试。
[0088]
7.实验结果
[0089]
如图2所示：将纯化后的dna模板进行梯度稀释，包括10^5copies/μl，10^4copies/μl，10^3copies/μl，10^2copies/μl，10^1copies/μl，10^0copies/μl，10^-1copies/μl，10^-2copies/μl。利用上述体系进行检测，经过pcr扩增后使用crispr/cas13a体系进行检测，并采集荧光信号。体系以无核酸酶水作为阴性对照，检测体系灵敏度能够到10^0copies/μl。
[0090]
如图3所示：收集泌尿生殖道相关病原菌，包括单纯疱疹病毒ⅰ型(herpes simplex virus-1)，包括单纯疱疹病毒ⅱ型(herpes simplex virus-2)，白色念珠菌(candida albicans)，阴道毛滴虫(trichomonas vaginalis)，沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)，淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)，解脲支原体(ureaplasma urealyticum)，人型支原体(mycoplasma humanum)，大肠埃希氏菌(escherichia coli)。并以梅毒螺旋体(treponema palidum，tpa)的dna模板作为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，利用上述体系进行检测，经过pcr扩增后使用crispr/cas13a体系进行检测，并采集荧光信号。检测结果发现，以梅毒螺旋体的dna模板作为阳性对照与其他病原体核酸信号能够严格区分。体系特异性良好。
[0091]
实施例2、基于23s rrna靶点的梅毒螺旋体pcr-crispr/cas13a检测方法
[0092]
1.本实施例以体外合成的含有23s rrna靶点的dna为敏感性检验对象，同时以不同菌种的dna提取物作为特异性检验对象。
[0093]
2.体外模板dna的合成方法
[0094]
根据23s rrna靶序列的保守区域，使用一对能够覆盖pcr引物扩增区域序列的引物f2/r2对梅毒螺旋体dna提取物进行pcr扩增，扩增的体系为：ddh2o 9μl，premix 2x 12.5μl，10μm引物对f2/r2各1.25μl，待测模板dna 1μl。扩增条件：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。扩增完成的产物使用2％的琼脂糖凝胶电泳进行dna条带的纯化。
[0095]
f2：5
’‑
gtaccgcaaaccgacacag-3’；
[0096]
r2：5
’‑
agtcaaaccgcccacctac-3’。
[0097]
3.pcr扩增反应
[0098]
反应体系：ddh2o 9μl，premix 2x 12.5μl，10μm引物对f3/r3各1.25μl，待测模板dna 1μl。扩增条件：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。
[0099]
梅毒耐药识别引物正向引物f3：5
′‑
gaaattaatacgactcactatagggacgcgagactcggtgaaatttatgtaccgg-3
′
；
[0100]
梅毒耐药识别引物反向引物r3：5
′‑
tcccacctatactacacatggtaaaccaagt-3
′
。
[0101]
4.crispr/cas13a检测体系
[0102]
总共25μl体系中，40mm tris-hcl(ph 7.5)，9mm mgcl2，1mm rntps，2000u/ml rna酶抑制剂，1500u/ml t7 rna聚合酶，225nm crrna1，45nm lwcas13a，125nm报告rna，1.25μl pcr扩增反应产物。检测条件为37℃，每5min检测1次，总共检测37次，检测所使用的的荧光激发波长为490nm，吸收波长为520nm。
[0103]
梅毒耐药识别crrna1：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtctccccgtctaactatgggtaacc-3
′
；
[0104]
针对该耐药突变位点同时设置不同长度的crrna以说明所设计的crrna为最优化的序列，所设计的crrna序列如下：
[0105]
crrna#2(28nt)：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtctccccgtctaactatgggtaaccgg-3
′
；
[0106]
crrna#2(26nt)：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtctccccgtctaactatgggtaacc-3
′
；(即梅毒耐药识别crrna1)
[0107]
crrna#2(24nt)：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtctccccgtctaactatgggtaa-3
′
；
[0108]
crrna#2(22nt)：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtctccccgtctaactatgggt-3
′
；
[0109]
crrna#2(20nt)：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtctccccgtctaactatgg-3
′
；
[0110]
报告rna：5
′‑
fam-uuuuu-bhq1-3
′
。
[0111]
5.结果判读
[0112]
每个样本执行三次技术重复，在阴性对照正常的情况下，三次中至少有一次试验出现荧光值的积累则判定为该样本检测为阳性；若在阴性对照正常的情况下，均未出现荧光值的积累则判定为该样本检测为阴性；否则为试验污染。
[0113]
6.分析实验包括：基于23s rrna靶点的不同长度crrna检测效果的比较；基于23s rrna靶点的pcr-crispr/cas13a方法的敏感性测试；基于23s rrna靶点的pcr-crispr/cas13a方法的特异性测试。
[0114]
7.实验结果
[0115]
如图4所示，分别设计了28nt，26nt，24nt，22nt，20nt的不同长度的crrna，其中26nt长度的crrna为本发明中的crrna1。使用上述体系进行检测，经过pcr扩增后的模板使用crispr/cas13a体系进行检测，并采集荧光信号。结果发现crrna1无论对于a2058g模板还是a2059g模板均具有优于其他长度crrna的检测效果。
[0116]
如图5所示：将纯化后的dna模板进行梯度稀释，包括7.22
×
10^5copies/μl，7.22
×
10^4copies/μl，7.22
×
10^3copies/μl，7.22
×
10^2copies/μl，7.22
×
10^1copies/μl，
7.22
×
10^0copies/μl。利用上述体系进行检测，经过pcr扩增后使用crispr/cas13a体系进行检测，并采集荧光信号。体系以无核酸酶水作为阴性对照，检测体系灵敏度能够到7.22
×
10^1copies/μl。
[0117]
如图6所示：收集泌尿生殖道相关病原菌，包括单纯疱疹病毒ⅰ型，包括单纯疱疹病毒ⅱ型，白色念珠菌，阴道毛滴虫，沙眼衣原体，淋病奈瑟菌，解脲支原体，人型支原体，大肠埃希氏菌。并以梅毒螺旋体含有a2058g的dna模板(tpa(a2058g mutation))与含有a2059g的dna模板(tpa(a2059gmutation))作为阳性对照，无核酸酶水与不含有突变的模板作为阴性对照，利用上述体系进行检测，经过pcr扩增后使用crispr/cas13a体系进行检测，并采集荧光信号。检测结果发现，以梅毒螺旋体含有a2058g的dna模板与含有a2059g的dna模板作为阳性对照与其他病原体核酸信号以及未突变模板能够严格区分。体系特异性良好。
[0118]
实施例3、基于pcr-crispr/cas13a的梅毒螺旋体分型检测方法
[0119]
1.本实施例以梅毒螺旋体的nichols株与ss14株作为测试对象，分别使用基于两种型别的独有tp0548基因的保守区域的pcr引物与crrna进行检测。
[0120]
2.pcr扩增反应
[0121]
反应体系：ddh2o 9μl，premix 2x 12.5μl，10μm引物对f4/r4各1.25μl，待测模板dna 1μl。扩增条件：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。
[0122]
梅毒分型引物正向引物f4：5
′‑
gaaattaatacgactcactataggggcaaagaactttggctcaaatgagccgaac-3
′
；
[0123]
梅毒分型引物反向引物r4：5
′‑
gcagcccgagactgaacaaaaacgcataca-3
′
。
[0124]
3.crispr/cas13a检测体系
[0125]
总共25μl体系中，40mm tris-hcl(ph 7.5)，9mm mgcl2，1mm rntps，2000u/ml rna酶抑制剂，1500u/ml t7 rna聚合酶，225nm crrna-nichols或crrna-ss14，45nm lwcas13a，125nm报告rna，1.25μl pcr扩增反应产物。检测条件为37℃，每5min检测1次，总共检测37次，检测所使用的的荧光激发波长为490nm，吸收波长为520nm。
[0126]
梅毒分型crrna-nichols：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtgttcgacttggcaactgtttgttt-3
′
；
[0127]
梅毒分型crrna-ss14：5
′‑
gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgtttgacgtcgctatcctttgttttta-3
′
。
[0128]
报告rna：5
′‑
fam-uuuuu-bhq1-3
′
。
[0129]
4.结果判读
[0130]
每个样本执行三次技术重复，在阴性对照正常的情况下，三次中至少有一次试验出现荧光值的积累则判定为该样本检测为阳性；若在阴性对照正常的情况下，均未出现荧光值的积累则判定为该样本检测为阴性；否则为试验污染。
[0131]
5.分析实验包括：分别使用两种不同型别的梅毒螺旋体菌株，nichols株与ss14株，对两种不同的crrna分别进行测试，以验证相互是否存在交叉反应。
[0132]
6.实验结果
[0133]
如图7所示：分别使用含有两种不同crrna的检测体系对两种菌株进行分别测试。利用上述体系，经过pcr扩增后使用crispr/cas13a体系进行检测，并采集荧光信号。体系以无核酸酶水作为阴性对照，两种对应的crrna能够严格区分对应的型别，并且相互之间没有
交叉反应。
[0134]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。