一种鉴别检测PCV2与PCV3病毒的RPA-侧向层析检测方法与流程

一种鉴别检测pcv2与pcv3病毒的rpa-侧向层析检测方法
技术领域
1.本发明涉及动物疫病病原检测技术领域，具体为一种鉴别检测pcv2与pcv3病毒的rpa-侧向层析检测方法。


背景技术：

2.专利号为cn201710484041.6，一种用于同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的多重rpa引物和探针，所述多重rpa引物和探针是由检测新城疫病毒的引物和探针、检测传染性支气管炎病毒的引物和探针、检测h9n2亚型禽流感病毒的引物和探针组成，本发明多重rpa引物和探针特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还公开了一种多重rpa同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的方法，该方法包括引物合成、模板rna提取、反转录、多重pcr扩增及扩增产物分析等步骤，该检测方法操作简单，稳定性好，为有效检测和鉴别常见禽呼吸道疾病的混合感染提供一种成本低、快速、特异的现场诊断方法。
3.专利号为cn201710984183.9，一种rt-rpa与侧向流动层析技术相结合快速检测猪嵴病毒的特异性引物和探针，建立了rt-rpa与侧向流动层析技术相结合的猪嵴病毒快速检测方法，该方法最低可检测到6.4
×
103copies/μl的猪嵴病毒rna，灵敏度远高于使用现有pcr检测该病毒的灵敏度，并且该方法最早可在反应开始后10min时检出猪嵴病毒，10-15分钟min内即可完成检测，利用所设计的特异性引物和探针对猪嵴病毒进行快速检测，对猪嵴病毒特异性强，仅凭肉眼就可以直观的查看检测结果，检测过程方便快捷，检测结果安全可靠。
4.上述专利均介绍了通过rpa侧向层析技术检测方法，检测的灵敏性和检测速度较低，无法实现一次扩增检测二个目的基因检测，检测效率低，设备较为复杂，无法保证结果的准确性。


技术实现要素：

5.解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种鉴别检测pcv2与pcv3病毒的rpa-侧向层析检测方法，解决了用于pcv2与pcv3病毒的快速检测及鉴别，有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测时间短，结果可肉眼观察的优点，弥补了常规检测方法的不足，对于圆环病毒的防控和治疗有很好的实用价值。
7.技术方案
8.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种鉴别检测pcv2与pcv3病毒的rpa-侧向层析检测方法，检测试剂包括pcv2上游引物、pcv2探针、pcv2下游引物、pcv3上游引物、pcv3探针、pcv3下游引物、样品垫和nc膜，所述nc膜由抗fitc抗体和抗地高辛抗体组成的t1检测线和t2检测线，由小鼠抗链霉亲和素抗体组成的c线。
9.优选的，所述pcv2与pcv3上游引物序列为：
10.pcv2上游引物5'-ctacatttccagtagtttgtagtctcagcc-3'
11.pcv3上游引物5'-cctcttcgggtaccagatcggatcttcaag-3'。
12.优选的，所述pcv2与pcv3下游引物5'端标记为为生物素修饰，且pcv2与pcv3下游引物分别为：
13.pcv2下游引物biotin-5'-cataacccagcccttctcctaccactcccgc-3'
14.pcv3下游引物biotin-5'-caaatggaacccacccataaaaatcatccag-3。
15.8.优选的，所述pcv2探针为fitc修饰，pcv3探针为地高辛修饰
16.pcv2探针
17.fitc-tgatttcttttgttgtttggttggaagtaat(thf)caatagtggaatctaggac-c3
18.spacer
19.pcv3探针
20.dig-gaagttgcggagaagatgcctgcagtattta(thf)tacgctatgggcggg-c3spacer。
21.优选的，所述pcv2的扩增产物里，5'端标记有fitc，3'端标记有生物素，所述pcv3的扩增产物里，5'端标记有地高辛，3'端标记有生物素，所述扩增产物加到侧向层析试纸条样品垫上形成金标复合物，且金标复合物由pcv2、pcv3扩增产物的3'端生物素与金标链酶亲和素结合组成。
22.优选的，所述侧向层析试纸条中样品垫上包含胶体金颗粒标记的链霉亲和素。
23.优选得，所述的nc膜上包含由抗fitc抗体和抗地高辛抗体组成的t1检测线和t2检测线，由小鼠抗链霉亲和素抗体组成的c线。
24.一种鉴别检测pcv2与pcv3病毒的rpa-侧向层析检测步骤，包括如下步骤：
25.sp1：待测样品dna提取：提取待测样品基因组dna，回收保存；
26.sp2：rpa扩增：以待测样品的dna为模板，将pcv2盒pcv3的引物探针加入到rpa扩增反应液中，进行rpa扩增；
27.sp3:扩增产物检测：将扩增产物稀释后滴在侧向层析试纸条上，待反应5-10分钟，根据显色条带进行结果判定
28.有益效果
29.本发明提供了一种鉴别检测pcv2与pcv3病毒的rpa-侧向层析检测方法。
30.具备以下有益效果：
31.1、本发明将rpa恒温扩增检测技术与侧向层析试纸条相结合，具有高度特异性与灵敏度，且检测快速，无需特殊设备检测结果可通过试纸条肉眼判读，非常简单方便。
32.2、本发明采用rpa恒温扩增技术，反应时间仅需20min,与产检的猪源病毒无交叉反应，灵敏度高，特异性强。
33.3、本发明同时采用侧向层析试纸条，无需特殊设备。在满足快速筛选的同时能够保证结果快速准确。
附图说明
34.图1为本发明的检测结果图；
35.图2为本发明的基因流程图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.实施例一：
38.如图1-2所示，本发明实施例提供一种鉴别检测pcv2与pcv3病毒的rpa-侧向层析检测方法，检测所用试剂包含pcv2上游引物，pcv2探针，pcv2下游引物，pcv3上游引物，pcv3探针，pcv3下游引物、样品垫，nc膜由抗fitc抗体和抗地高辛抗体组成的t1检测线和t2检测线，由小鼠抗链霉亲和素抗体组成的c线，c线主要起到质控实验是否成立的作用。
39.pcv2与pcv3上游引物序列为：
40.pcv2上游引物5'-ctacatttccagtagtttgtagtctcagcc-3'
41.pcv3上游引物5'-cctcttcgggtaccagatcggatcttcaag-3'。
42.pcv2与pcv3下游引物5'端为生物素(biotin)修饰：
43.pcv2下游引物biotin-5'-cataacccagcccttctcctaccactcccgc-3'
44.pcv3下游引物biotin-5'-caaatggaacccacccataaaaatcatccag-3。
45.pcv2探针为fitc修饰，pcv3探针为地高辛修饰
46.pcv2探针
47.fitc-tgatttcttttgttgtttggttggaagtaat(thf)caatagtggaatctaggac-c3
48.spacer；
49.pcv3探针
50.dig-gaagttgcggagaagatgcctgcagtattta(thf)tacgctatgggcggg-c3spacer。
51.pcv2的扩增产物里，5'端标记有fitc，3'端标记有生物素(biotin)，pcv3的扩增产物里，5'端标记有地高辛(dig),3'端标记有生物素(biotin)，在扩增产物加到侧向层析试纸条样品垫上之后，pcv2、pcv3扩增产物的3'端生物素与金标链酶亲和素结合，形成金标复合物之后继续向上层析，如果金标复合物中有pcv3产物时，5'端的地高辛(dig)会与t2线上固定的小鼠抗地高辛(dig)抗体结合。金标复合物结合在t2线检测线上，t2线位置显示红色，如果金标复合物中有pcv2产物时，5'端的fitc会与t1线上固定的小鼠抗fitc抗体结合。金标复合物结合在t1线检测线上，t1线位置显示红色，侧向层析试纸条中样品垫上包含胶体金颗粒标记的链霉亲和素，所述的nc膜上包含由抗fitc抗体和抗地高辛抗体组成的t1检测线和t2检测线，由小鼠抗链霉亲和素抗体组成的c线。
52.实施例二：
53.如图1-2所示，一种鉴别检测pcv2与pcv3病毒的rpa-侧向层析检测步骤，包括如下步骤：
54.sp1：待测样品dna提取：提取待测样品基因组dna，回收保存；
55.sp2：rpa扩增：以待测样品的dna为模板，将pcv2盒pcv3的引物探针加入到rpa扩增反应液中，进行rpa扩增；
56.sp3：扩增产物检测：将扩增产物稀释后滴在侧向层析试纸条上，待反应5-10分钟，根据显色条带进行结果判定。
57.pcv2基因片段：
58.ttaagattaaattctctgaattgtacatacatggttacacggatattgtattcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttccagtagtttgtagtctcagccacagctgatttcttttgttgtttggttggaagtaatcaatagtggaatctaggacaggtttgggggtaaagtagcgggagtggtaggagaagggctgggttatg；
59.pcv3基因片段：
60.cctcttcgggtaccagatcggatcttcaagcagcagctcggattctgacggagacgtcgggaaatctgactgaagttgcggagaagatgcctgcagtatttatacgctatgggcggggtttgcgtgatttttgcggggtgatggggttgggtaaaccgcgtgattttaaaactgaagtttatgtttttattggtcctccaggatgcgggaaaacgcgggaagcttgtgcggatgcggctgcgcgggaattgcagttgtatttcaagccacgggggccttggtgggatggttataatggggagggtgctgttattctggatgatttttatgggtgggttccatttg。
61.根据sp2中rpa扩增反应液中引物探针加入比例如下：
[0062][0063]
将42.5μlrpa扩增反应液加入反应管中，将5μl dna模板加入反应管中，将2.5μl乙酸镁加在反应管盖上，加入模版后，密封反应管，放入恒温振荡混匀仪，完成混匀之后进行扩增，扩增程序为：恒温39℃反应，扩增20分钟。
[0064]
根据sp3中的显色条，如若如图1-a所示，仅有质控线有显色，则表示待测样品中不含有pcv2与pcv3病毒；
[0065]
若如图1-b所示，试纸条t1检测线与质控线都有显色，则表示待测样品中含有pcv2病毒；
[0066]
若如图1-c所示，试纸条t2检测线与质控线都有显色，则表示待测样品中含有pcv3病毒；
[0067]
若如图1-d所示，试纸条t1检测线、t2检测线与质控线都有显色，则表示待测样品中同时含有pcv2与pcv3病毒；
[0068]
若检测线与质控线均无显色，则表示无扩增或试纸条无效。
[0069]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要
素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个引用结构”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0070]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。