具有降血压功能的ACE抑制肽-ACEIP及其基因工程制备方法

具有降血压功能的ace抑制肽-aceip及其基因工程制备方法
技术领域
1.本发明涉及具有降血压功能的ace抑制肽-aceip及其基因工程制备方法，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.高血压是引发心血管疾病的重要危险因子，可引发心力衰竭、动脉粥样硬化、心肌梗塞等系列慢性疾病，严重地危害着人类的健康及生命安全。目前，常见降压药多为化学合成药物如利尿剂、卡托普利等，在发挥降压治疗作用的同时带来一些不良反应，如低血压、干咳等，因此，从天然食物中提取毒副作用小、安全性高的降血压功能因子已成为全球研发的热点领域。
3.血管紧张素转化酶(angiotensin i converting enzyme，ace)是一种锌离子金属肽酶，它在肾素-血管紧张素调节系统(ras)和激肽释放酶-激肽系统(kks)起着重要作用。在ras系统中，ace可作用于血管紧张素ⅰ生成血管紧张素ⅱ，刺激血管平滑肌收缩，血压升高；血管紧张素ⅱ可促进分泌醛固酮，其可作用于肾脏，导致钠储量和血溶量增加，从而血压增高；在kks系统中，ace会作用于具有血管舒张功能的舒缓激肽失活，导致血压升高。因此需要抑制ace酶的活性，使血压降低。
4.降血压肽又称为血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ace)抑制肽。ace抑制肽对ace酶的亲和力远大于血管紧张素ⅰ对ace酶的亲和力，可与血管紧张素ⅰ竞争ace酶，降低或抑制ace酶的活性，促使血管紧张素ⅱ的生成量减少，减少舒缓激肽的失活，从而降低血压。
5.ace抑制肽具有安全性高、效果专一无副作用、易被人体消化、稳定性好等多种优点。ace抑制肽的制备方法有多种，其中，直接提取法、蛋白酶解法、化学合成法制备降血压肽，肽得率低、成本高、分离纯化困难，而通过基因工程法制备降血压肽(即将含有降血压肽基因片段的载体转入宿主菌中，培养宿主菌使之表达降血压肽)可实现目的多肽的高效表达，从而克服以上缺点、降低生产成本，为肽类药物的开发提供了物质基础。
6.然而，由于小分子肽小，易被宿主蛋白酶和肽酶识别并降解为无活性的寡肽片段。虽然将小分子肽与宿主标签蛋白融合表达有利于提高多肽的稳定性降低产物毒性和提高表达量，但是会导致目的肽在融合蛋白中所占比例小，造成宿主表达潜能浪费，减小标签蛋白长度又会降低蛋白稳定性。


技术实现要素：

7.[技术问题]
[0008]
本发明要解决的技术问题是基因工程法制备降血压肽时，肽得率低、宿主表达潜能浪费等问题。
[0009]
[技术方案]
[0010]
本发明提供了能够表达降血压肽的大肠杆菌基因工程菌，所述大肠杆菌基因工程
菌携带重组表达载体，所述重组表达载体携带编码串联小分子肽的基因，所述串联小分子肽是(wqvlpnavpak)6。
[0011]
所述重组表达载体是在pet30a( )的ndeⅰ和hindⅲ酶切位点之间连接编码组氨酸标签和肠激酶的基因、编码串联小分子肽的基因；编码组氨酸标签、肠激酶、串联小分子肽的基因如seq id no：1所示，添加酶切位点后如seq id no：2所示。
[0012]
所述串联小分子肽的n端连接了组氨酸标签和肠激酶之后，氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0013]
所述大肠杆菌基因工程菌的宿主是e.coli bl21(de3)。
[0014]
本发明还提供了所述的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，具体步骤包括：
[0015]
步骤一：人工合成seq id no.2所示的基因，克隆至载体puc中，将其转入到e.coli dh5α中，筛选出阳性转化子；
[0016]
步骤二：将步骤一中获得的阳性转化子经ndeⅰ和hindⅲ双酶切后获得的目的片段，与经过ndeⅰ和hindⅲ双酶切后的表达载体pet30a( )连接构建得到重组表达质粒；
[0017]
步骤三：将步骤二中获得的重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞e.coli bl21(de3)感受态细胞中，采用含kana的lb抗性平板筛选出阳性工程菌pet30a-aceip，即为大肠杆菌基因工程菌。
[0018]
本发明还提供应用所述大肠杆菌基因工程菌制备降压肽的方法，包括以下步骤：
[0019]
挑取大肠杆菌pet30a-aceip阳性单菌落，接种于5ml的lb培养基中，37℃、200r/min培养过夜；按照1.5％的接种量接种于lb培养基中，于37℃、200r/min培养至od
600
0.6-0.8之间；加入终浓度为1mmol/l iptg在30℃诱导6h，离心收集菌体，将菌体破碎后，进行离心，收集沉淀，将沉淀溶解后，离心收集上清液，将上清液采用活化的ni柱亲和层析纯化获得降压肽。
[0020]
所述破碎是超声破碎，超声功率285w，超声2s，停止3s，总超声时间15min。
[0021]
本发明还提供一种降压肽，氨基酸序列是(wqvlpnavpak)6，即seq id no：7。可用于制备降压产品。
[0022]
[有益效果]
[0023]
本发明将小分子肽基因串联在大肠杆菌中表达，能够克服短肽不易表达的问题，加了多肽的基因数量，促使其进行表达，通过优化表达条件来提高表达量，这种串联表达的方式能够使多肽能耐受菌体的酶系统，有效屏蔽宿主毒性，不易被降解，获得的肽具有降血压功能，可为降血压肽的发展提供物质可能。
附图说明
[0024]
图1是重组表达质粒pet30a-aceip构建示意图。
[0025]
图2是表达pet30a-aceip的大肠杆菌的sds-page电泳图，其中m为蛋白质marker，泳道1是未经iptg诱导的重组菌体蛋白，泳道2是表达aceip的大肠杆菌经iptg诱导后产生的重组菌体蛋白。
[0026]
图3是重组表达载体pet30a-aceip-1构建示意图。
[0027]
图4是表达pet30a-aceip-1的大肠杆菌的sds-page电泳图，其中m为蛋白质marker，泳道1是不含有aceip-1基因的未经iptg诱导的重组菌体蛋白，泳道2是不含有
aceip-1基因的经iptg诱导后的重组菌体蛋白，泳道3是表达aceip-1的大肠杆菌未经iptg诱导产生的重组菌体蛋白，泳道4是表达aceip-1的大肠杆菌经iptg诱导后产生的重组菌体蛋白。
[0028]
图5培养基对重组菌株表达量的影响。泳道从左向右分别代表：marker、lb培养且未经iptg诱导的重组蛋白、lb培养且iptg诱导、tb培养且iptg诱导、2
×
yt培养且iptg诱导、sob培养且iptg诱导、soc培养且iptg诱导。
[0029]
图6诱导温度对蛋白表达量的影响。m为蛋白电泳marker，泳道1-6分别代表：诱导温度分别为18℃、20℃、25℃、28℃、30℃、37℃。
具体实施方式
[0030]
下述实例中涉及的培养基如下：
[0031]
lb液体培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph自然。
[0032]
lb固体培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15g/l。
[0033]
重组降血压肽aceip的分离纯化：挑取单个阳性工程菌的单菌落，接种于5ml的lb培养基中，37℃，200r/min，培养过夜；按照1.5％的接种量转接种于100ml的lb培养基中，37℃、200r/min培养至od
600
0.6-0.8之间；加入终浓度为1.0mmol/l的iptg于30℃诱导6h后，离心收集菌体。加入10ml的细菌裂解液(50mmol/l tris-hcl，100mmol/l nacl，1mmol/l edta，ph8.0)，冰浴超声破碎(超声功率285w，间隙工作2s，停止3s，工作时间15min)，于4℃、8000r/min离心15min，收集沉淀。利用5ml的洗涤液ⅰ(50mmol/l tris-hcl，100mmol/l nacl，0.5％triton x-100，1mmol/l edta，ph8.0)洗涤沉淀，室温放置5分钟，4℃、8000r/min，离心10min，收集沉淀。所得沉淀再用5ml洗涤液ⅱ(50mmol/l tris-hcl，100mmol/l nacl，ph8.0)洗涤两次，每次静置5min，4℃、8000r/min，离心10min，收集沉淀。用5ml溶解液(50mmol/l tris
–
hcl，ph 8.0，500mmol/l nacl，8mol/l尿素)重悬洗涤后的包涵体沉淀，于磁力搅拌器上4℃搅拌(100r/min)溶解4h，4℃、8000r/min，离心10min，收集上清液。采用活化的ni柱亲和层析纯化获得重组蛋白。将洗脱获得的重组蛋白溶液装在透析袋中于复性液(25mmol/l tris-hcl，ph 8.0，0.15mol/l nacl，1mmol/l edta，1.5mmol/l gsh，0.3mmol/l gssg，5％甘油，尿素浓度分别：4m、2m、1m或0m，ph 8.0)中进行梯度透析，每隔12h换一次透析液。收集透析液。
[0034]
实施例1大肠杆菌基因工程菌的构建
[0035]
步骤一：为了实现降血压肽aceip的表达，将来源于乳酪蛋白的血管紧张素转换酶ace抑制肽(wqvlpnavpak)通过串联6次的方式人工合成串联小分子肽，同时在编串联小分子肽的目的基因之前添加编码组氨酸标签和肠激酶的基因序列，经过大肠杆菌偏爱密码子优化得到编码混合串联多肽aceip的基因序列(seq id no.1)，并在基因序列两端添加ndeⅰ和hindⅲ的酶切位点得到seq id no.2所示序列。
[0036]
步骤二：将连有ndeⅰ和hindⅲ的酶切位点的编码混合多肽aceip的基因(seq id no.2)，与用限制性内切酶ndeⅰ和hindⅲ双酶切的pet30a质粒，用t4连接酶过夜连接，构建得到重组表达质粒。
[0037]
步骤三：将步骤二中所获的重组表达质粒转入大肠杆菌e.coli dh5α感受态细胞中，用含卡那霉素(kana)的培养基筛选重组阳性菌，从阳性重组菌中提取目的阳性重组表
达质粒，然后转化至e.coli bl21(de3)感受态中，用含卡那霉素(kana)的培养基筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌pet30a-aceip。
[0038]
与此同时，参照步骤一至三，构建另一个大肠杆菌基因工程菌pet30a-aceip-1，该工程菌与大肠杆菌基因工程菌pet30a-aceip的区别在于，编码(wqvlpnavpak)6的基因替换为编码(wqvlpnavpak-avpypqr)3的串联多肽aceip-1的基因，编码串联多肽aceip-1的不含酶切位点的基因序列如seq id no.4所示，含酶切位点的基因序列如seq id no.5所示，含组氨酸标签的(wqvlpnavpak-avpypqr)3的氨基酸序列如seq id no.6所示。
[0039]
实施例2应用大肠杆菌基因工程菌制备降血压肽
[0040]
(1)实验组：降血压肽基因工程表达菌pet30a-aceip的表达。
[0041]
将构建的大肠杆菌基因工程菌pet30a-aceip单个阳性单菌落接种于5ml的lb培养基中，37℃，200r/min，培养过夜；按照1％的接种量接种于100ml的lb培养基中，37℃，200r/min培养至od
600
0.6-0.8之间；加入终浓度为1mmol/l的iptg于30℃诱导6h后，取发酵培养液1ml，于12000r/min离心15min，收集菌体沉淀，将菌体超声破碎后，收集沉淀，利用tricine-sds-page电泳检测。
[0042]
结果如图2所示，pet30a-aceip在分子量为8.7kda处有明显的条带出现，表明基aceip成功表达出来。
[0043]
(2)对照组：应用大肠杆菌基因工程菌aceip-1表达降血压肽aceip-1
[0044]
对照组：挑取大肠杆菌基因工程菌aceip-1的单个阳性单菌落接种于5ml的lb培养基中，37℃，200r/min，培养过夜；按照1.5％的接种量接种于100ml的lb培养基中，37℃，200r/min培养至od6000.6-0.8之间；加入终浓度为1.0mmol/l的iptg于30℃诱导6h后，取1ml发酵培养液，于12000r/min离心15min，收集菌体沉淀，将菌体超声破碎后，收集沉淀，利用tricine-sds-page电泳检测。
[0045]
结果见图4，未携带aceip-1编码基因的重组大肠杆菌，无论是否用iptg诱导，都没有检测到aceip-1条带；而携带aceip-1编码基因的的重组大肠杆菌，同样无论是否用iptg诱导，在分子量为7.5kda处未见条带，即没有检测到aceip-1条带，且在后续的实验中未能通过镍柱纯化出来，也未检测到该肽降血压的活性，可见aceip-1未能成功表达。
[0046]
实施例3应用不同培养基培养大肠杆菌基因工程菌制备降血压肽
[0047]
大肠杆菌基因工程菌pet30a-aceip用lb液体培养基活化后，按照1.5％的接种量分别接种于含有50ml的lb、tb、2
×
yt、sob、soc液体培养基的三角烧瓶中，于37℃、200r/min的恒温摇床中培养od
600
为0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为1mmol/l，30℃诱导培养6h，4℃，8000r/min离心20min，收集菌体。将收集到的菌体进行超声破碎，取0.5ml的破碎液，4℃、8000r/min离心15min，收集菌体沉淀，破碎后离心取沉淀，进行tricine-sds-page电泳检测。
[0048]
结果如图5所示：重组蛋白在lb和2
×
yt培养基中表达含量都较高，但是在2
×
yt培养基中由于更加丰富的营养导致杂蛋白含量的增加，目的蛋白所占的百分含量有所降低，且2
×
yt培养基的成本更高。
[0049]
实施例4应用不同诱导温度诱导大肠杆菌基因工程菌制备降血压肽
[0050]
大肠杆菌基因工程菌pet30a-aceip用lb液体培养基活化后，按照1.5％的接种量接种于含有50ml的lb液体培养基的三角烧瓶中，于37℃、200r/min的恒温摇床中培养od600
为0.6-0.8时，加入iptg至终浓度分别为1.0mmol/l，分别于18℃、20℃、25℃、28℃、30℃、37℃诱导培养6h，4℃，8000r/min离心20min，收集菌体。将收集到的菌体进行超声破碎，取0.5ml的破碎液，4℃，8000r/min离心15min，收集菌体沉淀，破碎后离心取沉淀，进行tricine-sds-page电泳检测。
[0051]
温度对诱导工程菌表达蛋白含量的影响如图6所示。由图6可知，发酵温度对降血压肽的aceip的表达有着显著的影响。随着发酵温度的升高，蛋白表达的含量也在增加，当诱导表达温度为30℃时，蛋白表达含量最高。
[0052]
实施例5应用大肠杆菌基因工程菌制备降血压肽及其分离纯化
[0053]
挑取大肠杆菌基因工程菌pet30a-aceip单菌落，接种于5ml的lb培养基中，37℃，200r/min，培养过夜；按照1.5％的接种量转接种于100ml的lb培养基中，37℃、200r/min培养至od
600
0.6-0.8之间；加入终浓度为1.0mmol/l的iptg于30℃诱导6h后，离心收集菌体。加入10ml的细菌裂解液(50mmol/l tris-hcl，100mmol/l nacl，1mmol/l edta，ph8.0。)，冰浴超声破碎(超声功率285w，间隙工作2s，停止3s，工作时间15min)，于4℃、8000r/min离心15min，收集沉淀。利用5ml的洗涤液ⅰ(50mmol/l tris-hcl，100mmol/l nacl，0.5％triton x-100，1mmol/l edta，ph8.0)洗涤沉淀，室温放置5分钟，4℃、8000r/min，离心10min，收集沉淀。所得沉淀再用5ml洗涤液ⅱ(50mmol/l tris-hcl，100mmol/l nacl，ph8.0)洗涤两次，每次静置5min，4℃、8000r/min，离心10min，收集沉淀。用5ml溶解液(50mmol/l tris
–
hcl，ph 8.0，500mmol/l nacl，8mol/l尿素)重悬洗涤后的包涵体沉淀，于磁力搅拌器上4℃搅拌(100r/min)溶解4h，4℃、8000r/min，离心10min，收集上清液。采用活化的ni柱亲和层析纯化获得重组蛋白。将洗脱获得的重组蛋白溶液装在透析袋中于复性液(25mmol/l tris-hcl，ph 8.0，0.15mol/l nacl，1mmol/l edta，1.5mmol/l gsh，0.3mmol/l gssg，5％甘油，尿素浓度分别：4m、2m、1m或0m，ph 8.0)中进行梯度透析，每隔12h换一次透析液。收集透析液。
[0054]
实施例6重组降血压肽的降压功能检测
[0055]
检测所用的多肽是按照前述“重组降血压肽aceip的分离纯化”方法制备的透析液。
[0056]
体外活性检测采用以hhl(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)为血管紧张素ⅰ的模拟物，hhl被血管紧张素转换酶分解后生成马尿酸(hip)和二肽(hl)，通过hplc测定马尿酸的产量，分析重组降血压肽的体外降血压活性。
[0057]
具体的操作步骤为：于2ml的ep管中加入80μl的5mmol/l hhl溶液(溶解在0.1mol/l含0.3mol/l氯化钠的硼酸盐缓冲液中，ph＝8.3)，加入40μl的ace抑制肽溶液，此混合液短暂离心混匀后放入37℃恒温水浴中保温5min，逐管加入20μl的ace酶液(0.1u/ml)，37℃恒温保育30min；加入200μl的1mol/l hcl溶液终止反应，得到反应液，作为样品组。
[0058]
空白组在加入ace酶液(将ace粉末溶液溶于上述硼酸盐缓冲溶液(0.1mol/l ph 8.3的硼酸-硼砂缓冲溶液(含有0.3m nacl))中，配制成0.1un/ml的溶液)的同时加入盐酸，对照组使用40μl的双蒸水代替样品溶液。反应完成后用hplc检测样品组马尿酸(ha)的含量。
[0059]
hplc色谱条件：色谱柱(sepax gp-c18，4.6
×
250mm)，柱温25℃，流动相a:0.05％tfa-h2o，流动相b:0.05％tfa-乙腈，流动相a:b＝75％:25％，流速1ml/min，检测波长：
228nm，进样量：10μl，分析时间：30min。ace抑制率(％)＝(a1-a2)/(a1-a3)
×
100％。其中a1、a2、a3分别是对照组、样品组、空白组中ha的峰面积。
[0060]
分析结果表明，重组降血压肽的ace抑制率为64.8％，说明重组的降血压肽具有良好的ace酶抑制活性。