一种江黄颡鱼性别相关SNP分子标记及其应用的制作方法

一种江黄颡鱼性别相关snp分子标记及其应用
技术领域
1.本技术涉及snp分子标记技术领域，尤其涉及一种江黄颡鱼性别相关snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.黄颡鱼个体小，肉质鲜美，肌间刺少，是我国重要的水产品，近几年黄颡鱼养殖可以说非常火爆，在特种养殖领域占有很高的比重，一直保持着相对较高且稳定的市场价格和养殖效益，受到广大养殖户的追捧。2019年全国黄颡鱼养殖产量超过了50万吨，并且仍在持续增长。以江黄颡鱼为父本和黄颡鱼母本杂交而来的杂交黄颡鱼，具有生长速度快，适温范围广，饲料系数低，抗病能力强等优势，是黄颡鱼养殖的当家品种。由于雌鱼生长速度明显小于雄鱼，存在出塘鱼体规格差异大，雌鱼卖价低等问题，培育全雄杂交黄颡鱼将可以很好的解决这些问题，具有重要的经济效益。
3.目前，江黄颡鱼单性育种技术研究较少，国内外还没有江黄颡鱼性别特异分子标记的报道。因此开发江黄颡鱼性别特异的分子标记对于培育全雄杂交黄颡鱼具有重要的生产应用价值。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本技术的目的在于提供一种江黄颡鱼性别相关snp分子标记及其应用，以在一定程度上解决上述技术问题之一。
5.第一方面，本技术实施例公开了一种江黄颡鱼性别相关snp分子标记，所述snp分子标记为seq id no.1所示序列自5’端起第100、101位碱基，分别是tc或at。
6.本技术实施例中，所述snp分子标记为tc/at杂合基因型的个体为雄性江黄颡鱼，所述snp分子标为tc纯合基因型的个体为雌性江黄颡鱼。
7.第二方面，本技术实施例提供了一组用于扩增本技术第一方面snp分子标记seq id no.1序列的引物对，其序列如下：
8.p1:如seq id no.2所示；
9.p2:如seq id no.3所示。
10.第三方面，本技术实施例提供了一种鉴定江黄颡鱼遗传性别的方法，包括以下步骤：
11.提取江黄颡鱼待检样本基因组dna；
12.以第二方面所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；
13.对所述pcr产物进行分组后，获得分离曲线，从而鉴定江黄颡鱼雌、雄性别。
14.本技术实施例中，所述分离曲线为两条分开的曲线，其中一条为杂合snp分子标记的显示结果，另一条为纯合snp分子标记的显示结果，分别代表雄性和雌性样本；
15.本技术实施例中，所述纯合snp分子标记，即指两条同源基因上的snp位点是同样的碱基，所述杂合snp分子标记，即指两条同源基因上的snp位点是不同的碱基；
16.本技术实施例中，以实际解剖获得的性别结果对上述鉴定结果进行验证。
17.第四方面，本技术实施例提供了一种检测所述snp标记的试剂盒，所述试剂盒包含第二方面所述引物以及其他用于扩增所述snp标记的试剂。
18.第五方面，本技术实施例提供了第一方面所述snp分子标记的筛选方法，其步骤包括：
19.获得原始序列集，所述原始序列集是对dna样本的进行全基因组测序得到的原始序列集合构成，所述dna样本包括雄性混合池、雌性混合池、8个雄性单样本和8个雌性单样本；
20.获得参考序列，所述参考序列是将所述原始序列分别进行过滤和电子酶切以得到分别与所述雄性混合池、所述雌性混合池、所述8个雄性单样本和所述8个雌性单样本对应的酶切片段集，挑选具有数量较多的特异片段的雄性单样本或中雌性单样本对应的酶切片段集进行串联，即为参考序列；
21.获得候选snps，将所述参考序列与来源于所述雄性混合池的酶切片段集或来源于所述雌性混合池的酶切片段集与所述参考序列比对，从对应的酶切数据集中得到与参考序列不一致具有单核苷酸多态性位点的序列，以作为候选snps；以及
22.获得与与江黄颡鱼性别相关snp分子标记。
23.本技术实施例中，获得参考序列的步骤具体包括：
24.将所述原始序列集过滤以得到过滤序列集；
25.将所述过滤序列集进行电子酶切以得到酶切片段集，所述酶切片段集包括来源于所述雄性混合池的第一酶切片段集、来源于所述雌性混合池的第二酶切片段集、来源于所述8个雄性单样本的8个第三酶切片段集以及来源于所述8个雌性单样本的8个第四酶切片段集；
26.进行第一比对，是将所述第一酶切片段集与所述第二酶切片段集进行比对，以获得仅存在于所述第一酶切片段集的第一特异片段以及仅存在于所述第二酶切片段集的第二特异片段；
27.进行第二比对，是比较所述第三酶切片段集中包含的所述第一特异化片段的数量与在所述第四酶切片段集中包含的所述第二特异化片段的数量大小：
28.若第一特异片段在第三酶切片段集中出现的数量大于第二特异片段的数量，则对随机挑选1个雄性单样本对应的过滤序列集中的全部过滤序列进行串联，以作为参考序列；反之，则对随机挑选1个雌性单样本对应的过滤序列集中的全部过滤序列进行串联，以作为参考序列。
29.在本实施例中，获得候选snps的步骤具体包括：
30.进行第三比对，将所述参考序列与所述第一酶切片段集或所述第二酶切片段集进行比对，从所述第二酶切片段集或第一酶切片段集中得到与参考序列不一致的具有snps的序列，以作为候选snps。
31.在本实施例中，从所述第二酶切片段集或所述第一酶切片段集中得到与参考序列不一致的具有snps的序列的条件包括以下至少一项：
32.所述候选snps是否出现在同一个150bp长度的第二酶切片段集或第一酶切片段集中；
33.所述候选snps是否出现同一个150bp长度的第二酶切片段集或第一酶切片段集的同一个酶切片段中且相距不超过30bp；以及
34.所述候选snps是否出现在同一个150bp长度的第二酶切片段集或第一酶切片段集中次数较多。
35.在本技术实施例中，获得与江黄颡鱼性别相关snp分子标记的步骤具体包括：
36.进行第四比对，含有候选snps的序列分别与来源于8个雄性单样本和8个雌性单样本的过滤序列数据集进行比对，以判断含有候选snps的序列在8个雄性单样本中是否全部为杂合的，以及在8尾雌性单样本中是否都是纯合的：如果是则可确定为待选snps，否则即可排除；
37.对待选snps设计引物，并以及该引物对待选snps进行pcr扩增，并获得扩增产物的分离曲线；
38.根据分离曲线确定性别，判断确定的性别与样本的真实性别是否一致，若一致则得到与江黄颡鱼性别相关的snp分子标记；否则即排除。
39.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：
40.本技术中涉及一种江黄颡鱼性别相关snp分子标记及其应用，本技术通过剪取江黄颡鱼部分组织来提取全基因组dna，从最大程度减少对鱼体的伤害，并且从中筛选获得了性别差异的dna片段即snp标记序列(如seq id no.1所示)用于江黄颡鱼的遗传性别鉴定，所述snp标记为位于江黄颡鱼seq id no.1序列的自5’端起第100、101位碱基，分别是tc或at，根据snp标记序列设计检测引物，从而可以快速、准确的区分江黄颡鱼的遗传性别。
附图说明
41.图1为本技术实施例提供的与江黄颡鱼性别相关snp分子标记的筛选方法流程示意图。
42.图2为图1中s2步骤的具体流程示意图。
43.图3为图1中s4步骤的具体流程示意图。
44.图4为本技术实施例提供的lightscanner系统对于雌雄江黄颡鱼样本分离曲线。
45.图5为本技术实施例提供的利用snp标记鉴定江黄颡鱼遗传性别的结果验证。
具体实施方式
46.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
47.江黄颡鱼性别相关snp分子标记的筛选
48.如图1所示，本技术实施例公开了一种江黄颡鱼性别相关snp分子标记的筛选方法，包括步骤s1～s4。具体如下：
49.步骤s1、获得原始序列集
50.在繁殖季节通过解剖观察性腺的方式鉴定出江黄颡鱼雌鱼和雄鱼各24尾，剪取尾鳍并提取其全基因组dna。并随机取16尾雌性dna等量混合为雌性混合池，获得雌性混合池，
随机取16尾雄性dna等量混合为雄性混合池，获得雄性混合池。
51.将所述雌性混合池、所述雄性混合池以及剩下的8个雌性单样本和8个雄性单样本共18个样本，在illumina hiseq x ten平台进行全基因组测序，以分别得到与此18个样本对应的18个原始序列集。
52.步骤s2、获得参考序列
53.如图2所示，本步骤是将原始序列集中的原始序列进行过滤和电子酶切以得到分别与所述雄性混合池、所述雌性混合池、所述8个雄性单样本和所述8个雌性单样本对应的酶切片段集(即总共18个酶切片段集)，对来自于雄性混合池的酶切片段集与来自雌性混合池的酶切片段集进行比对，得到雌性混合池和雄性混合池分别对应的特异片段，挑选具有数量较多的特异片段的雄性单样本或雌性单样本对应的酶切片段进行串联，即为参考序列。
54.如图2所示，进一步的实施例公开的s2步骤具体包括：
55.步骤s21、将原始序列集过滤后(剔除长度大于150bp的序列数据)，得到过滤序列集；
56.步骤s22、将所有过滤序列集从5’端开始逐一进行ac、ag、at、ga、gc和gt六种碱基起始的60bp片段化电子酶切，起始碱基不符合要求则向后位移，由此能够件全部过滤序列集电子酶切为长度大小为60bp的酶切片段集。由所述雄性混合池电子酶切的片段对应的序列数据构成为第一酶切片段集，由所述雌性混合池电子酶切的片段对应的序列数据构成为第二酶切片段集，由全部8个雄性单样本进行电子酶切得到的片段对应的序列数据构成为第三酶切片段集；由全部8个雌性单样本进行电子酶切得到的片段对应的序列数据构成为第四酶切片段集；
57.步骤s23、第一比对
58.将第一酶切片段集与第二酶切片段集进行比对，以获得仅存在于所述第一酶切片段集的第一特异片段以及仅存在于所述第二酶切片段集的第二特异片段。具体为，第一酶切片段集对应为雄性混合池电子酶切后得到的片段对应的序列数据，第二酶切片段集对应为雌性混合池电子酶切后得到的片段对应的序列数据。
59.步骤s24、第二比对
60.在所述第三酶切片段集中包含的所述第一特异化片段的数量与在所述第四酶切片段集中包含的所述第二特异化片段的数量大小；
61.若第一特异片段在第三酶切片段集中出现的数量大于第二特异片段的数量，则随机从8个雄性单样本中挑选与某一样本对应的过滤序列集中的全部过滤序列进行串联，以作为参考序列；
62.反之，若第一特异片段在第三酶切片段集中出现的数量小于第二特异片段的数量，则随机从8个雄性单样本中挑选与某一样本对应的过滤序列集中的全部过滤序列进行串联，以作为参考序列。
63.步骤s3、获得候选snps
64.本步骤主要进行第三比对，将步骤s2得到的参考序列与第一酶切片段集或第二酶切片段集进行比对，从第二酶切片段集或第一酶切片段集中得到与参考序列不一致的具有单核苷酸多态性位点(snps)的序列，以将这些snps作为候选snps。具体的，若参考序列是由
雄性单样本对应的过滤序列构建的，则将该参考序列与第二酶切片段集进行比对；反之，则将参考序列与第一酶切片段进行比对。
65.本步骤的进一步实施例中，对这些具有snps的序列进行如下条件挑选，如挑选出现在同一个150bp长度的第二酶切片段集或第一酶切片段集中；如挑选出现同一个150bp长度的第二酶切片段集或第一酶切片段集的同一个酶切片段中且距离较近(相距不超过30bp)的snps位点作为候选snps位点；如挑选出现在同一个150bp长度的第二酶切片段集或第一酶切片段集中次数较多的snps位点作为候选snps位点；优选地，本技术实施例将结合上述这些条件挑选，以剔除不符合这些条件的snps。步骤s4、获得与江黄颡鱼性别相关snp分子标记
66.如图3所示，本步骤具体包括：
67.s41、进行第四比对，含有候选snps的序列分别与来源于8个雄性单样本和8个雌性单样本的过滤序列数据集进行比对，以判断含有候选snps的序列在8个雄性单样本中是否全部为杂合的，以及在8尾雌性单样本中是否都是纯合的：如果是则可确定为待选snps，否则即可排除。具体的，本步骤可以使用igv软件，进行可视化manual check，结果如图3所示。
68.s42、对待选snps设计引物，并以及该引物对待选snps进行pcr扩增，并获得扩增产物的分离曲线。
69.s43、根据分离曲线确定性别，判断确定的性别与样本的真实性别是否一致，若一致则得到与江黄颡鱼性别相关的snp分子标记；否则即排除。
70.本实施例第s24步骤的比对结果中，第一特异片段在第三酶切片段集中的数量远大于来源于第二特异片段在第四酶切片段集中的数量，由此判断江黄颡鱼为xx/xy性别决定类型。
71.本实施例步骤s4的比对结果中，挑选出的含有候选snps的序列在雄性单样本中表现为杂合体，在雌性单样本中表现为纯合体；因此，此次候选的snps可作为区分雌雄个体snps，最终获得含有效区分雌雄个体的snp分子标记序列，其核苷酸序列为seq id no.1所示，其所述snp标记为所述seq idno:1序列的自5’端起第100、101位碱基，分别是tc或at。所述snp分子标记为tc/at杂合基因型的个体为雄性江黄颡鱼，所述snp分子标为tc纯合基因型的个体为雌性江黄颡鱼。
72.江黄颡鱼snp分子标记有效性验证
73.(1)针对包含seq id no.1所示序列的核苷酸序列设计引物对：
74.p1：序列如seq id no.2所示；
75.p2：序列如seq id no.3所示。
76.(2)基因组dna提取(chelex100煮沸法)
77.配置5％chelex100溶液；取5mg尾鳍组织置于0.2mlpcr管中，震荡chelex100溶液使树脂颗粒均匀悬浮在溶液中，用扩口吸头吸取150ul至装有尾鳍组织的pcr管中；往pcr管中加入5ul 20mg/ml蛋白酶k溶液，震荡混匀，放置于pcr仪上，设定条件热盖105℃，模块55℃，40min；98℃，5min；反应结束后立即拿出，涡旋振荡3次，每次5s；将pcr管放入离心机中，4000rpm离心5min；得到的上清即为dna溶液，可直接用于pcr扩增。
78.(4)pcr扩增
79.反应体系如表1所示：
80.表1
81.添加物添加量10x buffer(mg2 plus)1μllc green1μldntp(10mm each)0.2μlforward primer(10mm)0.2μlreverse primer(10mm)0.2μlsample dna1μltaq(5u/μl)0.1μlddh2o6.3μltotal10μl
82.pcr反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，40个循环；72℃终延伸5min；12℃保存。
83.(4)上机扫描
84.样本孔悬空滴加液体石蜡，放入hrm仪器板槽中，设置起始扫描温度68℃，终止扫描温度94℃，点击start run开始扫描；扫描结束后，选择small amplicon模式进行分析，点击new subset选择需要分析的样本孔，归为一组；点击normalize调整分析分温度区间；点击grouping-auto group进行选定样本的分组，lightscanner系统得到分离曲线。
85.结果：如图4所示，lightscanner系统对样本的分析，灰色的曲线代表的snp分子标记为纯合体是雌鱼(xx)，红色的曲线代表的snp分子标记为杂合体是雄鱼(xy)，通过lightscanner系统的分析，雌雄个体被明显的分开，所述snp分子标记能够准确的区分江黄颡鱼的遗传性别。
86.snp分子标记在鉴定江黄颡鱼遗传性别的应用
87.(1)从市场随机收集江黄颡鱼鱼体，编号1-96，通过解剖确定鱼体性别，雌鱼48尾，雄鱼48尾，采集鳍条组织样本保存于96孔板中冷冻保存，利用chelexloo煮沸法提取其基因组dna。
88.(2)用实施例2的方法对上述江黄颡鱼dna样本进行pcr扩增。
89.(3)pcr扩增产物通过sanger测序法进行测序，
90.(4)对扩增产物进行hrm分型获得两种分离曲线，分离曲线以各自标准曲线作为标准化参照。
91.(4)hrm分型结果显示，与解剖获得的已知结果进行对比。
92.结果：通过测序，江黄颡鱼样本snp分子标记序列如下：
93.纯合型：如seq idno.1所示；
94.杂合型：有两条序列，如seq idno.1和seq idno.4所示；
95.如图5所示，纯合型样本显示曲线为均为xx曲线，为雌性江黄颡鱼样本，杂合型样本显示曲线均为xy曲线，为雄性黄颡鱼样本，与解剖获得的已知结果完全一致，准确性为100％。
96.综上所述，本技术筛选获得的snp分子标记在用于江黄颡鱼的遗传性别鉴定时，可以快速、准确地区分江黄颡鱼的遗传性别。
97.以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。