一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法及其应用。
背景技术：
2.表皮生长因子(egfr)是一种跨膜蛋白，可为非小细胞肺癌患者术后靶向药物选择提供依据以及治疗靶点。随着egfr的发现以及分子靶向治疗药物的研发和临床应用，肺癌患者的5年生存率有了一定的提高。
3.循环肿瘤细胞是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。大量实验证明外周血循环肿瘤细胞与癌症患者的转移、复发以及预后密切相关，利用其检测患者egfr突变将有助于肿瘤转移及复发监测、指导靶向用药、药物疗效及预后评估等研究。
4.现有针对肺癌患者egfr突变检测技术，主要采用患者组织样本，采用染料法或者探针法荧光定量pcr技术进行检测。但是采用染料法或者探针法荧光定量pcr技术检测组织样本中egfr突变，在检测时操作复杂、检测时间长且灵敏度不高，很难做到多次或实时检测。
技术实现要素：
5.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法及其应用。本发明基于液滴数字pcr技术，能够实现更低成本、更高精度、更高灵敏度、更低样本投入、绝对定量的检测过程，达到动态监测目的。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于通过对循环肿瘤细胞提取dna样本，配置pcr反应体系后生成液滴，进行pcr扩增，荧光信号检测egfr基因突变。
8.所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
9.(1)富集循环肿瘤细胞；
10.(2)对上述步骤(1)富集的循环肿瘤细胞进行提取得到dna样本；
11.(3)配置pcr反应体系；
12.(4)采用液滴生成仪器将上述步骤(3)得到的pcr反应体系制备成大小均匀的液滴；
13.(5)对上述步骤(4)生成的液滴进行pcr扩增；
14.(6)对上述步骤(5)扩增后的液滴进行荧光信号检测。
15.所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(1)中采用确定性侧向位移芯片分离外周血样本的方法富集循环肿瘤细胞。
16.所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(3)中pcr反应体系包括：目标引物/探针1μl，对照引物/探针1μl，pcr预混液4μl，所述步骤(2)得到的dna样本10μl，水补足，总体系20μl。
17.所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述引物包括野生型和突变型，所述荧光探针包括野生型和突变型。
18.所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(4)中液滴的大小为80-100μm。
19.所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(5)中扩增的条件为：95℃10min；94℃30s，55℃60s，40个循环；20℃保存。
20.所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(6)中荧光信号检测是平铺芯片上进行的。
21.所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述平铺芯片的高度为100-110μm。
22.所述的方法在对循环肿瘤细胞egfr基因突变的检测上的应用。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.(1)本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发非小细胞肺癌患者egfr表达情况，该技术无创，且可多次并实时检测，提高了循环肿瘤细胞在临床应用中的可行性。
25.(2)本发明方法具有高灵敏度、高准确性、低成本等特点，且操作方便。
附图说明
26.图1为egfr基因t790m突变液滴pcr检测结果(10x)。
具体实施方式
27.以下将通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
28.实施例1：
29.一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，包括以下步骤：
30.(1)采用确定性侧向位移芯片分离外周血样本的方法富集循环肿瘤细胞。
31.(2)对上述步骤(1)富集的循环肿瘤细胞进行提取得到dna样本。
32.(3)配置pcr反应体系。pcr反应体系的配置具体如下表1所示。
33.表1 pcr反应体系配置
[0034][0035]
(4)采用液滴生成仪器将得到的pcr反应体系制备成大小均匀的液滴，液滴的大小为80-100μm。
[0036]
(5)对上述步骤(4)生成的液滴进行pcr扩增。扩增的条件为：95℃10min；94℃30s，55℃60s，40个循环；20℃保存，具体如下表2所示。
[0037]
表2扩增的条件
[0038]
反应步骤温度(℃)时间循环数酶激活9510min1变性9430sec40退火/延伸5560sec40保存(可选)20 ∞1
[0039]
(6)对上述步骤(5)扩增后的液滴进行荧光信号检测。荧光信号检测是平铺芯片上进行的，平铺芯片的高度为100-110μm。成功检测到egfr基因t790m突变信号，如图1所示，证明了本发明的可行性。
技术特征：
1.一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于通过对循环肿瘤细胞提取dna样本，配置pcr反应体系后生成液滴，进行pcr扩增，荧光信号检测egfr基因突变。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)富集循环肿瘤细胞；(2)对上述步骤(1)富集的循环肿瘤细胞进行提取得到dna样本；(3)配置pcr反应体系；(4)采用液滴生成仪器将上述步骤(3)得到的pcr反应体系制备成大小均匀的液滴；(5)对上述步骤(4)生成的液滴进行pcr扩增；(6)对上述步骤(5)扩增后的液滴进行荧光信号检测。3.如权利要求2所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(1)中采用确定性侧向位移芯片分离外周血样本的方法富集循环肿瘤细胞。4.如权利要求2所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(3)中pcr反应体系包括：目标引物/探针1μl，对照引物/探针1μl，pcr预混液4μl，所述步骤(2)得到的dna样本10μl，水补足，总体系20μl。5.如权利要求4所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述引物包括野生型和突变型，所述荧光探针包括野生型和突变型。6.如权利要求2所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(4)中液滴的大小为80-100μm。7.如权利要求2所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(5)中扩增的条件为：95℃10min；94℃30s，55℃60s，40个循环；20℃保存。8.如权利要求2所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述步骤(6)中荧光信号检测是平铺芯片上进行的。9.如权利要求8所述的一种利用数字pcr检测循环肿瘤细胞egfr基因突变的方法，其特征在于所述平铺芯片的高度为100-110μm。10.如权利要求1-9任一所述的方法在对循环肿瘤细胞egfr基因突变的检测上的应用。
技术总结
一种利用数字PCR检测循环肿瘤细胞EGFR基因突变的方法及其应用，属于生物医学技术领域。本发明方法包括以下步骤：(1)富集循环肿瘤细胞；(2)对循环肿瘤细胞进行提取得到DNA样本；(3)配置PCR反应体系；(4)采用液滴生成仪器将PCR反应体系制备成大小均匀的液滴；(5)对液滴进行PCR扩增；(6)对扩增后的液滴进行荧光信号检测。本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发非小细胞肺癌患者EGFR表达情况，该技术无创，且可多次并实时检测，提高了循环肿瘤细胞在临床应用中的可行性。本发明方法具有高灵敏度、高准确性、低成本等特点，且操作方便。且操作方便。且操作方便。
技术研发人员：陈艳 黄玉清
受保护的技术使用者：深圳先进技术研究院
技术研发日：2021.12.13
技术公布日：2022/4/26
再多了解一些
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