一种叶螨属常见种的快速鉴定方法

1.本发明涉及生物技术，特别涉及一种叶螨属常见种的快速鉴定方法。


背景技术：

2.叶螨是蜱螨亚纲(acari)、真螨总目(acariformes)、绒螨目(trombidiformes)、前气门亚目(prostigmata)、异气门总股(eleutherengonides)、叶螨科(tetranychidae)的植食性螨类。叶螨是一种危害果蔬和温室植物的世界范围的重要经济害虫。叶螨属(tetranychus)是叶螨科中经济意义最大的一类叶螨。该属叶螨与农业生产的关系密切，爆发严重时常导致作物干枯落叶，生长停滞，严重影响产量和质量，在经济上造成一定的损失。虽然叶螨属叶螨经济意义重大，但是由于形态学特征有限，且这些特征在不同种之间具有高度的相似性，再者同一植株或者同一叶片上叶螨常常会混合发生，使得叶螨的快速准确鉴定存在较大的困难。
3.目前，对于常规形态学鉴定较难分辨的物种，通常是采取pcr扩增特定片段如coi、its等然后直接测序，通过与数据库中已知序列对比鉴定物种。然而，此方法存在如下缺陷：1.数据库中的已知序列来源广泛，提交序列时数据库无法鉴别序列所属叶螨鉴定的正确性，如已有分析数据表明，数据库genbank中的叶螨分子序列大约30％存在鉴定错误；2.pcr扩增后的its片段，需要经过纯化、克隆、挑斑等步骤，成本较高，若待鉴定叶螨数量较大，则载体、测序等成本非常高；3.克隆测序整个过程通常需要三天以上，若待鉴定叶螨数量较大，则工作量巨大，所耗时间更长。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明目的是提供快速、准确的叶螨属常见种的鉴定方法。
5.技术方案：本发明提供一种叶螨属常见种的快速鉴定方法，包括如下步骤：
6.(1)提取待鉴定叶螨总dna；
7.(2)使用叶螨中扩增its的通用引物pcr扩增its序列；
8.(3)将上述pcr产物作为酶切模板，分别使用rsa i、mbo ii、hpyf3 i、hinfi 4种酶进行酶切反应，取酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察并拍照记录结果；
9.(4)将待鉴定图谱与标准酶切图谱比对，通过比较酶切条带的数量与位置从而确定待鉴定叶螨的物种。
10.进一步地，所述的叶螨属常见种包括二斑叶螨绿色型、二斑叶螨红色型、截形叶螨、神泽叶螨、卢氏叶螨、豆叶螨、马来西亚叶螨或皮氏叶螨。
11.进一步地，所述步骤(1)的提取方法包括：将预处理完的叶螨个体加入ste缓冲液，碾磨，确保碾磨至无可见的块状叶螨组织，加入蛋白酶k，蛋白酶充分接触研磨液后离心至管底，将离心管放入水浴锅孵育，再高温变性使蛋白酶k失活，待冷却至室温后即可作为dna模板用于pcr扩增。
technologies公司)。配置pcr反应体系需在冰上进行，反应体系：
[0034][0035]
扩增条件：预变性：95℃，4min；35个循环：变性95℃，30s，退火49℃，30s，延伸72℃，90s；最后再以72℃延伸10min；
[0036]
扩增反应结束后进行电泳以确认是否成功扩增出目的片段。琼脂糖凝胶电泳条件：取pcr扩增产物5μl与1μl的6
×
上样缓冲液混匀，上样于2％(g/ml)浓度的琼脂糖凝胶上，120v稳定电压下电泳，电泳液为1
×
tae，电泳时间约为半小时。电泳结束后，于0.1％的eb溶液中染色10-15min，之后在凝胶成像系统下观察并确认是否成功扩增出目的片段。通常会得到1200bp左右的目的条带则剩余产物供继续酶切实验，没有得到目的片段请换用上文所述另一对通用引物。若依然没有扩增出目的片段，请检查dna质量和实验操作步骤是否有误。
[0037]
3)酶切反应
[0038]
将上述pcr产物分液至4只0.2ml pcr离心管，每管加入5μl。分别使用rsa i、mbo ii、hpyf3 i、hinf i 4种内切酶在这4只离心管中进行酶切反应。每管中15μl的酶切反应体系由以下成分组成：pcr产物5μl，ddh2o8.5μl，内切酶0.5μl，各个酶所对应的buffer 1μl。所有试剂加完后需充分震荡混匀离心。反应体系配置完毕后将离心管放入37℃水浴锅中酶切反应3h，然后在65℃下(可使用水浴锅或者pcr仪)20min使内切酶失活。
[0039]
4)图谱对比鉴定
[0040]
取酶切产物5μl与1μl的6
×
上样缓冲液混匀，上样于3％(g/ml)浓度的琼脂糖凝胶上，90v稳定电压下电泳，dna分子梯度标记需选择100bp marker，电泳液为1
×
tae，电泳时间45分钟左右。电泳结束后，于0.1％的eb溶液中染色10-15min，之后在凝胶成像系统下观察确认并拍照得到待鉴定螨虫四种内切酶的酶切图谱。试验所得图谱与标准叶螨物种酶切图谱比对，从而准确确定物种。


技术特征：
1.一种叶螨属常见种的快速鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)提取待鉴定叶螨总dna；(2)使用叶螨中扩增its的通用引物pcr扩增its序列；(3)将上述pcr产物作为酶切模板，分别使用rsa i、mbo ii、hpyf3 i、hinfi 4种酶进行酶切反应，取酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察并拍照记录结果；(4)将待鉴定图谱与标准酶切图谱比对，通过比较酶切条带的数量与位置从而确定待鉴定叶螨的物种。2.根据权利要求1所述的叶螨属常见种的快速鉴定方法，其特征在于：所述的叶螨属常见种包括二斑叶螨绿色型、二斑叶螨红色型、截形叶螨、神泽叶螨、卢氏叶螨、豆叶螨、马来西亚叶螨或皮氏叶螨。3.根据权利要求1所述的叶螨属常见种的快速鉴定方法，其特征在于：所述步骤(1)的提取方法包括：将预处理完的叶螨个体加入ste缓冲液，碾磨，确保碾磨至无可见的块状叶螨组织，加入蛋白酶k，蛋白酶充分接触研磨液后离心至管底，将离心管放入水浴锅孵育，再高温变性使蛋白酶k失活，待冷却至室温后即可作为dna模板用于pcr扩增。4.根据权利要求3所述的叶螨属常见种的快速鉴定方法，其特征在于：所述预处理采用100％酒精清洗。5.根据权利要求1所述的叶螨属常见种的快速鉴定方法，其特征在于：所述步骤(2)pcr扩增引物：序列1：上游引物：5
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gtcgtaacaaggtttccgtagg-3
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；序列2：下游引物：5
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。6.根据权利要求1所述的叶螨属常见种的快速鉴定方法，其特征在于：所述步骤(2)pcr扩增引物：序列3：上游引物：5
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；序列4：下游引物：5
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。

技术总结
本发明公开了一种叶螨属常见种的快速鉴定方法，包括：(1)提取待鉴定叶螨总DNA；(2)使用叶螨中扩增ITS的通用引物PCR扩增ITS序列；(3)将上述PCR产物作为酶切模板，分别使用Rsa I、Mbo II、HpyF3 I、HinfI 4种酶进行酶切反应，取酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察并拍照记录结果；(4)将待鉴定图谱与标准酶切图谱比对，通过比较酶切条带的数量与位置从而确定待鉴定叶螨的物种。该方法克服了叶螨种间相似的形态学特征的干扰，且不受待鉴定个体性别与发育阶段的限制，从而进行快速准确的鉴定。准确的鉴定。准确的鉴定。


技术研发人员：葛成
受保护的技术使用者：江苏农林职业技术学院
技术研发日：2021.11.17
技术公布日：2022/4/26