一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用

一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cdna克隆及其构建方法与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的cdna克隆及其构建方法与应用。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome， prrs)，又称“蓝耳病”，是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，prrsv)感染导致的猪病毒性传染病，给各国养猪业造成重大经济损失。据统计，prrs每年给美国造成的经济损失约6.5亿美元。基于我国的养殖规模以及该病在我国的流行情况，该病每年给我国造成的经济损失远远超过这个数字。prrs的主要临床症状以各生长阶段呼吸道疾病以及母猪繁殖障碍为特征，常表现为发热、厌食、呼吸困难等，还会导致严重的免疫抑制。prrs于1995年首次在我国上海、北京爆发，随后向其周围地区和省份蔓延。随着这些年来猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速演化，我国临床上的主要流行毒株包括经典毒株、高致病性毒株(hp-prrsv)、类nadc30毒株和类nadc34毒株等。商品化的疫苗能够提供良好的同源保护，但是对异源毒株保护非常有限。不断出现的新毒株大大降低了商品化疫苗的保护效果，这已成为prrs防控急需克服的困难。
3.反向遗传操作系统是一种定向改造和修饰病毒基因组的重要基因工程技术，该技术已成为病毒学基础研究和疫苗研发必不可少的技术平台。迄今，各国科学家已经成功构建了prrsv的反向遗传操作系统，并将其用于解析prrsv的复制机制、致病机制以及病毒宿主相互作用机制。prrsv感染性cdna克隆也被用作病毒载体表达外源基因。据报道，prrsv基因组中多个区域可用于表达外源基因，包括nsp2的高度变异区、nsp12/gp2a之间、orf4/orf5a之间和 orf7/3’utr之间等位置。以prrsv为载体，成功表达了多种报告基因，包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶等。与上述报告基因相比，gaussia luciferase(gluc)作为一种分泌性荧光素酶，细胞中合成的80％以上荧光素酶均能分泌至细胞外，细胞上清中的荧光素酶活性可以反应gluc的表达情况。并且，gluc反应产生的荧光强度是萤火虫和海肾荧光素酶的 100倍以上。本发明建立猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cdna克隆，并且将 prrsv trs6和gluc基因组成的表达框插入到orf7和3’utr之间，构建了表达gluc的标记病毒，将该病毒应用于抗病毒药物的快速评价。本发明为深入解析hp-prrsv的致病机制和特异性抗病毒药物筛选奠定了基础。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的cdna克隆；
5.本发明还要解决的技术问题是提供上述表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒cdna克隆的构建方法；
6.本发明最后要解决的技术问题是提供上述表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒cdna克隆的应用。
7.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
8.表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cdna克隆构建方法，包括以下步骤：
9.(1)本发明优选的载体为pacyc177低拷贝载体，将人工合成的seq id no:1插入pacyc177质粒，得到重组质粒pcmv-ta-vector；
10.(2)以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ta-12株的病毒rna反转录产物为模板，用引物f1-f和f1-r扩增f1片段，用引物f2-f和f2-r扩增f2片段，用引物f3-f和f3-r扩增f3片段，用引物f4-f和f4-r扩增f4片段；
11.(3)通过体外同源重组试验，将f1和f2片段插入到pcmv-ta-vector的 mlui和aflii位点之间，得到重组质粒pcmv-ta12-f1～f2；通过体外同源重组试验，将f3和f4片段插入到pcmv-ta
‑‑
f1～f2的aflii和ecorv位点之间，得到感染性克隆质粒pcmv-ta-12；
12.(4)以pcmv-ta-12质粒为模板，用引物对ta-12-ecorv-f/ta-12
‑ꢀ
dbsrgi-r和ta-12-dbsrgi-f/ta-12-dbsrgi-r分两段扩增ta-12基因组的 12408～13404nt区域、突变12621nt处的碱基a为c；
13.(5)通过体外同源重组试验，将上述获得的两个片段替换pcmv-ta-12 中的相对应的区域，得到含有遗传标记(bsrgi灭活)的感染性克隆质粒 pcmv-ta-12m。
14.表达gaussia luciferase基因的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，包括以下步骤：
15.(1)以pcmv-gluc质粒为模板(gluc基因序列如seq id no.：3所示)，用引物ta-12-trs6/gluc-f和ta-12-gluc/utr-r扩增gluc基因序列；以 pcmv-ta-12质粒为模板，用引物对ta-12-bsrgi-f/ta-12-n/trs6-r和ta
‑ꢀ
12-gluc/utr-f/ta-12-noti-r分别扩增病毒序列；
16.(2)通过体外同源重组试验，将(1)中获得的dna片段插入pcmv
‑ꢀ
ta-12m中的bsrgi和noti位点之间，得到感染性克隆质粒pcmv-ta-gluc。
17.本发明还提供了上述方法得到的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性 cdna克隆质粒以及其在拯救高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及标记病毒中的应用。
18.本发明中，所述应用包括如下步骤：利用转染试剂lipofectamine
tm 3000将感染性cdna克隆质粒(pcmv-ta-12m或pcmv-ta-gluc)转染bhk-21细胞，收获细胞培养上清，再将上清感染marc-145细胞，获得拯救的感染性高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒rta-12m或rta-gluc。
19.本发明中，所述应用涉及基于rta-gluc抗病毒药物平台，包括如下步骤：将病毒吸附至marc-145细胞单层，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育24 h，然后收集细胞培养上清，通过检测上清中gluc活性测定病毒滴度，从而评价药物对hp-prrsv的抗病毒作用。
20.该构建方法简便、高效，该感染性cdna克隆拯救的重组病毒rta-gluc感染marc-145细胞后表达gluc并且分泌到细胞培养上清中，其生长特性与亲本病毒基本一致，且保持遗传稳定；该重组病毒提供一个新型的hp-prrsv抗病毒药物的快速筛选方法，该方法快速简便、敏感性高、可靠性好，可以进行高通量样本分析，具有很好的应用前景。
21.有益效果：本发明的显著特点包含：
22.(1)本发明提供的感染性cdna克隆质粒在大肠杆菌中有良好的稳定性，该质粒中病毒基因组上游的巨细胞病毒早期启动子(cmv)在哺乳动物细胞中能启动rna转录，通过dna转染bhk-21细胞直接拯救重组病毒，不需要体外转录成病毒rna再转染，克服了rna体外不稳定和易降解等缺点。
23.(2)本发明提供的感染性cdna克隆质粒中病毒基因组下游的丁型肝炎病毒核酶序列自我剪切获得精确病毒基因组3
′
末端，大大提高病毒拯救效率。
24.(3)本发明提供的表达gluc的hp-prrsv标记病毒表达的荧光素酶分泌至胞外，无需裂解细胞即可快速检测荧光信号。
25.(4)本发明提供的表达gluc的hp-prrsv标记病毒能用于抗病毒药物的快速筛选和评价，为开发特异性的抗prrsv药物奠定基础。
附图说明
26.图1为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ta-12株感染性cdna克隆构建策略示意图。
27.图2为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ta-12株的基因组片段rt-pcr 扩增的凝胶电泳图。
28.图3为表达gluc的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cdna克隆 pcmv-ta-12m质粒的构建示意图。
29.图4为重组病毒vta-12m和vta-gluc的间接免疫荧光鉴定。
30.图5为感染性cdna克隆拯救病毒的多步生长曲线与空斑试验。
31.图6为重组病毒vta-gluc表达外源基因稳定性检测。
32.图7为重组病毒vta-gluc在评价干扰素α抑制hp-prrsv中的应用。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
34.下列实施例中的常规实验方法，参见sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用方法参照仪器操作说明书。
35.在本发明的实例中，病毒有hp-pprsv ta12分离株；细胞有bhk-21细胞系和marc-145细胞系。
36.在本发明实施例中，质粒和毒株：pacyc177购自new england biolabs， pcmv-ta12，pcmv-ta12m,pcmv-ta12-gluc2质粒保存于本实验室，top10 感受态细胞购自上海昂羽生物科技有限公司。
37.在本发明实施例中，使用的其他试剂：tianamp virus dna/rna kit购自天根生化科技(北京)有限公司；lipofectamine 3000 transfection reagent、iv first-strand cdna synthesis reaction、opti-mem购自赛默飞世尔科技；high-fidelity dna polymerase、dntps、hifi dnaassembly master mix、dna限制性核酸内切酶购于new england biolabs； 50
×
tae缓冲液、20
×
pbs缓冲液、lb broth、
kanamycin购于生工生物工程 (上海)股份有限公司；rnase-free h2o、dna marker/ladder、ultra gelred (10000
×
)、fastpure plasmid mini kit购于诺唯赞生物科技有限公司；引物合成于南京金斯瑞生物科技有限公司；spin miniprep kit购自qiagen； dmem培养基购自hyclone生物化学制品有限公司；胎牛血清购自sigma公司； alexa fluor 488-conjugated affinipure goat anti-mouse igg(h l)购自jacksonimmune research inc。
38.实施例1：高致病性繁殖与呼吸综合征病毒ta-12株感染性cdna克隆质粒的构建
39.构建策略如图1所示。
40.选择低拷贝质粒pacyc177(购自neb)作为原始载体，将seq id no:1 插入至载体pacyc177中的asci和bgli位点之间，得到重组质粒pcmv-ta
‑ꢀ
vector。seq id no:1由苏州金唯智生物科技有限公司，包含cmv早期启动子、多个限制性内切酶位点、ta-12株的部分3’utr和丁型肝炎病毒核酶序列。
41.根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ta-12株的全基因组序列 (genbank登录号：mz342900)，使用snapgene软件设计4对特异性引物 (见表1)分段rt-pcr扩增病毒基因组f1、f2、f3和f4四个片段。
42.按照病毒基因组dna/rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取hp-prrsv ta-12株的病毒基因组rna。以病毒基因组rna为模板，按照iv first-strand cdna synthesis reaction(thermo fisherscientific)说明制备流行性腹泻病毒hm株cdna。反应体系为：2μm gene
‑ꢀ
specific reverse primer(ta-12-r2或ta-12-r4)1μl，10μm dntp mix 1μl，模板rna 11μl。反应程序为：65℃5min，置于冰上1min。之后反应体系为： 5
×
ssiv buffer 4μl，100mm dtt 1μl，recombinant rnase inhibitor 1μl， reverse transcriptase(200u/μl)1μl。反应程序为：50℃10min，80℃10min，将至室温。加入1μl rnase h，37℃20min去除rna。
43.扩增f1和f2片段时，以cdna(ta-12-r2)为模板，分别用两对引物 ta-12-f1/ta-12-r1和ta-12-f2/ta-12-r2进行扩增；扩增f3和f4片段时，以cdna(ta-12-r4)为模板，分别用两对引物ta-12-f3/ta-12-r3和ta-12
‑ꢀ
f4/ta-12-r4进行扩增；反应体系为：cdna 1μl，上游引物(40μm)和下游引物(40μm)各0.625μl，100mm dntp mix 1μl，5
×
q5 reaction buffer 10 μl，q5 high fidelity dna polymerase 0.5μl，ddh2o补至50μl。扩增程序为： 98℃30s；98℃10s，58℃-63℃20s，72℃5min，循环30次；72℃2min。目的条带大小分别为3317bp，3224bp，5646bp，3236bp，结果如图2所示。
44.利用hifi dna assembly master mix(购自neb)体外同源重组试剂盒，将回收纯化后的f1和f2片段插入至pcmv-ta-vector中的mlui和 aflii位点之间，得到重组质粒pcmv-ta-f1～f2；再利用hifidna assembly master mix，将回收纯化后的f3和f4片段插入至pcmv-ta
‑ꢀ
f1～f2中的aflii和ecori位点之间，得到感染性cdna克隆质粒pcmv-ta-12。
45.以pcmv-ta-12质粒为模板，用引物对ta-12-ecorv-f/ta-12-dbsrgi-r 和ta-12-dbsrgi-f/ta-12-dbsrgi-r分两段扩增ta-12基因组的12408～13404nt 区域、突变12620nt处的碱基a为c；利用hifi dna assemblymaster mix体外同源重组试验，将回收纯化后的上述两个片段替换pcmv-ta
‑ꢀ
12中的相对应区域，得到含有遗传标记(bsrgi灭
活)的感染性克隆质粒 pcmv-ta-12m。
46.表1引物名称及序列
[0047][0048][0049]
实施例2表达gaussia luciferase的高致病性繁殖与呼吸综合征病毒感染性 cdna克隆质粒的构建
[0050]
构建策略如图3所述。
[0051]
以pcmv-gluc质粒(购自thermo fisher scientific)为模板，用引物ta
‑ꢀ
12-trs6/gluc-f和ta-12-gluc/utr-r扩增gluc基因序列；以pcmv-ta-12质粒为模板，用引物对ta-12-bsrgi-f/ta-12-n/trs6-r和ta-12-gluc/utr
‑ꢀ
f/ta-12-noti-r分别扩增a和b片段。反应体系为：cdna 1μl，上游引物 (40μm)和下游引物(40μm)各0.625μl，100mm dntp mix 1μl，5
×
q5 reaction buffer 10μl，q5 high fidelity dna polymerase 0.5μl，ddh2o补至50 μl。扩增程序为：98℃30s；98℃10s，58℃-63℃20s，72℃5min，循环30次； 72℃2min。
[0052]
利用hifi dna assembly master mix体外同源重组试剂盒，将上述回收纯化后的gluc、a和b片段替换pcmv-ta-12m中bsrgi和noti位点之间的病毒序列，得到感染性克隆质粒pcmv-ta-gluc。
[0053]
实施例3高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ta-12株重组病毒及gluc标记病毒的拯救与生物学特征鉴定
[0054]
1.重组病毒的拯救与扩增
[0055]
将bhk-21细胞按5
×
105cells/孔的密度接种于12孔细胞培养板，在含10％ fbs的dmem培养基中培养。当细胞密度达到60～70％，按照lipofectamine3000转染试剂说明进行质粒转染，每孔的质粒(pcmv-ta-12m或pcmv-ta
‑ꢀ
gluc)用量为2μg。于转染后48h，收集病毒上清，并命名为p0代病毒。
[0056]
将拯救的病毒在marc-145细胞连续传代，每一代培养物均保存在-80℃冰箱中。具体步骤如下：将marc-145细胞接种于12孔细胞培养板，待细胞长成细胞单层，用含有2％fbs的mem感染培养基稀释病毒液，按每孔500 μl接种于marc-145细胞，待细胞病毒达到80％，收集细胞培养上清为病毒液。
[0057]
2.间接免疫荧光试验检测病毒n蛋白表达
[0058]
用冰冻甲醇将dna转染的bhk-21细胞或者病毒感染的marc-145细胞， 15min后弃上清，待细胞完全风干，加入prrsv n蛋白的单克隆抗体4a5(购自median diagnostics)，37℃孵育1h，用pbs漂洗5次，再加入alexa488 conjugated goat anti-mouse igg h&l二抗(购自jackson immuneresearch inc)，用pbs洗5次，加入dapi染色5min，pbs洗2次，用荧光显微镜观察并记录实验结果(图4)。
[0059]
3.病毒滴度测定(tcid
50
)
[0060]
在96孔板细胞培养板中接种marc-145细胞，用含有10％fbs(购自 sigma)的mem培养基培养，待长成细胞单层接种病毒。具体步骤如下：用含有2％fbs的mem培养基10倍梯度稀释病毒液(10-2
～10-7
)，每个稀释度的病毒液各接种4个细胞孔、每孔100μl，将培养板置于37℃培养箱继续培养。逐日观察感染细胞，感染后5～7天记录出现细胞病变的细胞孔数。按照reed
‑ꢀ
muench方法计算病毒滴度tcid
50
。
[0061]
4.多步生长曲线
[0062]
将marc-145细胞接种至24孔板中，置于含5％co2的37℃培养箱中培养，待细胞密度达到100％进行病毒感染。将rta-12m和rta-gluc的p3代病毒以0.01moi分别感染细胞，每个病毒感染12个孔。分别于感染后0h、12、 24h、36h、48h、60h和72h，收集两个孔的病毒上清，保存于-80℃备用。将收集的病毒上清分别进行10倍梯度稀释，将稀释好的病毒液加入到长满 marc-145单层的96孔板中，每孔加入100μl，各稀释度的病毒设4个重复，培养基继续在37℃培养。逐日观察并记录病变，于感染后5～7天观察细胞病变并按照reed-muench方法计算tcid50，绘制病毒的生长曲线(如图5)。结果表明，与亲本病毒(rta-12m)相比，rta-gluc在细胞上的生长特性基本一致。但是，在感染后12h～60h rta-gluc的病毒滴度比亲本病毒低0.5log左右。
[0063]
5.病毒蚀斑试验
[0064]
将marc-145细胞接种至12孔板中，置于含5％co2的37℃培养箱中培养，待细胞密度达到100％进行病毒感染。将rta-12m和rta-gluc的p3代病毒分别用mem培养基进行10倍梯度稀释，将稀释好的病毒液加入到12孔板中，37℃、5％co2的条件下孵育。感染2h后，弃去病毒液，将含有4％fbs 的mem培养基和2％ultrapuretm lmp agarose等比例混匀后加入12孔板中，待完全凝固后倒置于37℃、5％co2培养箱中培养。感染3天后，用4％多聚甲醛固定过夜，第二天弃去4％多聚甲醛与凝胶，每孔加入300μl 1％结晶紫染色液，染色10min，弃去结晶紫溶液、用水清洗，干燥后拍照记录(如图7)。结果表明，两个病毒的空斑形态和大小没有显著差异。
[0065]
6.rta-gluc中外源基因稳定性检测
[0066]
按照病毒基因组dna/rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取rta-12m和rta-gluc的p5和p10病毒的基因组rna。以病毒rna为模板，利用hiscript ii one step rt-pcr kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)，用引物prrsv-f1和prrsv-r进行一步rt-pcr扩增gluc编码基因序列。反应体系如下：2
×
one step mix 12.5μl，表1中的prrsv-f1(40μm)和prrsv
‑ꢀ
r(40μm)各0.25μl，one step enzyme mix 1.25ml，加入ddh2o补至25μl；反应条件为：50℃30min，94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃ 1min20s，循环30次；72℃7min。rta-gluc中的gluc可以稳定传代10次以上，具有良好的遗传稳定性。
[0067]
实施例4标记病毒rta-gluc应用于评价ifn-α对hp-prrsv的抑制作用
[0068]
比较标记病毒rta-gluc和亲本病毒rta-12m对i型干扰素ifn-α的敏感性。具体方法如下：
[0069]
将marc-145细胞接种于96孔细胞培养板中，待长成细胞单层，将ifn-α (上海生工)稀释至103iu/μl、102iu/μl、101iu/μl和100iu/μl，随后各取 100μl感染，每个浓度设置3个重复。
[0070]
待ifn-α刺激14h后，进行病毒感染。分别取亲本病毒(rta-12m)和标记病毒(rta-gluc)感染marc-145细胞，每孔的感染剂量为200 tcid
50
。孵育1h后弃上清，用pbs洗2遍，每孔加入150μl含有2％fbs和相应浓度的 ifn-α的men培养基，再孵育24h后收集上清。通过病毒滴度测定与gluc荧光素酶活性测定来评价不同浓度的ifn-α对hp-prrsv的抑制能力，利用 graphpad prism 8软件计算ifn-α对rta-12m和rta-gluc的半数抑制剂量(ic50)。如图7所示，根据病毒滴度测序，ifn-α对rta-12m和rta-gluc的 ic50分别为6.64iu/μl和2.08iu/μl，可见两个病毒对ifn-α的敏感性一致。另外，基于病毒液中gluc的荧光素酶活性，ifn-α对rta-gluc的ic50为13.22 iu/μl，与病毒滴度测定的结果基本一致。因此，标记病毒rta-gluc可以代替亲本病毒rta-12m用于抗hp-prrsv药物筛选，具有简便、快速、经济等特点。