一种从血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法与流程

一种从血浆中提取人抗凝血酶ⅲ的方法
技术领域
1.本发明属于生物制药领域，涉及血液制品的提取工艺，特别涉及一种人抗凝血酶ⅲ的提取方法。


背景技术：

2.人抗凝血酶iii(human antithrombin iii，at-iii)是控制生理性凝血反应过程和起抗凝血作用的重要因子，主要存在于人体血浆系统中，正常人血浆中at-iii含量为180-300mg/l，主要在肝内合成，也可在血管内皮细胞合成。at-iii是一种强效天然抗凝血剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂，其能使凝血级联反应中多种酶失活，其主要通过对凝血酶和fxa的抑制来发挥作用，也可通过对fixa、fxia、fxiia和纤溶酶的抑制来发挥作用。at-iii可在没有肝素的条件下单独发挥抗凝血作用，而在有肝素存在的条件下，at-iii能与肝素结合形成复合物，其灭活凝血酶和fxa的速度可提高1000-3500倍。
3.at-iii分子为单链糖蛋白，由432个氨基酸残基组成，其分子量为58000da，含3个二硫基，4个寡糖基，寡糖基分别连于肽链第96、135、155、192位的asn上，其蛋白质结构如图1所示。血浆来源的at-iii分子中约有10％为亚糖基化at-iii(β-at-iii)，其肽链asn
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上缺乏寡糖基。at-iii的等电点pi＝4.8，体内平均半衰期为3天。
4.作为血浆中抑制凝血的关键物质，at-iii的主要生理功能为参与维持体内正常抗凝血功能，保持纤溶系统与凝血系统的动态平衡，其所发挥的抗凝作用约占体内总抗凝物质作用的 80％左右，是人体内的最主要抗凝血成分，at-iii活性降低，如低于正常的70％时，可显著增加形成血栓的危险。1965年，egeberg首次报道了因遗传性at-iii缺乏引起的家族性血栓形成体质(thrombophi1ia)，初步明确了at-iii的缺乏和血栓形成倾向间的关系。因此，at-iii 制品临床上主要用于治疗at-iii缺乏症，分为遗传性和获得性两种。
5.人抗凝血酶ⅲ制剂最初的制备采用氧化铝、磷酸钙等吸附，分子筛过滤、用离子交换层析等手段，不仅费时费力，制品的收获率也很低。1968年，abildgaard最先提纯的atⅲ的平均收率只有2％。1974年，miller-andersson等用肝素-sepharose亲和层析从血浆中分离人抗凝血酶ⅲ，再经deae-sephadex层析和sephadexg-200凝胶过摅，收率约为34％，该法已被视为经典方法；其它方法大同小异，但这些方法用于大规模的工业化制备人抗凝血酶ⅲ尚受到一定条件的限制。
6.1975年，thaler等报道了两步分离法，即先在肝素琼脂上作亲和层析、再用聚乙二醇(peg) 沉淀，或先用peg沉淀、后用肝素-琼脂亲和层析、另外加入硫酸铵沉淀步骤以除去peg和微量污染物，经sds—page鉴定，制品是均一的，经人atⅲ末端分析，显示为n2末端氨基酸为组氨酸。该纯化制剂既有进行性抗凝血酶话性，又有肝素辅助因子活性，可从10-20l 血浆分离出》lg的抗凝血酶ⅲ，收率为60％，其比活性是血浆的550倍。1979年，wicker等首先叙述了工业规模制备临床用途的抗凝血酶ⅲ浓缩物，其原料为工业生产丢弃的cohn组分
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l或除去冷沉淀和以20％peg沉淀后的血浆。1985年，smith等开发出巴斯德法灭活的临床用人抗凝血酶ⅲ浓缩物，将除去冷沉淀和凝血酶原复合物的血浆，批量吸附于肝素
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20％-30％(w/v)聚乙二醇(peg-4000)，离心并回收沉淀；
17.(4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15 个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
18.(5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液ph至7.0-8.0，将溶液置于60℃环境中处理10小时；
19.(6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
20.(7)超滤浓缩：用10kd超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析 5-6倍，最后浓缩至人抗凝血酶ⅲ效价约50iu/ml；
21.(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
22.(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
23.(10)分装；
24.(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人抗凝血酶ⅲ冻干粉。
25.所述步骤(2)中所述的deae sephadex a-50凝胶吸附，采用的是本公司的血浆吸附过滤装置(中国发明专利cn201810248696.8一种用于凝血因子类血液制品生产的血浆吸附过滤装置)。
26.所述步骤(2)中所述的平衡缓冲液配方为：0.01-0.02m枸橼酸钠，0.15-0.25m氯化钠， ph为7.0-8.0。
27.所述步骤(4)中所述的亲和层析中平衡液配方为：0.1-0.2m tris-hcl，0.01-0.02m柠檬酸三钠，0.2-0.3m氯化钠，ph 7.0-8.0，洗涤缓冲液配方为：0.1-0.2m tris-hcl，0.01-0.02m柠檬酸三钠，0.3-0.4m氯化钠，ph 7.0-8.0，洗脱缓冲液配方为：0.1-0.2m tris-hcl，0.01-0.02m 柠檬酸三钠，1.5-2.5m氯化钠，ph 7.0-8.0。
28.所述步骤(5)所述的稳定剂配方为：5％-10％柠檬酸钠，1.5-2.5m氯化钠，50-60％(w/v) 山梨醇，ph 7.0-8.0。
29.所述步骤(7)中所述的透析液配方为：甘氨酸：1-4％(w/w)，ph：7.0-8.0，液温：常温。
30.本发明的优点：
31.(1)deae sephadex a-50凝胶吸附，中试规模采用的是本公司的血浆吸附过滤装置(中国发明专利cn201810248696.8一种用于凝血因子类血液制品生产的血浆吸附过滤装置)。可以实现凝胶自动过滤和收集的流水化处理，大大降低工作人员劳动强度，同时整个过滤过程中压差稳定可控，对后续制作的凝血因子成分和凝胶颗粒起到了较好的保护作用，适用于工业生产规模。
32.(2)整个工艺只涉及到两个层析系统，相比现有的一些工艺三步层析，减少了层析系统及配套设施和场地的配备。
33.(3)相比较于传统的s/d病毒灭活和离子交换层析的组合，除去了吐温80和磷酸三丁酯的引入和去除残留的风险。通过添加适合的稳定剂，采用病毒灭活效果相对好的巴氏
病毒灭活法。
34.(4)采用15纳米纳滤除病毒，保证更好的病毒过滤效果，安全性更高。
附图说明
35.图1为人抗凝血酶ⅲ蛋白质结构
具体实施方式
36.下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
37.实施例1
38.(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：取500l新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；
39.(2)deae sephadex a-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入deae sephadex a-50凝胶，干凝胶的加入量为500g，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.0小时，过滤得滤液，凝胶经过再生后保存可以重复使用；平衡缓冲液配方为：0.02m枸橼酸钠，0.2m氯化钠，ph为7.0
40.(3)聚乙二醇(peg-4000)提纯处理：将步骤(2)所得的滤液ph调整至6.5，加入 10％(w/v)聚乙二醇(peg-4000)，离心去除沉淀得上清液，再向所得上清液中加入20％(w/v) 聚乙二醇(peg-4000)，离心并回收沉淀；
41.(4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15 个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.1m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，0.2m氯化钠，ph 7.0，洗涤缓冲液配方为：0.1m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠， 0.3m氯化钠，ph 7.0，洗脱缓冲液配方为：0.1m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，1.5m氯化钠， ph 7.0。
42.(5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液ph至7.0，将溶液置于60℃环境中处理10小时；稳定剂配方为：5％柠檬酸钠，1.5m氯化钠，50％(w/v) 山梨醇，ph 7.0。
43.(6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.1m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，0.2m氯化钠，ph 7.0，洗涤缓冲液配方为：0.1m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，0.3m氯化钠，ph 7.0，洗脱缓冲液配方为：0.1m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，1.5m氯化钠，ph 7.0。
44.(7)超滤浓缩：用10kd超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析 6倍，最后浓缩至人抗凝血酶ⅲ效价约50iu/ml；透析液配方为：甘氨酸：1％(w/w)，ph： 7.0，液温：常温。
45.(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
46.(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
47.(10)分装；
sephadex a-50凝胶，干凝胶的加入量为1500g，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌2小时，过滤得滤液，凝胶经过再生后保存可以重复使用；平衡缓冲液配方为：0.015m枸橼酸钠，0.2m氯化钠，ph为7.5
64.(3)聚乙二醇(peg-4000)提纯处理：将步骤(2)所得的滤液ph调整至6.5，加入 15％(w/v)聚乙二醇(peg-4000)，离心去除沉淀得上清液，再向所得上清液中加入25％(w/v) 聚乙二醇(peg-4000)，离心并回收沉淀；
65.(4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15 个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.15m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，0.2m氯化钠，ph 7.5，洗涤缓冲液配方为：0.15m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，0.3m氯化钠，ph 7.5，洗脱缓冲液配方为：0.1m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，1.5m氯化钠， ph 7.5。
66.(5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液ph至7.5，将溶液置于60℃环境中处理10小时；稳定剂配方为：10％柠檬酸钠，2.0m氯化钠，55％(w/v) 山梨醇，ph 7.5。
67.(6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.15m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，0.2m氯化钠，ph 7.5，洗涤缓冲液配方为：0.15m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，0.3m氯化钠，ph 7.5，洗脱缓冲液配方为：0.1m tris-hcl，0.01m柠檬酸三钠，1.5m氯化钠，ph 7.5。
68.(7)超滤浓缩：用10kd超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析 6倍，最后浓缩至人抗凝血酶ⅲ效价约50iu/ml；透析液配方为：甘氨酸：3％(w/w)，ph： 7.0，液温：常温。调整后料液人抗凝血酶ⅲ比活达到13iu/mg蛋白质。
69.(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
70.(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
71.(10)分装；
72.(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人抗凝血酶ⅲ冻干粉。
73.上述实施例仅为本发明的较佳实施方式之一，并非以此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的工艺所做的等效变化，只要在本发明的要旨范围内，均应涵盖于本发明的保护范围之内。