一种产酸菌JC-C及其应用与产酸菌JC-C的培养、鉴定方法

一种产酸菌jc-c及其应用与产酸菌jc-c的培养、鉴定方法
技术领域
1.本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种产酸菌jc-c及其应用，还涉及该产酸菌jc-c的培养、鉴定方法。


背景技术：

2.新中国成立后，我国矿产资源勘查和开发得到了巨大的发展，为国民经济建设打下了坚实的基础。采矿业一般作为矿区当地的重要经济支柱，为当地经济建设与社会发展提供有力的支持；同时随着矿产资源的开发、运输及冶炼加工，带来的土壤污染问题日益严重，其中重金属土壤污染危害最大、治理困难而日渐受到人的关注。重金属通常以稳定状态存在于环境之中，但是由于采矿生产，原本存在于深层土壤、矿山中的重金属被输送至地表,并随着水循环水扩散到整个生态环境中，已经严重威胁到当地居民的生命健康。
3.目前矿区土壤污染修复技术主要是物理修复技术、化学修复技术。随着科学技术的日益发展近几年对矿区土壤的微生物修复技术也成为了一项重要手段，其主要原理即在重金属污染区筛选提取具有高重金属抗性的微生物并加以培养，利用其生命代谢活动及代谢分泌产生的有机酸对土壤中重金属进行螯合、溶解等方式减少土壤中重金属毒性。这种新兴的修复方法相较于传统修复方法具有运行成本低，效果显著，对环境友好等特点，日渐被国内外重视及运用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种产酸菌jc-c及其应用与产酸菌jc-c的培养、鉴定方法，为生物产酸并改良尾矿随意处理导致周边区域重金属污染土壤问题提供了菌种资源。
5.本发明所采用的技术方案是，一种产酸菌jc-c，该菌株命名为：产黄青霉(penicillium chrysogenum)，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：21423。
6.产酸菌jc-c的培养方法，具体为：
7.步骤1、菌株的分离培养
8.采集受重金属污染严重的土壤作为样品；
9.制备查式培养基：将蔗糖30g、nano33.0g、k2hpo41.0g、kcl 0.5g， feso4·
7h2o 0.01g、琼脂20.0g、蒸馏水1l，混合后，于121℃高温灭菌20 min，接着倒平板待其凝固，制成无菌的查式培养基，用来进行分离培养；
10.将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3-5d；
11.步骤2、鉴别产酸菌株
12.制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入查式固体培养基中，在 121℃高温灭菌20min，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
13.将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落培养于产酸鉴别
培养基；
14.培养3-5d后培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑选具有产酸能力的菌株多次接种于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；
15.当添加重金属的查式培养基中，添加zn
2
浓度高于400mg/l，或pb
2
浓度高于2000mg/l，或cd
2
浓度高于200mg/l时，才会对产酸菌jc-c产生严重抑制作用。
16.产酸菌jc-c在产酸中的应用，利用发酵培养基测定产酸菌jc-c的产酸效率，所述发酵培养基采用蔗糖100.0g，nano31.5 g，kh2po40.5 g，kcl 0.025g，mgso4·
7h2o 0.025g，酵母浸膏1.6g，调节ph为4，于121℃灭菌20min；
17.向培养后产酸菌jc-c培养基中加入无菌水，用无菌涂布棒，轻轻刮菌落表面，获得菌株孢子，再通过血球计数板观察孢子数量，加无菌水，将菌株孢子稀释孢子，按3.6
×
106个/50ml的比例加入发酵培养基进行恒温震荡培养，于温度为30℃、转速为160rpm条件下在恒温振荡培养箱中进行培养。
18.产酸菌jc-c的鉴定方法，包括：利用18s rrna基因序列对菌种鉴定和发酵液中有机酸含量的测定。
19.利用18s rrna基因序列对菌种鉴定具体为：
20.目标菌株18s rrna基因序列的pcr扩增：
21.通过真菌通用引物its1(5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
)和 its4(5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
)进行pcr扩增。在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的 18s rrna基因序列。
22.发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：
23.首先进行0.1mol/lnaoh标准溶液、1％酚酞指示剂的配置。然后准确吸取10.0ml样品发酵液，转移到100ml容量瓶中，加蒸馏水至100ml刻度并摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20ml放入100ml三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/lnaoh标准溶液滴定至初显粉色在0.5min内不褪色为终点，记下氢氧化钠用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗 naoh的含量。
24.本发明的有益效果是：
25.产酸菌jc-c的耐重金属效果：
26.当添加重金属的查式培养基中，采用打孔器接菌的方式，于30℃培养真菌，观察其菌株抑制率。抑制率(％)＝(空白平板直径-重金属平板直径)/(空白直径-3mm)。当添加重金属zn
2
浓度高于400mg/l，或pb
2
浓度高于2000 mg/l，或cd
2
浓度高于200mg/l时，才会对产酸菌jc-c产生严重抑制作用。
27.产酸菌jc-c的耐重金属胁迫的产酸能力：
28.未进行重金属处理时，产酸菌jc-c培养液初始ph值为5.44，产酸菌 jc-c培养15h后培养液ph值降至最小值4.58，菌株培养液ph值下降了 0.86；重金属胁迫下，随重金属浓度的增加，产酸菌jc-c的初始培养液ph 值降低、ph的变化幅度变小，培养液在发酵后期出现ph上升趋势。菌株 jc-c的初始培养液ph值降低、ph变化幅度变小、到达最低ph时间延长，培养液在发酵后期出现ph上升趋势。重金属pb胁迫时，在300mg/lpb处理该菌株24h后培养液ph值下降了0.23；重金属cd胁迫时，在50mg/l cd 处理该菌株15h后培养液ph下降了
0.62；重金属zn胁迫时，在100mg/lzn 处理该菌株15h后培养液ph值下降了1.1，说明低浓度的zn
2
对菌株产酸具有促进作用，但随着重金属添加量的升高，菌株产酸能力也下降；
29.在不同重金属浓度下产酸菌jc-c仍具有产酸能力。本发明的产酸菌 jc-c的筛选与鉴定方法，能够为生物产酸提供菌种资源。
附图说明
30.图1是本发明的产酸菌图；
31.图2是本发明产酸菌基于18s rrna基因序列构建的系统发育树；
32.图3是本发明产酸菌的生长曲线；
33.图4是本发明产酸菌的不同发酵时期培养基中ph变化图；
34.图5是本发明中不同浓度重金属zn、cd、pb对产酸菌生长的影响；
35.图6是本发明中不同浓度重金属pb对产酸菌ph的影响；
36.图7是本发明中不同浓度重金属cd对产酸菌ph的影响；
37.图8是本发明中不同浓度重金属zn对产酸菌ph的影响；
38.图9不同温度对产酸菌jc-c发酵液ph的影响图；
39.图10不同温度对产酸菌jc-c发酵液消耗naoh量的影响图；
40.图11不同初始ph对产酸菌jc-c发酵液ph的影响图；
41.图12不同初始ph对产酸菌jc-c发酵液消耗naoh量的影响图；
42.图13不同转速对产酸菌jc-c发酵液ph的影响图；
43.图14不同转速对产酸菌jc-c发酵液消耗naoh量的影响图。
44.保藏信息：产酸菌已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no：21423。命名为：产黄青霉(penicillium chrysogenum)jc-c。
具体实施方式
45.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
46.一种产酸菌jc-c，该菌株命名为：产黄青霉(penicillium chrysogenum) jc-c，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：21423。
47.产酸菌jc-c的培养方法，具体为：
48.步骤1、菌株的分离培养
49.采集受重金属污染严重的土壤作为样品；目的是从中分离具有产酸能力的微生物。
50.制备查式培养基：将蔗糖30g、nano33.0g、k2hpo41.0g、kcl 0.5g， feso4·
7h2o 0.01g、琼脂20.0g、蒸馏水1l，接着倒平板待其凝固，制成无菌分离培养基备用；
51.将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，具体的：将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3-5d。吸取不同梯度的土壤悬液需换用不同的吸管。
52.取稀释后的土壤悬液0.5ml；用无菌涂布棒均匀涂布土壤悬液于查式培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3-5d；
53.步骤2、鉴别产酸菌株
54.制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入查式培养基，在121℃高温灭菌20分钟，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
55.将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落划线培养于产酸鉴别培养基；
56.培养3-5d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；获得单一产酸菌株之后保藏于4℃冰箱中，待后续实验使用。
57.菌株形态观察和生理生化
58.菌落呈圆形，菌落表面具有辐射状纹路，边缘整齐的菌丝体呈白色绒状，菌体中央有一些浅黄色渗出液。
59.如图2所示，产酸菌jc-c基于18s rrna基因序列构建的系统发育树，简介获得步骤：
60.系统进化分析：将测序结果与genbank上已登录的基因序列进行比对，发现与产黄青霉(penicillium chrysogenum)同源性最高，为100％。利用 mega5软件进行多序列比对分析，neighbor-joining法构建系统发育树。综合生理生化特征和分子生物学特性，确定产酸菌jc-c为产黄青霉 (penicillium chrysogenum)。
61.如图3可知，产酸菌jc-c在查式液体培养基中生长延滞期较短，对数生长期为1.5-3.5d，在培养到3.5d后处于生长的平稳期。生长3.5d以后菌株的生物量达到5.2mg
·
ml-1
。
62.产酸菌jc-c在产酸中的应用，将产酸菌jc-c孢子以3.6
×
106个/50ml 的比例加入发酵培养基进行恒温震荡培养，于温度为30℃、ph为4、转速为160rpm条件下产酸效率最高。
63.未进行重金属处理时，产酸菌jc-c培养液初始ph值为5.44，产酸菌 jc-c培养15h后培养液ph值降至最小值4.58，菌株培养液ph值下降了0.86；重金属胁迫下，随重金属浓度的增加，产酸菌jc-c的初始培养液ph 值降低、ph的变化幅度变小，培养液在发酵后期出现ph上升趋势。菌株jc-c的初始培养液ph值降低、ph变化幅度变小、到达最低ph时间延长，培养液在发酵后期出现ph上升趋势。重金属pb胁迫时，在300mg/lpb处理该菌株24h后培养液ph值下降了0.23；重金属cd胁迫时，在50mg/l cd 处理该菌株15h后培养液ph下降了0.62；重金属zn胁迫时，在100mg/lzn 处理该菌株15h后培养液ph值下降了1.1，说明低浓度的zn
2
对菌株产酸具有促进作用，但随着重金属添加量的升高，菌株产酸能力也下降；
64.产酸菌jc-c的鉴定方法，包括：利用18s rrna基因序列对菌种鉴定和发酵培养基的发酵液中有机酸含量的测定。
65.利用18s rrna基因序列对菌种鉴定具体为：
66.目标菌株18s rrna基因序列的pcr扩增：
67.通过真菌通用引物its1(5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
)和 its4(5
′‑
tcctccgcttattgatatc-3
′
)进行pcr扩增。在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的18s rrna基因序列。
68.发酵培养基的发酵液中有机酸含量的测定具体为：
69.首先进行0.1mol/lnaoh标准溶液、1％酚酞指示剂的配置。然后准确吸取10.0ml样品发酵液，转移到100ml容量瓶中，加蒸馏水至100ml刻度并摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20ml放入100ml三角瓶中，加入 1％酚酞2滴，用0.1mol/lnaoh标准溶液滴定至初显粉色在0.5min内不褪色为终点，记下氢氧化钠用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗 naoh的含量。
70.产酸菌jc-c对重金属cd、pb和zn的耐受性：
71.通过观测产酸菌jc-c在不同浓度的cd
2
、pb
2
和zn
2
平板上培养10d 后的菌落直径大小，考察这两株产酸真菌对重金属的耐受性。随着重金属离子浓度的增加，产酸菌jc-c受到不同程度的抑制情况，cd
2
浓度为200mg/l 时对产酸菌jc-c的抑菌率达到了80％左右，显著抑制真菌生长，cd
2
浓度在300-500mg/l时完全抑制；在pb
2
浓度为200、300mg/l时，对产酸菌 jc-c的抑制效果较少，当pb
2
在高浓度2000mg/l的时候抑制率达到80％以上；在zn
2
浓度上升至400mg/l时对菌株zj-i的抑菌率达到了80％。
72.产酸菌jc-c在未添加重金属的发酵培养基中初始ph值为5.44，然后 ph逐渐下降，15h后上升。随重金属浓度的增加，菌株jc-c的初始培养液 ph值降低、ph变化幅度变小、到达最低ph时间延长，培养液在发酵后期出现ph上升趋势。重金属pb胁迫时，在300mg/lpb处理该菌株24h后培养液ph值下降了0.23；重金属cd胁迫时，在50mg/l cd处理该菌株15h 后培养液ph下降了0.62；重金属zn胁迫时，在100mg/lzn处理该菌株15h 后培养液ph值下降了1.1。
73.说明产酸菌jc-c耐重金属效果pb
2
》zn
2
》cd
2
。耐不同重金属时产酸菌jc-c仍具有产酸能力。
74.采用单因素实验法分析不同温度、初始发酵液ph及转速对菌株发酵产酸的影响情况。
75.发酵培养基采用蔗糖100.0g，nano31.5 g，kh2po40.5 g，mgso4·
7h2o 0.025g，kcl 0.025g，酵母浸膏1.6g，蒸馏水1l，ph调至5，121℃灭菌 20min；按3.6
×
106个/50ml的比例加入发酵培养基中，在恒温振荡培养箱中以160rpm，保持30℃培养；
76.1.温度
77.温度设置梯度为25℃、28℃、30℃、32℃和35℃，分别测定不同温度下发酵液中ph的变化与发酵液naoh的消耗量，来确定最佳产酸的温度条件。
78.如图9-10所示，当培养温度为30℃时，发酵液ph下降能力最大，且消耗naoh量最多，所以当培养温度达到30℃的时候产酸菌jc-c产酸能力最强。
79.2.ph
80.初始发酵液ph设置梯度为4、5、6、7和8，分别测定不同初始发酵液 ph下发酵液中ph的变化与发酵液naoh的消耗量，来确定最佳产酸的初始发酵液ph条件。
81.如图11-12所示，当培养初始发酵液ph为4时，发酵液ph下降能力最大，且消耗naoh量最多，所以当培养初始发酵液ph达到4的时候产酸菌 jc-c产酸能力最强。
82.3.转速
83.转速设置梯度为100rpm、120rpm、140rpm、160rpm和180rpm，分别测定不同转速下发酵液中ph的变化与发酵液naoh的消耗量，来确定最佳产酸的转速条件。
84.如图13-14所示，当培养转速为160rpm时，发酵液ph下降能力最大，且消耗naoh量
最多，所以当培养初始发酵液转速达到160rpm的时候产酸菌jc-c产酸能力最强。