一种酶法制备透明质酸寡聚糖的方法与流程

1.本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种高规模化酶法制备透明质酸寡聚糖的方法。


背景技术：

2.透明质酸(hyaluronic acid，简称ha)，又称玻尿酸，是一种由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的大分子黏性多糖，由meyer等人于1934年首次从牛玻璃球眼中提取获得。
3.文献研究显示，ha的生物活性依赖于其分子量的大小，不同分子量范围的ha表现出不同的生理学功能。高分子量ha由于具有较好的粘弹性、保湿性、抗炎、润滑等功能，可应用于化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。相比于高分子量ha，透明质酸寡聚糖具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，透明质酸寡聚糖在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。
4.透明质酸酶是能降解透明质酸及部分糖胺聚糖的一类糖苷酶。根据透明质酸酶的来源、催化机制和底物特异性差异，将其划分为三类：第一类为微生物来源的透明质酸裂解酶，这类透明质酸酶(ec 4.2.2.1)通过β消旋反应裂解透明质酸的β-1，4糖苷键，产生的寡聚糖的还原端为不饱和的n-乙酰氨基葡萄糖结构；第二类代表性的透明质酸酶(ec 3.2.1.36)主要来源于水蛭唾液腺，属于内切-β-葡萄糖醛酸苷酶，能够水解透明质酸的β-1，3糖苷键，产生的寡聚糖的还原端为葡萄糖醛酸结构；第三类透明质酸酶为内切-β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶(ec3.2.1.35)，主要来源于哺乳动物的睾丸及动物的毒液，能够水解透明质酸的β-1，4糖苷键，产生寡聚糖的还原端为饱和的n-乙酰氨基葡萄糖结构，而且这类酶的底物谱较宽，对硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构也有一定的催化活性。
5.目前公开的酶法制备透明质酸寡聚糖的方法主要集中在第一类透明质酸裂解酶(专利授权号：cn 105055440 b、cn 109517012 b)和第二类水蛭透明质酸酶(专利授权号：cn 106399428 b、cn 104178539 b)。由于目前商业化的第三类透明质酸酶(内切-β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶)主要为从牛睾丸提取获得的bth及部分用cho细胞重组表达的人源ph20酶，生产成本非常高，无法用于工业化制备透明质酸寡聚糖。因此，尚无用该类酶制备透明质酸寡聚糖的报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种酶法制备透明质酸寡聚糖。
7.具体来说，本发明涉及如下方面：
8.1.一种酶法制备透明质酸寡聚糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
9.配制透明质酸溶液，
10.将透明质酸酶加入所述透明质酸溶液进行反应得到透明质酸寡聚糖，
11.其中所述透明质酸酶的核苷酸序列如seq id no.3所示。
12.2.根据项1所述的方法，其特征在于，在所述透明质酸酶和所述透明质酸溶液构成的反应体系中，所述透明质酸的初始浓度为20-80g/l。
13.3.根据项1所述的方法，其特征在于，在所述透明质酸酶和所述透明质酸溶液构成的反应体系中，所述透明质酸的分子量大于或等于1
×
106da。
14.4.根据项1所述的方法，其特征在于，在所述透明质酸酶和所述透明质酸溶液构成的反应体系中，所述透明质酸酶的浓度为1.5
×
10
3-1
×
105u/ml。
15.5.根据项1所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为20-65℃，所述反应的时间为0.5-8h。
16.6.根据项1所述的方法，其特征在于，所述透明质酸溶液使用20-100mm，ph为4.0-6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制。
17.7.根据项1所述的方法，其特征在于，所述透明质酸寡聚糖包括还原端为饱和n-乙酰氨基葡萄糖的透明质酸寡聚糖。
18.8.根据项1所述的方法，其特征在于，所述透明质酸寡聚糖包括透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖和透明质酸十糖。
19.9.一种透明质酸寡聚糖组合物，其特征在于，所述透明质酸寡聚糖组合物包括透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖和透明质酸十糖。
20.10.根据项9所述的组合物，其是由项1～8中任一项所述的方法制备得到的。
21.本发明利用水解透明质酸β-1，4糖苷键的重组透明质酸酶直接降解透明质酸制备透明质酸寡聚糖，具有直接的目的性。首先，本发明获得的透明质酸寡聚糖的还原端为n-乙酰氨基葡萄糖，完善了通过细菌源透明质酸裂解酶及水蛭源透明质酸水解酶制备的透明质酸寡聚糖库，为学术界研究透明质酸寡聚糖的构效关系奠定了基础；其次，本发明反应条件极其简单，对仪器设备无要求，在常温常压下即可实施，且酶解工艺不需添加任何有机试剂，无任何污染废弃物产生；最后，本发明的反应体系为醋酸-醋酸钠缓冲液，经过后续简单的去蛋白、纳滤除盐，喷雾干燥工艺即可获得高纯度的透明质酸寡聚糖，在护肤品、保健品及寡糖药物等领域具有潜在而广泛的应用价值。
附图说明
22.图1是透明质酸水解产物的lcms-it-tof质谱总离子流峰图。
23.图2是透明质酸四糖(ha4)的离子强度图。
24.图3是透明质酸六糖(ha6)的离子强度图。
25.图4是透明质酸八糖(ha8)的离子强度图。
26.图5是透明质酸十糖(ha10)的离子强度图。
具体实施方式
27.下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
28.除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材
料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
29.透明质酸寡聚糖(oligosaccharides of ha，简称oligo-ha)为分子量在104da以下，单糖残基数量为2～25(一般为4～16)的ha分子片段。oligo-ha属于小分子多糖，其性质与普通ha有很大不同。研究表明，oligo-ha具有抗氧化、免疫调节、抗炎症和促进伤口愈合、促血管生成和抗肿瘤等生物活性。尤为重要的是，因其分子尺寸较小，可渗入到皮肤角质层发挥深层保湿和滋润的功效，可广泛应用到化妆品中。
30.本发明提供一种酶法制备透明质酸寡聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：配制透明质酸溶液，将透明质酸酶加入所述透明质酸溶液进行反应得到透明质酸寡聚糖，其中所述透明质酸酶的核苷酸序列如seq id no.3所示。
31.本发明使用的透明质酸酶是山大齿猛蚁来源的透明质酸酶，山大齿猛蚁来源的透明质酸酶属于第三类透明质酸酶，为内切-β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶，能够水解透明质酸的β-1，4糖苷键，产生终产物的还原端为n-乙酰氨基葡萄糖。另外，这类酶相比于第二类的水蛭透明质酸水解酶底物谱较宽，对硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构也有一定的催化活性。山大齿猛蚁透明质酸酶能够丰富透明质酸产物的种类，还可以具有除透明质酸酶催化以外的更广泛的应用范围。
32.本发明透明质酸酶的核苷酸序列如seq id no.3所示，由它编码的蛋白质序列如seq id no.4所示。seq id no.3所示的核苷酸序列可以使用毕赤酵母来生产透明质酸水解酶。在一个具体的实施方式中，使用毕赤酵母来生产透明质酸水解酶的方法包括使用bmmy培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸酶。其中bmmy培养基的组成为酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，k2hpo43g/l，kh2po
4 11.8g/l，ynb 3.4g/l，(nh4)2so
4 10g/l，生物素4
×
10-4
g/l，甲醇10ml/l。在一个优选的实施方式中，所述摇瓶发酵条件为：发酵温度为25℃-30℃，发酵过程中每隔24h补加0.5％-1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。本发明的透明质酸酶具有高的表达量，发酵结束时发酵上清液中透明质酸酶的活力可以高达67970.04u/ml。
33.在一个具体的实施方式中，在所述透明质酸酶和所述透明质酸溶液构成的反应体系中，透明质酸的初始浓度为20-80g/l，例如可以为20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l。例如，将透明质酸酶加入透明质酸溶液中形成的反应体系为1l，透明质酸初始含量为20-80g，即没有发生水解时的含量为20-80g。
34.所述透明质酸溶液可以使用各种水溶液配制。在一个优选的实施方式中，所述透明质酸溶液使用20-100mm，ph为4.0-6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制。使用20-100mm，ph为4.0-6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制透明质酸可以简化后续的透明质酸寡聚糖的纯化工艺。
35.在一个具体的实施方式中，在所述透明质酸酶和所述透明质酸溶液构成的反应体系中，透明质酸的分子量大于或等于1
×
106da，例如可以为1
×
106da、1.5
×
106da、2
×
106da、2.5
×
106da、3
×
106da等。其中，此处的分子量是指重均分子量。
36.在一个具体的实施方式中，在所述透明质酸酶和所述透明质酸溶液构成的反应体系中，所述透明质酸酶的浓度为3
×
10
3-1
×
105u/ml，例如可以为3
×
103u/ml、4
×
103u/ml、5
×
103u/ml、6
×
103u/ml、8
×
103u/ml、104u/ml、2
×
104u/ml、4
×
104u/ml、6
×
104u/ml、8
×
104u/ml、105u/ml。其中，透明质酸酶活力单位定义(u)为：在ph 5.5和38℃条件下，每小时从
透明质酸糖链中释放出1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量。
37.在一个具体实施方式中，所述反应的温度为20-65℃，反应时间为0.5-8h。
38.在一个具体的实施方式中，所述透明质酸寡聚糖包括还原端为饱和n-乙酰氨基葡萄糖的透明质酸寡聚糖。在一个优选的实施方式中，所述还原端为饱和n-乙酰氨基葡萄糖的透明质酸寡聚糖包括透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖和透明质酸十糖。
39.其中，透明质酸寡聚糖产物的检测采用水解产物结构分析方法。具体条件为：以岛津公司的lcms-it-tof液质联用仪进行产物分析，采用c
18
色谱柱，流动相为乙腈和水,流速为0.2ml/min，乙腈浓度线性递增至12％，至10min降为0。质谱在负离子模式下进行，每10s扫描一次，m/z范围为100-1500。在相同的操作条件下进行多级质谱分析。
40.本发明还提供一种透明质酸寡聚糖组合物，所述透明质酸寡聚糖组合物包括透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖和透明质酸十糖。
41.实施例
42.实施例1透明质酸酶基因(δn24hyal_om
opt
)表达系统的构建
43.化学合成密码子优化的透明质酸水解酶基因序列(hyal_om
opt
)，其序列如seq id no.1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。将hyal_om
opt
克隆到毕赤酵母表达载体ppic9k的ecori和noti酶切位点之间，得到重组表达载体ppic9k-hyal_om
opt
。重组表达质粒ppic9k-hyal_om
opt
经sali快切酶线性化后电转入p.pastoris gs115表达宿主细胞中，重组转化子经遗传霉素g418筛选获得高拷贝重组毕赤酵母p.pastoris gs115/ppic9k-hyal_om
opt
。
44.以ppic9k-hyal_om
opt
重组表达载体为模板，设计引物，截掉透明质酸水解酶基因序列(hyal_om
opt
)n端的一段信号肽序列，获得高表达透明质酸水解酶基因(δn24hyal_om
opt
)片段，其序列如seq id no.3所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.4所示。
45.其中引物序列如下：
46.上游引物f：5
’‑
ccggaattcatgaagacactacgcggctc-3’(seq id no.5)；
47.下游引物r：5
’‑
atttgcggccgctcaatgatgatgatggtggtgatgaagggtgaacttctt-3’(seq id no.6)；
48.需要说明的是，上游引物中的gaattc序列为引入的ecori限制性酶切位点，下游引物中的gcggccgc序列为引入的noti限制性酶位点，下游引物中的atgatgatgatggtggtg序列的反向互补序列编码6
×
his-tag标签。
49.对扩增得到的基因工程透明质酸水解酶基因片段进行ecori和noti双酶切后，克隆至经相同酶切处理的线性表达载体ppic9k上，转化至e.coil top10中，在确保阅读框不移码的前提下获得重组表达质粒ppic9k-δn24hyal_om
opt
，经dna测序比对，重组序列正确。重组质粒经限制性内切酶sali线性化后电转入p.pastoris gs115细胞中，重组转化子经遗传霉素g418筛选得到高拷贝透明质酸水解酶基因的重组菌p.pastoris gs115/ppic9k-δn24hyal_om
opt
。
50.实施例2透明质酸酶的表达
51.对获得的重组工程菌p.pastoris gs115/ppic9k-hyal_om
opt
和p.pastoris gs115/ppic9k-δn24hyal_om
opt
分别进行摇瓶发酵培养。发酵步骤如下：挑取单克隆接种于40ml的ypd培养基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)，30℃200rpm培养24h。按
10％的接种量转接于40ml的初始表达培养基bmgy(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，k2hpo
4 3g/l，kh2po411.8g/l，ynb 3.4g/l，(nh4)2so
4 10g/l，生物素4
×
10-4
g/l，甘油10ml/l)中，30℃、200rpm培养24h。离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体后更换至40ml诱导表达培养基bmmy(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，k2hpo
4 3g/l，kh2po
4 11.8g/l，ynb 3.4g/l，(nh4)2so
4 10g/l，生物素4
×
10-4
g/l，甲醇10ml/l)，30℃200rpm培养，每隔24h向培养基中添加纯甲醇至终浓度为1.0％(v/v)进行诱导表达，诱导表达96h。
52.发酵结束，采用dns法测定水解透明质酸产生的还原糖当量，用分析纯葡萄糖做标准曲线，计算出透明质酸酶活力。反应体系为1ml：将适量的发酵上清液(空白用等体积煮沸灭活后的发酵上清液)加入到800μl 2mg/ml透明质酸底物溶液中，用50mm柠檬酸缓冲液(ph 5.5)补足1ml，置于38℃孵育15min，反应结束后立即置于沸水浴中2min，使酶失活以终止反应。将处理后的1ml反应液加入到2ml dns(四水合酒石酸钾钠248g/l，3,5-二硝基水杨酸6.3g/l，2m氢氧化钠250ml/l，苯酚5.136g/l，亚硫酸钠5g/l)溶液中，震荡混匀，与葡萄糖标曲样品一起沸水浴10min；冰水浴降至室温后加入7ml去离子水，振荡混匀，540nm下测定吸光度，换算为反应产生的还原糖量，根据葡萄糖标准曲线计算出重组工程菌发酵上清液的粗酶活。
53.结果显示，重组菌株p.pastoris gs115/ppic9k-hyal_om
opt
的发酵上清液酶活为3547.88u/ml，而重组菌株p.pastoris gs115/ppic9k-δn24hyal_om
opt
的发酵上清液酶活达到67970.04u/ml。这说明高表达透明质酸水解酶基因(δn24hyal_om
opt
)相对于密码子优化的透明质酸水解酶基因(hyal_om
opt
)，表达能力提升近20倍，为使用酶法工业化生产寡糖成为了可能。
54.实施例3透明质酸酶的高密度表达
55.将重组菌株p.pastoris gs115/ppic9k-δn24hyal_om
opt
进行5-l发酵罐高密度培养。接ypd平板上的单菌落至50ml ypd液体培养基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)中，30℃220rpm培养24h，将培养液按10％接种至200ml bmgy培养基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，k2hpo
4 3g/l，kh2po
4 11.8g/l，ynb 3.4g/l，(nh4)2so
4 10g/l，生物素4
×
10-4
g/l，甘油10g/l)中，30℃220rpm培养24h；将培养24h的200ml种子液接入到含有2l bsm发酵培养基(甘油40g/l，k2so
4 18g/l，koh 4.13g/l，85％h3po
4 26.7ml/l，caso4·
2h2o 0.93g/l，mgso4·
7h2o 14.9g/l，4.4ml/l过滤除菌的ptm1；ptm1配方：cuso4·
5h2o 6g/l，ki 0.09g/l，mnso4·
h2o 3g/l，h3bo
3 0.02g/l，mona2o4·
2h2o 0.2g/l，cocl2·
6h2o 0.92g/l，zncl
2 20g/l，feso4·
7h2o 65g/l，生物素0.2g/l，h2so
4 5.0ml)的5-l发酵罐中。初始发酵参数设置为温度30℃，ph 5.5，通气量2.0vvm和转速500rpm；发酵过程中通过自动添加氨水将ph控制在5.5；待bsm培养基中的甘油被耗尽后，进入分批补料阶段，以指数流加的方式补加50％(v/v)甘油(含12ml/lptm1)，同时设置转速与溶氧do偶联，补料速率为前6h分别为13.5、16.2、19.2、22.8、27.2和32.4ml/h/l，随后6h的补料速率设置为30ml/h/l；补料结束后进入饥饿培养阶段，饥饿培养2-3h，至残余甘油耗尽；进入甲醇诱导阶段，流加含12ml/l ptm1的纯甲醇并且终浓度维持在1.8％(v/v)，同时将发酵温度调整至25℃，转速提高至1000rpm，诱导88h，甲醇流加速率和培养基中的甲醇终浓度由甲醇检测器实时在线控制。
56.结果显示，甲醇诱导88h时，发酵上清液透明质酸酶活力高达4.7
×
105u/ml，通过高密度发酵得到的酶活或蛋白表达水平是摇瓶发酵的6.97倍，进一步提升了透明质酸酶的
表达量。如此高的透明质酸酶表达量为工业化生产透明质酸寡糖提供了基础。
57.实施例4透明质酸酶的纯化制备
58.实施例3的发酵过程结束后，将发酵液离心，离心条件：11000rpm，10min，4℃。收集离心上清液，经0.22μm滤膜过滤除去颗粒性杂质，所得滤液进行低温超滤处理。有机超滤膜截留分子量大小为10kda，产物酶分子在截留液中，高价盐离子等小分子杂质则随透过液排出。超滤过程用冷却循环水给体系降温。超滤跟踪检测截留液电导率变化，当截留浓缩液液电导不再变化、且透过液流速降低时，加等体积纯化水稀释，以利透过；反复稀释数次，当截留浓缩液电导低于500μs/cm时，停止超滤，收集截留酶液，冰箱中冷藏备用。所得的透明质酸酶超滤浓缩液，经dns法酶活测定，纯化后的透明质酸酶活力为2.8
×
105u/ml。
59.实施例5透明质酸寡聚糖的制备
60.用实施例4制备的透明质酸酶超滤浓缩液对透明质酸进行水解，制备透明质酸寡聚糖。
61.在40g/l的透明质酸溶液中加入终浓度为6000u/ml的上述透明质酸酶超滤浓缩液。将反应体系在37℃，300rpm反应8h。
62.将8h反应结束后取的样预处理之后进行lcms-it-tof分析，ha寡糖经电喷雾电离(esi)后的负离子种类及分子量如表1所示。质谱检测结果如图1所示，在质谱总离子流峰图上的3.75min和4.05min出现的质谱峰在阴离子模式下[m-h]-为775.22，鉴定为透明质酸四糖(图2)；在质谱总离子流峰图上的5.15min和5.40min出现的质谱峰在阴离子模式下[m-h]-为1154.33、[m-h]
2-为576.66，鉴定为透明质酸六糖(图3)；在质谱总离子流峰图上的6.30min出现的质谱峰在阴离子模式下[m-h]
2-为766.21，鉴定为透明质酸八糖(图4)；在质谱总离子流峰图上的6.80min出现的质谱峰在阴离子模式下[m-h]
2-为955.77，经分析鉴定为透明质酸十糖(图5)。
[0063]
表1 ha寡糖的esi负离子种类及分子量
[0064][0065]
序列表
[0066]
seq id no.1：
[0067][0068]
seq id no.2：
[0069]
[0070]
[0071][0072]
seq id no.3
[0073][0074]
seq id no.4：
[0075]
[0076]
[0077][0078]
seq id no.5：
[0079]
ccggaattcatgaagacactacgcggctc
[0080]
seq id no.6：
[0081]
atttgcggccgctcaatgatgatgatggtggtgatgaagggtgaacttctt