一种基于多通道免标记电化学适配体传感器同时检测四种霉菌毒素的方法

1.本发明属于电化学分析领域，涉及一种基于多通道免标记电化学适配体传感器同时检测四种霉菌毒素的方法，具体涉及对黄曲霉毒素b1(afb1)、伏马毒素b1(fb1)、赭曲霉毒素a(ota)、玉米赤霉烯酮(zen)的灵敏、低成本检测。


背景技术：

2.霉菌毒素是真菌(曲霉、青霉和镰刀菌)的次生代谢产物，主要在农业收割、储存和运输过程中产生。虽然已经发现了300多种霉菌毒素，只有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素和玉米赤霉烯酮等少数种类霉菌毒素因其致癌性、致畸性、肝毒性、肾毒性以及广泛存在于农作物中，引起了人们的关注。更严重的是，已经有大量的报道证明霉菌毒素之间的协同或附加副作用使毒性倍增。afb1和ota通常在霉变的小麦和玉米中共存，由于协同作用，即使相对较低的摄入量也会对人体造成严重的危害。fb1和zen是谷物中最常见的共存组合，可协同增强对人类和动物的毒性。此外，afb1和fb1之间的协同作用也被证明可以增强动物肝脏的瘤前病变。因此，霉菌毒素的共存和协同作用是普遍的。
3.单一霉菌毒素的检测并不能准确地反映作物污染状况，因此发展多种霉菌毒素的同时检测是必要和关键的。与单一检测相比，多目标同时检测大大提高了检测效率，对于快速、低成本的检测具有重要意义。然而现有的多种霉菌毒素同时检测方法还无法满足的当前的检测需求。例如，荧光法是同时检测霉菌毒素的一种常规方法。虽然其检测速度快，颜色变化丰富，可用于半定量可视化检测，但为了避免荧光发射峰重叠，该方法通常只能同时检测两种霉菌毒素。基于高效液相色谱(hplc)的同时检测方法具有检出限低、准确度高等优点，但设备昂贵、操作复杂，限制了其应用。免疫层析可以实现快速、简单和即时检测数十种霉菌毒素。然而，昂贵的抗体和小区域密集且颜色相近的检测线易造成误读，阻碍了该方法的发展。电化学传感器具有检测快速、成本低、灵敏度高、可靠性高、选择性好等特点，广泛应用于医疗诊断、环境监测、食品安全等领域。电化学交流阻抗(eis)是描述电极界面电子转移电阻(r
et
)变化的直观方法，在直接和无标记检测方面具有特别的潜力。然而，基于eis方法同时检测农作物中多种霉菌毒素的方法还存在空缺。


技术实现要素：

4.本发明基于激光刻蚀的超简单ito阵列电极，结合纳米技术和生物传感技术，制备了一种多通道免标记电化学适配体传感器，用于同时检测fb1、afb1、ota和zen。所构建的电化学适配体传感器制备工艺简单，检测成本低，可以实现灵敏、同时定量检测fb1、afb1、ota和zen的目的。具有灵敏度高、检测范围广、选择性好等优点。
5.所采用的方案概括为：首先，将表面的不需要的氧化铟锡导电薄膜通过激光刻蚀掉，在ito上留出四块工作区域及相应的导电通道。然后，在预处理的ito阵列电极上电沉积金纳米粒子(aunps)。随后，巯基修饰的四种适配体分别通过au-s键自组装在电极的四个不
同工作区域。一定量的mch对电极上多余的活性位点进行封闭以避免干扰。当目标物存在时，目标物会被电极表面相应的适配体捕获，导致电化学信号的变化。本发明选用电化学阻抗谱来表征这种电化学信号的变化并与目标物浓度建立对应关系。
6.本发明是通过如下具体技术方案实现的：
7.一种基于多通道免标记电化学适配体传感器同时检测四种霉菌毒素的方法，按照下述步骤进行：
8.步骤1、多通道ito电极的制备及预处理：
9.将ito导电玻璃切割成小块的矩形，然后用激光蚀刻，留出所需的四个圆形工作区和各自的导电通道，然后将多通道ito电极分别在丙酮、乙醇和水中超声处理10min；然后，在红外灯下烘干多通道ito电极，将带有四个圆孔的茶色胶带(圆孔直径、位置与电极工作区域重合)覆盖在ito电极表面；覆盖茶色胶带既避免了导电通道被电沉积上aunps，也使工作区域变成了一个凹槽，为后续的滴涂各种溶液提供了方便。
10.其中，小块的矩形尺寸为35
×
25mm，四个圆形工作区的直径均为6mm。
11.步骤2、四个工作区域修饰金纳米粒子(ito-aunps)；
12.三电极体系中，参比电极选择为饱和甘汞电极，对电极选择为铂丝电极，工作电极为多通道ito电极。采用循环伏安法在haucl4溶液中进行电沉积，电沉积结束，电极(ito-aunps)在室温下用水冲洗并在氮气下干燥后，在4℃下储存以备后续使用。
13.其中，循环伏安法(cv)参数设置：起始～终止电压为-0.2～1.2v，扫描圈数为10～50圈，扫描速率为100mv s-1
。
14.步骤3、将apt1，apt2，apt3，apt4核酸适配体分别修饰在金纳米粒子表面(ito-aunps-apt)；
15.首先用三(2-羧乙基)膦(tcep)将巯基修饰的适配体apt1，apt2，apt3，apt4溶液分别进行活化，取20μl活化的适配体溶液apt1，apt2，apt3，apt4分别滴于ito阵列电极表面的工作区域(a，b，c，d区)，在4℃下孵育12h。然后，te缓冲液冲洗后，得到修饰适配体的ito-aunps(ito-aunps-apt)。
16.适配体apt1，apt2，apt3，apt4与tcep的摩尔比均为1:250。
17.其中，活化步骤：将新购的适配体13000rpm离心20min，加入一定量te缓冲液，制备10μm适配体储备液。在200μl适配体储备液(apt1、apt2、apt3、apt4)中分别加入5μl三(2-羧乙基)膦溶液(tcep，100mm，te缓冲液)。在室温下振荡1h后，离心过滤去除多余的tcep。四种活化的适配体分别分散在200μl te缓冲液中进行后续实验。
18.所使用的apt1用来识别捕获fb1，序列为：5'-sh-ata cca gct tat tca att aat cgc att acc tta tac cag ctt att caa tta cgt ctg cac ata cca gct tat tca att aga tag taa gtg caa tct-3'；
19.所使用的apt2用来识别捕获afb1，序列为：5'-sh-gtt ggg cac gtg ttg tct ctc tgt gtc tcg tgc cct tcg cta ggc cc-3'；
20.所使用的apt3用来识别捕获zen，序列为：5'-sh-tca tct atc tat ggt aca tta cta tct gta atg tga tat g-3'；
21.所使用的apt4用来识别捕获ota，序列为：5'-sh-gat cgg gtg tgg gtg gcg taa agg gag cat cgg aca-3'。
22.步骤3中，所使用的te缓冲溶液为50mm tris-hcl缓冲溶液含有1.0mm edta、5.0mm mgcl2、0.1m nacl、0.2m kcl，ph＝7.4。
23.步骤4、封闭工作区域多余的活性位点，多通道适配体传感器构建成功；
24.为了封闭多余的活性位点，在ito-aunps-apt表面滴入10μl 6-巯基己醇溶液，室温孵育0.5～1h，最后用te缓冲液冲洗，多通道适配体传感器构建成功了。
25.6-巯基己醇溶液浓度为2mm；溶剂是te缓冲溶液；
26.所使用的te缓冲溶液为50mm tris-hcl缓冲溶液含有1.0mm edta、5.0mm mgcl2、0.1m nacl、0.2m kcl，ph＝7.4。
27.步骤5、电化学阻抗法同时检测fb1、afb1、ota和zen。
28.(1)将四种霉菌毒素溶液fb1、afb1、ota和zen标准品分别溶解在pbs缓冲液中，分别取20μl滴在ito-aunps-apt的四个工作区域，孵育后，用te缓冲溶液冲洗后，在阻抗液中同时记录四个工作区域的eis信号；根据阻抗值的变化与对应的浓度建立标准曲线；
29.(2)在ito-aunps-apt的四个工作区域，均滴加未知浓度的fb1、afb1、ota和zen混合液，孵育后，用te缓冲溶液冲洗后，在阻抗液中同时记录四个工作区域的eis信号，将得到的信号值带入标准曲线，得出未知浓度的fb1、afb1、ota和zen混合液中，fb1、afb1、ota和zen各自的浓度。
30.步骤(1)中，eis测量时，测试频率范围为0.1hz至10khz，交流信号振幅为5mv。
31.步骤(1)和(2)中，孵育条件均为：37℃下孵育1h。
32.步骤5中，所使用的fb1浓度为：1～2000ng/ml；所使用的afb1浓度为：1～300ng/ml；所使用的zen浓度为：1～1500ng/ml；所使用的ota浓度为：1～1750ng/ml。
33.步骤5中，所使用的te缓冲溶液为50mm tris-hcl缓冲溶液含有1.0mm edta、5.0mm mgcl2、0.1m nacl、0.2m kcl，ph＝7.4。所使用的pbs缓冲溶液浓度为100mm，ph＝7.4。
34.步骤5中，所使用的阻抗液为0.1m的pbs缓冲溶液中含5.0mm[fe(cn)6]
3-/4-和0.1m kcl。
[0035]
本发明的有益效果为：
[0036]
本发明利用激光刻蚀ito电极设计多通道同时检测霉菌毒素传感器，运用核酸适配体对fb1，afb1，zen，ota的特异性识别作用，实现了对四种霉菌毒素的免标记灵敏检测，其特色和优点表述如下：
[0037]
(1)本发明是基于核酸适配体和目标物(fb1，afb1，zen和ota)的特异性识别作用并借助电化学工作站实现信号输出，该方法有特异性高、稳定性强等特点。
[0038]
(2)本发明采用ito作为工作电极，成本低，可重复使用。
[0039]
(3)本发明采用多通道工作电极，可以实现四种霉菌毒素同时检测，能很好的表明农作物受污染的情况。
[0040]
(4)本发明所提出的电化学适配体传感器实现了对fb1，afb1，zen和ota的灵敏检测，分别在5-1000ng/ml、10-250ng/ml、10-1250ng/ml、10-1500ng/ml的浓度区间内，霉菌毒素浓度与阻抗值呈现较宽且良好的线性关系。
[0041]
(5)与传统检测方法相比，本发明中所提出的同时检测的阻抗型传感平台具有制备工艺简单，检测过程耗时短，试剂用量少，检测成本低廉等特点。
附图说明
[0042]
图1为多通道芯片示意图；
[0043]
图2为多通道适配体传感器对不同浓度霉菌毒素响应图及相应的霉菌毒素和阻抗值变化的标准曲线图。
具体实施方式
[0044]
实施例1：
[0045]
(1)多通道ito电极的制备及预处理
[0046]
如图1所示，将ito导电玻璃切割成35
×
25mm的矩形，然后用激光蚀刻，留出所需的四个工作区a，b，c，d区，(直径＝6mm)和各自的导电通道。然后将多通道ito电极分别在丙酮、乙醇和水中超声处理10min。然后，在红外灯下烘干多通道ito电极，将带有四个圆孔的茶色胶带(25
×
25mm，圆孔直径6mm，位置与电极工作区域重合)覆盖在ito电极表面。
[0047]
(2)四个工作区域修饰金纳米粒子
[0048]
三电极体系中，参比电极选择为饱和甘汞电极，对电极选择为铂丝电极，工作电极为多通道ito电极。在2mm haucl4溶液中进行电沉积，循环伏安法(cv)参数设置：起始～终止电压为-0.2～1.2v，扫描圈数为50圈，扫描速率为100mv s-1
。电沉积结束，ito-aunps电极在室温下用水冲洗并在氮气流下干燥后，在4℃下储存以备后续使用。
[0049]
(3)四种核酸适配体修饰在金纳米粒子表面
[0050]
将新购的适配体13000rpm离心20min，加入一定量te缓冲液，制备10μm适配体储备液。在200μl巯基化适配体(10μm、apt1、apt2、apt3、apt4)中分别加入5μl三(2-羧乙基)膦溶液(tcep，100mm，te缓冲液)进行活化。在室温下振荡1h后，离心过滤去除多余的tcep。
[0051]
四种活化的适配体分别分散在200μl te缓冲液中进行后续实验。20μl活化的适配体溶液(apt1，apt2，apt3，apt4)分别滴于ito阵列电极表面的工作区域(a，b，c，d区)，在4℃下孵育12h。然后，te缓冲液冲洗三次后，得到修饰适配体的ito-aunps(ito-aunps-apt)。
[0052]
(4)封闭工作区域多余的活性位点
[0053]
为了封闭多余的活性位点，在ito-aunps-apt表面滴入10μl 6-巯基己醇溶液(2mm，te缓冲液)，室温孵育1h，最后用te缓冲液冲洗，多通道适配体传感器构建成功了。
[0054]
(5)电化学阻抗法同时检测fb1、afb1、ota和zen
[0055]
霉菌毒素检测流程：将20μl的四种霉菌毒素溶液(fb1、afb1、ota和zen标准品溶解在pbs缓冲液中)，分别滴在ito-aunps-apt的不同位置(a、b、c、d区)。在37℃下孵育1h后，用te缓冲溶液冲洗后，在阻抗液中同时记录四个工作区域的eis信号。对于eis测量，测试频率范围为0.1hz至10khz，交流信号振幅为5mv。根据阻抗值的变化与对应的浓度建立标准曲线。
[0056]
将未知浓度的霉菌毒素溶液，按上述方法测量eis信号，将得到的信号值带入标准曲线，得出未知浓度的混合液中，fb1、afb1、ota和zen各自的浓度。
[0057]
图1为多通道芯片示意图，空白区域为导电部分，圆形区域为工作区域。
[0058]
图2中，a、c、e、g为此传感器对不同浓度霉菌毒素的eis图，从图中可以看出，随着霉菌毒素浓度的增大，阻抗值(nyquist曲线中的半圆直径)也逐渐增大；b、d、e、h为不同eis图相对应的标准曲线图。