一种从新鲜猪肝中提取儿茶酚-O-甲基转移酶的方法与流程

一种从新鲜猪肝中提取儿茶酚-o-甲基转移酶的方法
技术领域
1.本发明属于生物行业及医学检测技术领域，尤其涉及一种从新鲜猪肝中提取儿茶酚-o-甲基转移酶的方法。


背景技术：

2.儿茶酚胺是肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺的总称，主要由交感神经和肾上腺髓质产生和释放。肾上腺髓质主要产生肾上腺素和少量的去甲肾上腺素，交感神经主要分泌去甲肾上腺素，两者在单胺氧化酶(mao)和儿茶酚-o-甲基转移酶(comt)作用下通过两种不同代谢途径最终生成3-甲氧-4-羟苦杏仁酸(vma，又称香草酸)，与葡萄糖醛酸或硫酸结合成酯类从尿中排出，在病理情况下，特别是嗜铬组织的肿瘤，分泌产生大量肾上腺素和去甲肾上腺素，引起血压升高。
3.comt以膜结合型和分泌型2种形式在哺乳动物多种组织中广泛存在，其主要功能发挥在多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等儿茶酚胺类神经递质的分解代谢中，其作用机制为将甲基供体上的甲基转移至儿茶酚胺的3位和4位羟基上，从而使儿茶酚胺类神经递质失活。因此comt在医学检验领域作用重要，特别在开发儿茶酚胺检测试剂盒研究中，而且目前国内尚无规模化提取方式。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种从新鲜猪肝中提取儿茶酚-o-甲基转移酶的方法。
5.本发明提供了一种从新鲜猪肝中提取儿茶酚-o-甲基转移酶的方法，包括：
6.s1)将新鲜猪肝进行组织破碎后，加入细胞裂解液进行浸提，离心，得到浸提液；
7.s2)调节所述浸提液的ph值至酸性进行酸处理后，离心，得到上清液；
8.s3)将所述上清液调节至中性或弱碱性后，进行硫酸铵分级沉淀，得到粗蛋白；
9.s4)将所述粗蛋白复溶后经中空纤维过滤浓缩，得到浓缩液；
10.s5)将所述浓缩液经离子交换层析纯化，得到儿茶酚-o-甲基转移酶。
11.优选的，所述细胞裂解液包括缓冲液、还原性谷胱甘肽、金属螯合剂与蛋白酶抑制剂；所述细胞裂解液的ph值为6.5～8；所述细胞裂解液中还原性谷胱甘肽的浓度为5～15mmol/l；所述细胞裂解液中金属螯合剂的浓度为0.5～3mmol/l；所述细胞裂解液中蛋白酶抑制剂的浓度为0.5～3mmol/l。
12.优选的，所述缓冲液为pbs缓冲液或tris缓冲液；所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸；所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟。
13.优选的，所述浸提的温度为2℃～8℃；所述浸提的时间为4～12h；所述离心在低温条件下进行；所述离心的转速为8000～15000rpm；所述离心的时间为10～50min。
14.优选的，所述步骤s2)中调节所述浸提液的ph值至4.5～5.5；所述酸处理的温度为2℃～8℃；所述酸处理的时间为10～50min。
15.优选的，所述步骤s3)中采用碱金属氢氧化物溶液调节所述上清液的ph值；将所述上清液调节至ph值为7～7.4。
16.优选的，所述步骤s3)中硫酸铵分级沉淀为两级硫酸铵沉淀，具体为：添加硫酸铵至其质量浓度为25％～35％，收集上清，然后在上清中添加硫酸铵至其质量浓度为50％～60％，收集沉淀，得到粗蛋白。
17.优选的，所述步骤s4)具体为：
18.将所述粗蛋白用缓冲液复溶后，依次用500～750kd中空纤维、100～300kd中空纤维与10～30kd中空纤维浓缩，得到浓缩液。
19.优选的，所述离子交换层析所用的填料为阴离子交换填料；所述离子交换层析所用的洗脱缓冲液为pb缓冲液与氯化钠水溶液；所述pb缓冲液的浓度为0.01～0.05mol/l；所述氯化钠水溶液的浓度为0.5～2mol/l；所述离子交换层析为洗脱缓冲液盐浓度逐步增加的阶梯梯度洗脱。
20.本发明还提供了上述方法提取的儿茶酚-o-甲基转移酶在制备儿茶酚胺检测试剂盒中的应用。
21.本发明提供了一种从新鲜猪肝中提取儿茶酚-o-甲基转移酶的方法，包括：s1)将新鲜猪肝进行组织破碎后，加入细胞裂解液进行浸提，离心，得到浸提液；s2)调节所述浸提液的ph值至酸性进行酸处理后，离心，得到上清液；s3)将所述上清液调节至中性或弱碱性后，进行硫酸铵分级沉淀，得到粗蛋白；s4)将所述粗蛋白复溶后经中空纤维过滤浓缩，得到浓缩液；s5)将所述浓缩液经离子交换层析纯化，得到儿茶酚-o-甲基转移酶。与现有技术相比，本发明提供的方法可规模化制备，成本较低，且得到的儿茶酚-o-甲基转移酶纯度高。
附图说明
22.图1为儿茶酚-o-甲基转移酶标准品的hplc图；
23.图2为本发明实施例中酶活测定前sam的hplc图；
24.图3为本发明实施例中酶活测定后的hplc图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明提供了一种从新鲜猪肝中提取儿茶酚-o-甲基转移酶的方法，包括：s1)将新鲜猪肝进行组织破碎后，加入细胞裂解液进行浸提，离心，得到浸提液；s2)调节所述浸提液的ph值至酸性进行酸处理后，离心，得到上清液；s3)将所述上清液调节至中性或弱碱性后，进行硫酸铵分级沉淀，得到粗蛋白；s4)将所述粗蛋白经中空纤维过滤浓缩，得到浓缩液；s5)将所述浓缩液经离子交换层析纯化，得到儿茶酚-o-甲基转移酶。
27.其中，本发明对所有原料来源并没有特殊的限制，为市售即可。
28.首先将新鲜猪肝进行组织破碎；所述新鲜猪肝优选取自宰杀不超过36h的猪类；本发明对猪的品种并没有特殊的限制，为家猪即可；在本发明中优选先用缓冲液冲洗猪肝表
面，然后用剪刀将其剪成块状，再用缓冲液洗涤后，进行组织破碎；所述缓冲液为本领域技术人员熟知的缓冲液即可，并无特殊的限制，本发明中优选为pbs缓冲液或tris缓冲液；所述缓冲液的ph值优选为6.5～8.0，更优选为7～7.5，再优选为7.2；所述缓冲液的浓度优选为0.01～0.05mol/l，更优选为0.01～0.02mol/l；洗涤时猪肝与缓冲液的比例优选为1：(10～50)(w/v)，更优选为1：(20～30)(w/v)；所述洗涤的次数优选为2～5次，更优选为2～3次；每次洗涤的时间优选为10～30s，更优选为20s。
29.然后在组织破碎后的猪肝中加入细胞裂解液进行浸提，离心，得到浸提液；所述组织破碎后的猪肝与细胞裂解液的比例优选为1：(1～5)(w/v)，更优选为1：(2～3)(w/v)；所述细胞裂解液优选包括缓冲液、还原性谷胱甘肽、金属螯合剂与蛋白酶抑制剂；所述细胞裂解液的ph值优选为6.5～8，更优选为7～7.5，再优选为7.2；所述缓冲液冲优选为pbs缓冲液或tris缓冲液；所述缓冲液的浓度优选为0.01～0.05mol/l，更优选为0.01～0.02mol/l；所述细胞裂解液中还原性谷胱甘肽(gsh)的浓度优选为5～15mmol/l，更优选为8～12mmol/l，再优选为10mmol/l；所述细胞裂解液中金属螯合剂的浓度优选为0.5～3mmol/l，更优选为1～2mmol/l，再优选为1mmol/l；所述金属螯合剂优选为乙二胺四乙酸；所述细胞裂解液中蛋白酶抑制剂的浓度优选为0.5～3mmol/l，更优选为1～2mmol/l，再优选为1mmol/l；所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟；所述浸提的温度优选为2℃～8℃，更优选为4℃～6℃；所述浸提的时间优选为4～24h；所述离心优选在低温条件下进行，更优选为在2℃～8℃，再优选为4℃～6℃下进行；所述离心的转速优选为8000～15000rpm，更优选为10000～12000rpm；所述离心的时间优选为10～50min，更优选为20～40min，再优选为30min；通过离心去除组织残渣得到上清即可为浸提液；在本发明中还可将上清进行过滤，得到浸提液；所述过滤所用滤布的目数优选为300～500目，更优选为400目。
30.调节所述浸提液的ph值至酸性进行酸处理后，离心，得到上清液；在本发明中优选采用酸性物质调节浸提液的ph值；所述酸性物质为本领域技术人员熟知的酸性物质即可，并无特殊的限制，优选为乙酸、盐酸与硫酸中的一种或多种；由于酸性处理在低温条件下进行，因此加入的酸性物质也优选为低温的酸性物质；利用酸性物质调节浸提液的ph值为4.5～5.5，更优选为5；所述酸性处理的温度优选为2℃～8℃，更优选为4℃～6℃；所述酸处理的时间优选为10～50min，更优选为20～40min，再优选为30min；所述离心优选在低温条件下进行，更优选为在2℃～8℃，再优选为4℃～6℃下进行；所述离心的转速优选为8000～15000rpm，更优选为10000～12000rpm；所述离心的时间优选为10～50min，更优选为20～40min，再优选为30min。
31.将所述上清液调节至中性或弱碱性后，进行硫酸铵分级沉淀，得到粗蛋白；在本发明中优选采用碱金属氢氧化物溶液调节所述上清液的ph值；所述碱金属氢氧化物溶液优选为氢氧化钠水溶液和/或氢氧化钾水溶液；所述碱金属氢氧化物溶液的浓度优选为0.5～2mol/l，更优选为1mol/l；将上清液的ph值调节为7～7.4，更优选为7.2；硫酸铵分级沉淀优选在冰浴条件下进行；所述硫酸铵分级沉淀为两级硫酸铵沉淀，具体为：添加硫酸铵至其质量浓度为25％～35％，收集上清，然后在上清中添加硫酸铵至其质量浓度为50％～60％，收集沉淀，得到粗蛋白；更优选具体为：添加硫酸铵至其质量浓度为28％～32％，收集上清，然后在上清中添加硫酸铵至其质量浓度为52％～58％，收集沉淀，得到粗蛋白；再优选具体为：添加硫酸铵至其质量浓度为30％，收集上清，然后在上清中添加硫酸铵至其质量浓度为
55％，收集沉淀，得到粗蛋白；在本发明中，添加硫酸铵后优选搅拌20～50min，更优选搅拌30～40min，收集上清或收集沉淀；所述收集上清与收集沉淀的方法均优选为离心；所述离心优选在低温条件下进行，更优选为在2℃～8℃，再优选为4℃～6℃下进行；所述离心的转速优选为8000～15000rpm，更优选为10000～12000rpm；所述离心的时间优选为10～50min，更优选为20～40min，再优选为30min。
32.将所述粗蛋白复溶后经中空纤维过滤浓缩，得到浓缩液；所述复溶优选采用缓冲液；所述缓冲液为本领域技术人员熟知的缓冲液即可，并无特殊的限制，本发明中优选为pbs缓冲液、tris缓冲液或pb缓冲液；所述缓冲液的ph值优选为6.5～8.0，更优选为7～7.5，再优选为7.2；所述缓冲液的浓度优选为0.01～0.05mol/l，更优选为0.01～0.02mol/l；在本发明中，粗蛋白复溶后优选透析，取上清过滤后再经中空纤维过滤浓缩；所述透析优选为透析至缓冲液的浓度为原始浓度的1.5～2倍；所述过滤优选采用0.22～0.45μm滤膜；或者在本发明中，粗蛋白复溶后离心，取上清过滤后再经中空纤维过滤弄多；所述离心优选在低温条件下进行，更优选为在2℃～8℃，再优选为4℃～6℃下进行；所述离心的转速优选为8000～15000rpm，更优选为10000～12000rpm；所述离心的时间优选为10～50min，更优选为20～40min，再优选为30min；所述过滤优选采用0.22～0.45μm滤膜；在本发明中优选采用不同截留分子量的中空纤维依次过滤浓缩；在本发明中此步骤优选具体为：依次用500～750kd中空纤维、100～300kd中空纤维与10～30kd中空纤维浓缩，得到浓缩液；更优选具体为：依次用600～750kd中空纤维、100～200kd中空纤维与10～20kd中空纤维浓缩，得到浓缩液；再优选具体为：依次用750kd中空纤维、150kd中空纤维与10kd中空纤维浓缩，得到浓缩液；在本发明中，所述中空纤维过滤浓缩均优选在低温条件下进行，更优选在2℃～8℃，再优选为4℃～6℃下进行；在本发明中，所述中空纤维过滤浓缩优选采用中空纤维柱过滤浓缩，以提高生产效率；在本发明中，中空纤维过滤浓缩后优选用缓冲液洗滤至导电率不超过4ms/cm。
33.将所述浓缩液经离子交换层析纯化；所述离子交换层析所用的填料优选为阴离子交换填料，更优选为q离子交换填料或deae离子交换填料；在本发明中优选采用pb缓冲液平衡离子交换填料；所述离子交换层析所用的洗脱缓冲液优选为pb缓冲液与氯化钠水溶液；所述pb缓冲液的浓度优选为0.01～0.05mol/l，更优选为0.02～0.03mol/l；所述pb缓冲液的ph值优选为7～7.5，更优选为7.2；所述氯化钠水溶液的浓度优选为0.5～2mol/l，更优选为1～1.5mol/l；所述离子交换层析优选为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为阶梯梯度洗脱，进一步具体为盐浓度逐步增加的阶梯梯度洗脱；更进一步具体依次为8％～12％、16％～25％、90％～100％洗脱氯化钠水溶液，更进一步具体依次为10％、20％、100％洗脱氯化钠水溶液。
34.经离子交换层析纯化后，优选冷冻干燥，得到儿茶酚-o-甲基转移酶。
35.在本发明中，优选还对得到的儿茶酚-o-甲基转移酶进行酶活检测；进一步优选的，可参考《rp一hpcl法测定鼠肝组织儿茶酚氧位甲基转移酶活性的研究》2009.1:59-61所示方法进行检测。
36.本发明提供的方法包括组织破碎，酸处理、硫酸铵沉淀、不同截留分子量的中空纤维柱处理、离子交换层析纯化、酶活测定等步骤，可规模化制备，成本较低，且得到的儿茶酚-o-甲基转移酶纯度高。
37.本发明制备的儿茶酚-o-甲基转移酶可用于生物行业及医学检测行业领域；优选的，可用于制备儿茶酚胺检测试剂盒。
38.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种从新鲜猪肝中提取儿茶酚-o-甲基转移酶的方法进行详细描述。
39.以下实施例中所用的试剂均为市售。
40.实施例1
41.所述新鲜猪肝中提取comt具体包括以下步骤：
42.1、原材料处理
43.先用0.01m pbs ph7.2冲洗肝脏表面，然后用剪刀将肝脏组织剪成块状放入容器。按1：20(w/v)加入0.01m pbs ph7.2并用玻璃棒搅拌20s洗涤块状组织，共洗涤3次；然后用绞肉机将组织绞碎。
44.按添加比例1:2(w/v)量取细胞裂解液0.01m pbs 10mm gsh 1mm edta 1mm pmsf ph7.2，冰浴搅拌浸提24h。
45.2、comt粗纯
46.浸提样品于低温、10000rpm离心30min去除组织残渣留上清；向上清中缓慢添加冰乙酸调节ph值至5.0，冰浴搅拌30min后4℃、10000rpm、30min离心，离心上清用1m氢氧化钠调节ph值至7.2。
47.硫酸铵沉淀：冰浴条件下，向调节好ph的上清中缓慢加入固体硫酸铵至浓度30％，搅拌30min后4℃、10000rpm、30min离心，留上清，再次向上清中缓慢补加硫酸铵至55％，冰浴搅拌30min后4℃、10000rpm、30min离心，收取沉淀。
48.沉淀用0.01m pb ph7.2复溶后于4℃、10000rpm离心30min后取上清，上清用0.45μm滤膜过滤。
49.3、中空纤维洗滤截留
50.750kd中空纤维柱管路预冷管路，进行样品浓缩，收集滤出液；
51.750kd中空纤维柱滤出液继续用150kd中空纤维柱管路浓缩，继续收集滤出液。
52.150kd中空纤维柱管路滤出液用10kd中空纤维柱管路浓缩，并用0.01m pb ph7.2洗滤至电导率不超过4ms/cm。
53.4、离子交换层析
54.10kd中空纤维浓缩样品过deae离子交换柱进行梯度洗脱所用平衡缓冲液为0.01m pb ph7.2缓冲液，用0.01m pb 1m nacl ph7.2进行梯度洗脱(阶梯梯度洗脱10％、20％、100％洗脱氯化钠水溶液)，收集洗脱液20％部分组分。收集液冻干后，得到comt冻干粉，进行酶活测定。
55.5、酶活测定
56.测定方法参考《rp一hpcl法测定鼠肝组织儿茶酚氧位甲基转移酶活性的研究》2009.1:59-61所示方法进行检测。
57.具体操作为：用1.25ml水溶解comt冻干粉，将混匀后的冻干粉取出体积20μl，加入480μl反应液0.1m pb 2mm mgcl2 0.2mm sam 0.2mm 3,4-二羟基苯甲酸ph值7.8，涡旋后37℃水浴30min，加入80μl冰冷的2m高氯酸沉淀蛋白以终止反应，冰浴10min，15000g离心15min后，取出400μl上清进行反相hplc分析，分析参数见表1，得到酶活测定前后的hplc图
如图2与图3所示，图1为儿茶酚-o-甲基转移酶标准品的hplc图。
58.hplc分析：由图3可知，生成物4-羟基-3-甲氧基苯甲酸在15min左右保留时间处出峰，以产物4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的峰面积对浓度线性回归，相关系数r2＞0.99。经检测纯化后酶活性浓度可达1500nm/(h
·
mg)。
59.表1 hplc参数
60.色谱参数名称色谱分析条件色谱柱型号zorbax eclipse xdb-c18(4.6*250mm，5μm)流动相a(0.7％冰乙酸)：b(甲醇)＝77:23检测波长254nm流速1ml/min柱温25℃运行时间20min进样量20μl