一种口服型复合菌株发酵产物及其应用的制作方法

1.本发明涉及ipc a23l33/135技术领域，尤其涉及一种口服型复合菌株发酵产物及其应用。


背景技术：

2.通过微生物改善肠道菌群平衡已成为市场的热门研发方向，但是益生菌对介质ph较为敏感，且稳定性差，需要定期植入，无法长期有效调节肠道健康；益生元能够为人体微生物提供补给，但是需要经过肠道微生物代谢或吸收后才能起效，调节速率慢且不可控；后生元作为益生菌与益生元的作用产物，能够直接被上皮细胞吸收，且在基体内的稳定性高，能够有效弥补益生菌、益生元的局限性，调节肠道生态平衡，具有更高的利用价值。但是后生元的效果受益生菌、益生元的多重影响，目前未有成熟的技术将其应用于口腔卫生领域。
3.中国专利cn201710275145.6公开了一种抗菌、清新口气的口腔护理物，采用厚朴树皮提取物和果蔬植物发酵产物作用，抑制了细菌在牙齿和口腔中的附着和滋生。中国专利cn201510360355.6公开了一种益生微生态制剂的制备方法，收集健康动物消化道内容物或粪便，在低于42℃的厌氧条件下连续发酵，得到有利于调节肠道微生物，刺激机体免疫系统发育的发酵产物。但是上述技术所得到的产物均具有一定的局限性，无法同时调节口腔以及肠道健康，且发酵产物的稳定性较差，局限了在应用过程中的应用。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种口服型复合菌株发酵产物。所述发酵产物的制备工艺为：
5.s1.制备发酵基料；
6.s2.于发酵基料中接种复合菌株，发酵培养，得到发酵产物原液；
7.s3.对发酵产物原液进行后处理，得到发酵产物成品。
8.通过微生物改善肠道菌群平衡已成为市场的热门研发方向，但是益生菌对介质ph较为敏感，且稳定性差，需要定期植入，无法长期有效调节肠道健康；益生元能够为人体微生物提供补给，但是需要经过肠道微生物代谢或吸收后才能起效，调节速率慢且不可控；后生元作为益生菌与益生元的作用产物，能够直接被上皮细胞吸收，且在基体内的稳定性高，能够有效弥补益生菌、益生元的局限性，调节肠道生态平衡。本技术发现，将豆科植物进行处理得到发酵基料，接种双歧杆菌和乳酸杆菌组成的复合菌株，能够得到稳定性高，有效调节人体微生态的发酵产物。
9.在一些优选的实施方式中，所述s1步骤具体为，将豆科植物置于水中浸泡，然后研磨挤压，得到浆料；对浆料进行第一次灭菌处理，即为发酵基料。
10.所述豆科植物包括黄豆，黑豆，菜豆，绿豆，黄豆，蚕豆，红豆，青豆中的至少一种。
11.进一步优选，所述豆科植物为黑豆。
12.在一些优选的实施方式中，所述黑豆的产地为中纬度温带地区；更进一步优选，所
述黑豆的产地为亚洲东部沿海地区，例如中国，日本，韩国；最优选为日本种植的非转基因黑豆。
13.作为微生物的代谢活动的基底，本发明发现，当选择亚洲东部沿海地区种植的豆科植物时，能够促进复合菌株代谢过程中释放多种活性物质，尤其能够帮助肠道中的益生菌增殖，帮助降低血糖，预防肥胖；同时能够治疗腹泻，抗菌抗炎。本发明发现，尤其当选择日本种植的非转基因黑豆作为基料时，所得到的发酵产物能够明显促进肠道微生物及其代谢物之间的互养作用及代谢交换，一方面能够塑造良好的肠道微生物栖息环境；另一方面能够调控神经递质的分泌，改善基体整体健康状况。
14.在一些优选的实施方式中，所述浸泡的条件为：将豆科植物与水按照固液比为1：(2-20)混合，在20-45℃条件下浸泡5-48h，然后升温至70-90℃浸泡0.2-0.6h。
15.在一些优选的实施方式中，所述研磨过程的操作温度为50-65℃。
16.在一些优选的实施方式中，所述第一次灭菌处理过程中灭菌温度为90-130℃，灭菌时间为5-30min。
17.在一些优选的实施方式中，所述复合菌株为双歧杆菌和乳酸杆菌复配。
18.在一些优选的实施方式中，所述双歧杆菌包括长双歧杆菌，两歧双歧杆菌，青春双歧杆菌中的至少一种。
19.在一些优选的实施方式中，所述乳酸杆菌包括嗜酸乳杆菌，短乳杆菌，詹氏乳杆菌，瑞士乳杆菌，乳酸乳球菌，干酪乳乳酸杆菌，鼠李糖乳杆菌，乳酸肠球菌，嗜热链球菌，类干酪乳杆菌类干酪亚种，加氏乳杆菌，德氏乳杆菌中的至少一种。
20.进一步优选，所述复合菌株为长双歧杆菌bifidobacterium longum，两歧双歧杆菌bifidobacterium bifidum，青春双歧杆菌bifidobacterium adolescentis，嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus，短乳杆菌lactobacillus brevis，詹氏乳杆菌lactobacillus jensenii，瑞士乳杆菌lactobacillus helbeticus，乳酸乳球菌lactococcus lactis，干酪乳乳酸杆菌lactobacillus casei subsp.casei，鼠李糖乳杆菌lactobacillus rhamnosus，乳酸肠球菌enterococcus faecium，嗜热链球菌streptococcus thermophilus，类干酪乳杆菌类干酪亚种lactobacillus paracasei subsp.paracasei，加氏乳杆菌lactobacillus gasseri，德氏乳杆菌lactobacillus delbrueckii。
21.其中，所述德氏乳杆菌优选为以下6种中的至少一种：德氏乳杆菌保加利亚亚种lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，德氏乳杆菌桑基亚种：lactobacillus delbrueckii subsp.sunkii，德氏乳杆菌德氏亚种lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii，德氏乳杆菌乳酸亚种(德氏乳杆菌乳亚种)lactobacillus delbrueckii subsp.lactis，德氏乳杆菌印度亚种lactobacillus delbrueckii subsp.indicus，德氏乳杆菌雅各布森亚种lactobacillus delbrueckii subsp.jakobsenii。
22.在一些优选的实施方式中，所述接种操作中，复合菌株的加入量占发酵基料总体积的0.1-4％。
23.在一些优选的实施方式中，所述发酵培养过程中，发酵温度为35-37.8℃，发酵时间为3-10d，发酵培养过程中控制转速为50-300r/min。
24.不同菌种的发酵代谢产物具有不同的功效，为了优化培养流程，本发明尝试采用多重菌种共培养方法，但是多重菌种的发酵过程较难控制，发酵产物的稳定性较差。本发明发现，采用仿人体发酵过程得到的发酵基料，配合上述复合菌株交叉喂养，所得代谢产物富含多种氨基酸、脂肪酸、核苷、羟基酸等活性分子，兼具调控能力强，稳定性高，安全可靠的的特点。
25.本发明进一步发现，当复合菌株的加入量占发酵基料总体积的0.1-4％时，能够最大程度促进维生素、生物活性肽等活性因子的生成，而这些因子又促进了菌种的增殖，形成良性循环培养机制，肠道内代谢分泌得到有效调控，改善了饮食不均衡，肠道通透性差的问题。肠道微生物群的改变反馈到自主神经系统，基体内释放神经炎症信号的通路被阻断，皮脂分泌、炎症以及氧化应激反应得以抑制。
26.在一些优选的实施方式中，所述s3步骤具体为，对发酵产物原液进行第二次灭菌处理，然后过滤，收集滤渣，在30-50℃条件下放置5-40h，得到发酵产物成品。
27.在一些优选的实施方式中，所述杀菌过程中杀菌温度为85-120℃，杀菌时间为5-30min。
28.在一些优选的实施方式中，所述过滤操作中过滤孔径≤270μm。
29.肠道微生物以内部和人际方式传播到口腔，构成肠道-口腔-微生物轴，当口腔-肠道屏障破坏时，口腔微生物群将转移至肠道中，口腔和肠道微生物组之间的双向作用通过竞争/合作在两个栖息地发展微生物生态系统，调节胃肠道的生理过程。本发明发现先对发酵产物原液进行高温灭菌处理，然后在≤270μm孔径(尤其是20-80μm)过滤、低温干燥处理后，得到的发酵产物能够调节口腔微生物活动，受试者在使用发酵产物1个月后，体内放线菌、变形菌明显增长，而拟杆菌、牙龈卟啉单胞菌含量大幅下降，有效避免蛀牙和牙龈疾病；口腔微生物群的优化进一步调节肠道作用，增加人体内情绪修复神经递质的转化，帮助调节情绪，使焦虑、抑郁症状明显减弱；同时所得发酵产物的稳定性进一步提升，能够在不同ph条件下稳定储存，并且在高温下不易变质，发酵产物的实用性得以显著提升。
30.本发明第二方面提供了一种口服型复合菌株发酵产物在口腔、肠道、皮肤调理领域中的应用。
31.有益效果：
32.本技术提供的口服型复合菌株发酵产物具有以下优点：
33.(1)能够作用于人体肠道-口腔-皮肤轴，有效调节人体生态系统中微生物平衡，促进益生菌增殖；
34.(2)能够有效缓解炎症、痤疮等病变，调节肠道稳态和全身免疫；
35.(3)能够增加增强身体能量消耗和脂质氧化，实现体重管理；同时能够促进情绪修复神经递质的转化，帮助情绪调节；
36.(4)本技术发酵产物的制备工艺简便，得到的产物具有稳定性好，耐温性强，不易变质的优点，在应用于下游产品时配方相容性强。
具体实施方式
37.实施例1.
38.本实施例提供了一种口服型复合菌株发酵产物，所述发酵产物的制备工艺为：
39.s1.制备发酵基料；
40.s2.于发酵基料中接种复合菌株，发酵培养，得到发酵产物原液；
41.s3.对发酵产物原液进行后处理，得到发酵产物成品。
42.所述s1步骤具体为，将豆科植物置于水中浸泡，然后研磨挤压，得到浆料；对浆料进行第一次灭菌处理，即为发酵基料。
43.所述豆科植物为黑豆，具体为日本非转基因黑豆。
44.所述浸泡的条件为：将豆科植物与水按照固液比为1：5混合，在36.5℃条件下浸泡10h，然后升温至75℃浸泡0.4h。
45.所述研磨过程的操作温度为55℃。
46.所述第一次灭菌处理过程中灭菌温度为115℃，灭菌时间为20min。
47.所述复合菌株为双歧杆菌和乳酸杆菌复配；双歧杆菌和乳酸杆菌的细菌细胞数分别为3
×
107个，8
×
107个。
48.所述双歧杆菌包括长双歧杆菌，两歧双歧杆菌，青春双歧杆菌；长双歧杆菌，两歧双歧杆菌，青春双歧杆菌的细菌细胞数之比为1:2:1。
49.所述乳酸杆菌包括嗜酸乳杆菌，瑞士乳杆菌，乳酸乳球菌，干酪乳乳酸杆菌，鼠李糖乳杆菌，嗜热链球菌，加氏乳杆菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种。
50.所述嗜酸乳杆菌，瑞士乳杆菌，乳酸乳球菌，干酪乳乳酸杆菌，鼠李糖乳杆菌，嗜热链球菌，加氏乳杆菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种的细菌细胞数之比为1:1.5:1:0.5:1:1.4:1:0.6。
51.所述接种操作中，复合菌株的加入量占发酵基料总体积的1.2％。
52.所述发酵培养过程中，发酵温度为36.5℃，发酵时间为5d，发酵培养过程中控制转速为150r/min。
53.所述s3步骤具体为，对发酵产物原液进行第二次灭菌处理，然后过滤，收集滤渣，在38℃条件下放置25h，得到发酵产物成品。
54.所述杀菌过程中杀菌温度为115℃，杀菌时间为10min。
55.所述过滤操作中过滤孔径为44μm。
56.性能测试
57.1.调节能力测试
58.筛选60名年龄介于25-60岁之间的健康非吸烟者作为受试者((36名男性，24名女性，并且每个人都完成了研究；平均受试者年龄为23.7岁)进行如下测试，受试者患有抑郁、焦虑症状，bmi范围为18-25kg/m2，保持正常饮食和体力活动。将受试者随机分配为2组，1组每天服用100mg实施例1所得到的发酵产物，1组每天服用相同量安慰剂，持续服用4周。
59.所述安慰剂具体为麦芽糊精，来源于中信糊精有限公司。
60.(1)肠道菌群
61.测定受试者肠道微生物群变化(粪便样本)：监测菌种为长双歧杆菌，嗜酸乳杆菌，植物乳杆菌，肠道罗斯拜瑞氏菌，普拉梭菌，嗜粘蛋白艾克曼菌。计算各菌种4周后的增殖，记录于表1。
62.(2)口腔菌群
63.测定受试者口腔微生物群变化(唾液样本)：监测菌种为拟杆菌，放线菌，变形菌，
牙龈卟啉单胞菌，记录于表2。
64.(3)ibs(肠易激综合症)
65.受试者于初始和四周后分别对腹痛，大便频率，大便稠度进行评分，记录各测评项目4周后的评分结果；计算每组受试者各测评项目评分的平均值，记录于表3。
66.腹痛：0(不痛)-10(极痛)；
67.大便频率：0(频率低)-30(频率高)；
68.大便稠度：0(稠度低)-8(稠度高)。
69.(4)抗炎祛痘
70.受试者于初始，使用2周后和使用4周后对身体炎症病变，痤疮严重程度进行评分，记录每组受试者各阶段评分结果于表4。同时，测定痤疮部位的igf-1(促生长因子)表达(标记物测定mrna)的变化。
71.炎症病变：0(无症状)-5(症状严重)；
72.痤疮严重程度：0(无症状)-4(症状严重)。
73.4周后使用实施例1的受试者的炎症病变下降-20％，igf-1表达平均下降-26％，使用安慰剂的受试者的炎症病变和igf-1表达未出现明显变化。可见，实施例1提供的复合菌株发酵产物可以通过调节肠道微生物群来改善痤疮患者皮肤状况，为寻求治疗和减少寻常痤疮的天然替代方法的患者和医疗保健提供者的有效选择。
74.(5)体重调节
75.持续使用发酵产物/安慰剂4周后，测定受试者体重相关指数变化，并计算各组受试者的测试结果平均值，记录于表5和表6。
76.注：表4中各测量参数的测试结果为标记物测定mrna表达。
77.(6)情绪评分
78.对受试者在初始和4周后分别进行焦虑症状和抑郁症状评分，记录四周后评分变化于表7。
79.2.理化性能测试
80.(1)水溶性：
81.将实施例1提供的复合菌株发酵产物与水按照重量比为1:9混合，在26℃搅拌5min，得到沉淀量＜2wt％的水分散液。
82.(2)高温稳定性：
83.将上述水分散液分别置于65℃和90℃的烘箱中放置30min，取出后观察水分散液与放入前无差异。
84.性能测试数据
85.表1.
[0086] 实施例1安慰剂长双歧杆菌﹢28％﹢0.2％嗜酸乳杆菌﹢25％﹢0.1％植物乳杆菌﹢29％﹢0.4％肠道罗斯拜瑞氏菌﹢15％0普拉梭菌﹢23％﹢0.1％
嗜粘蛋白艾克曼菌﹢11％0
[0087]
表2.
[0088] 实施例1安慰剂拟杆菌-45％-2％放线菌﹢66％-4％变形菌﹢54％﹢8％牙龈卟啉单胞菌-53％-1％
[0089]
表3.
[0090] 实施例1安慰剂腹痛-30％0大便频率-26％-4％大便稠度-17％-1％
[0091]
表4.
[0092][0093]
表5.
[0094]
测试参数实施例1安慰剂parkin﹢130％-12％pink1﹢112％﹢10％nix﹢65％-6％lc3
‑ⅱ
﹢132％-12％lamp2﹢261％﹢8％mfn2﹢158％-5％
[0095]
表6.
[0096]
测试参数单位实施例1安慰剂体重变化kg-1.3﹢0.1体重指数变化kg/m2-0.50体脂变化kg-1.30腰围变化cm-2.3-0.1臀围变化cm-1.9-0.2大腿围变化cm-0.7﹢0.1
[0097]
表7.
[0098] 实施例1安慰剂
焦虑症状-27％0抑郁症状-22％-2％