一种高活性和高热稳定性的纳豆激酶突变体

1.本发明涉及一种高活性和高热稳定性的纳豆激酶突变体，属于蛋白质工程领域。


背景技术：

2.纳豆激酶(natto kinase，nk)是枯草杆菌蛋白酶家族的一种依赖钙离子的丝氨酸蛋白酶，作为一种高效的纤溶酶在血栓治疗和食品工业中具有潜在的应用前景。然而，纳豆激酶和其他嗜中性枯草杆菌丝氨酸蛋白酶一样，在30℃-50℃具有广泛的活性，但在55℃以上由于不可逆的自溶而迅速失活，这给工业领域的纯化和催化带来了困难。因此，热稳定性更高的纳豆激酶的开发将增加生物催化剂在医药和食品工业生产中的应用。针对这一问题，许多研究者通过在纳豆激酶氨基酸序列中突变相应的氨基酸以引入氢键，二硫键，离子键等相互作用，以提升纳豆激酶的热稳定性。但是，在前期的针对纳豆激酶的改造的研究中都会存在这样一个问题：即提升热稳定性的同时纳豆激酶对应的催化效率就会降低，反之，提升催化效率的同时对应的热稳定性就会降低，这一“稳定性-活性的权衡”使得纳豆激酶的改造面临较大的困难。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明通过对氨基酸序列如seq id no.1的纳豆激酶进行定点突变，以筛选获得一系列纳豆激酶突变体。
4.本发明的第一个目的是提供一种兼具高活性与高热稳定性的纳豆激酶突变体，所述纳豆激酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2～seq id no.4所示。
5.本发明的第二个目的是提供一种编码上述纳豆激酶突变体的基因。
6.本发明的第三个目的是提供一种携带上述基因的重组载体。
7.本发明的第四个目的是提供一种携带上述基因，或上述重组载体的微生物细胞。
8.在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
9.在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为表达宿主。
10.在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis comk为宿主。
11.本发明的第五个目的是提供一种重组菌，所述重组菌表达上述纳豆激酶突变体，以穿梭质粒pbp43-wapa-pro-nk-ter为表达载体，以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis comk为宿主。
12.本发明还提供上述纳豆激酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述重组菌在医药、食品领域的的应用。
13.本发明还提供上述纳豆激酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述重组菌在制备治疗、预防和/或缓解心血管疾病的药物中的应用。
14.本发明还提供上述纳豆激酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物
细胞，或上述重组菌在制备预防和/或缓解心血管疾病的食品中的应用。
15.有益效果：
16.1、本发明针对纳豆激酶的22个氨基酸位点进行定点突变，并根据比酶活高于野生酶，65℃处理30min残余酶活高于60％筛选得到7个突变体s62a、p57c、a92c、n181d、y217k、n218s和n259p。
17.2、将筛选到的7个突变位点进行组合突变，获得高热稳定性突变体m2(s62an181dy217kn218sn259p)，高活性突变体m3(p57ca92c)以及兼具高活性与高热稳定性突变体m4(s62ap57ca92cn181dy217kn218sn259p)。其中突变体m4纯化后在55℃与65℃下半衰期分别较野生型提升了20.7倍与12.9倍，这是目前已有的报道中关于纳豆激酶热稳定性最优的突变体，同时比酶活也较野生型提升了2.1倍。本发明实现了在提升纳豆激酶热稳定性的同时保持其催化活性，以突破“稳定性活性的权衡”，为纳豆激酶工业化应用奠定了基础。
附图说明
18.图1：野生型，m2，m3，m4在55℃与65℃下半衰期。
19.图2：野生型，m2，m3，m4比酶活。
20.图3：纯酶的sds-page电泳图，m：蛋白marker；1：野生型(wt)；2：突变体m2；3：突变体m3；4：突变体m4。
具体实施方式
21.培养基：
22.lb培养基(1l)：胰蛋白胨10g，nacl 10g，酵母提取物5g，ph 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。
23.tb培养基(1l)：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，kh2po42.31g，k2hpo412.54g，甘油4g。
24.缓冲液：
25.柱平衡缓冲液：20mm-tris-hcl,ph 8.1
26.洗脱缓冲液：20mm-tris-hcl,0.5m nacl,ph 8.1。
27.质粒与宿主：
28.采用穿梭质粒pbp43-wapa-pro-nk-ter为载体构建各突变体，以e.coli jm109为克隆宿主构建质粒，以bacillussubtilis comk为表达宿主进行各突变体质粒表达验证。
29.bacillus subtilis comk：已公开于文章https://doi.org/10.1186/s12934-019-1148-3中。
30.pbp43-wapa-pro-nk-ter：已公开于文章https://doi.org/10.1186/s12934-019-1148-3中。
31.实施例1：突变体质粒构建
32.根据本实验室已有的含有纳豆激酶野生型序列的穿梭质粒pbp43-wapa-pro-nk-ter，以全质粒pcr的方法构建单点突变体。突变序列设计在上游引物同源臂上，通过全质粒pcr方法扩增得到单点突变体质粒，相应单点突变位点的引物见表1。
33.根据本实验室已有的含有纳豆激酶野生型序列的穿梭质粒pbp43-wapa-pro-nk-ter，以组装的方法构建双点突变体质粒，以pcr方法分别构建质粒骨架片段与目的片段。质粒骨架pcr反应条件同单点突变的条件，相应双点突变位点的引物见表2。
34.pcr反应条件如下：50μl体系，98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min 30s，72℃延伸5min，共30个循环。
35.核酸凝胶验证各片段大小正确后将pcr产物用1μldpni消化酶消化3h后，取4μl质粒骨架片段与目的片段加入4μl组装酶，混匀后置于50℃环境下反应30min，随后转化至大肠杆菌e.coli jm109，涂布于含100mg/l氨苄青霉素的固体lb平板中，37℃倒置过夜培养12-16h后，挑取单菌落接种于5ml含100mg/l氨苄青霉素的液体lb培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜后12000rpm离心3min收集菌体，使用商品化质粒抽提试剂盒获得重组质粒，由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证，最终得到各突变体质粒。
36.表1单点突变引物
37.[0038][0039]
表2双点突变体引物
[0040][0041]
[0042]
实施例2：依据比酶活与热稳定性筛选突变体
[0043]
将实施例1中测序验证正确的各突变体质粒转化枯草芽孢杆菌bacillus subtilis comk，涂布于含有50mg/l卡那霉素的固体lb平板中，37℃倒置过夜培养。培养12-16h后挑取单菌落接种于5ml含50mg/l卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm振荡培养24h后4℃，12000rpm离心3min收集上清液进行比酶活与热稳定性检测。
[0044]
总酶活检测方案如下：40μl稀释适宜倍数样品和80μl终浓度为0.4mm的模式底物suc-aapf-pna，另加80μl缓冲液(ph 8.0100mm tris-hcl和0.1mm cacl2)。用酶标仪在405nm下连续监测5min，每隔1min取一次读数。
[0045]
一个酶活单位定义为25℃检测条件下每分钟产生1μmol p-na的酶量。总酶活为每毫升上清液的酶活。比酶活为每毫克纳豆激酶所具有的酶活力。蛋白浓度使用bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。
[0046]
热稳定性检测方案：取1ml上清样品，65℃处理30min后测定残余的酶活。残余酶活定义为处理后的上清液总酶活与处理前上清液总酶活的比值。
[0047]
最终筛选出比酶活≥野生型且残余酶活≥60％的突变体。
[0048]
表3纳豆激酶突变体筛选
[0049]
[0050][0051]
实施例3：组合突变体质粒构建与表达纯化
[0052]
依据之前的正向突变位点，以pcr的方式进行质粒骨架与目的片段构建，设计定点突变的突变引物，以含有纳豆激酶野生型序列的穿梭质粒pbp43-wapa-pro-nk-ter为模板进行多轮单点突变pcr，构建获得多位点突变质粒m2，每轮突变经pcr及模板消化反应两个步骤，核酸凝胶电泳验证结果正确后进行下一轮突变。核酸凝胶电泳验证大小正确后用1μl dpni消化酶消化3h，后采用吉布森组装构建完整质粒m2。
[0053]
根据本实验室已有的含有纳豆激酶野生型序列的穿梭质粒pbp43-wapa-pro-nk-ter，以组装的方法构建m3质粒，以pcr方法分别构建质粒骨架片段与目的片段。质粒骨架pcr反应条件同单点突变的条件，相应双点突变位点的引物见表5。再以构建好的m2质粒为模板，利用表5中的引物，采用组装的方法构建m4质粒。
[0054]
核酸凝胶验证各片段大小正确后将pcr产物用1μldpni消化酶消化3h后，取4μl质粒骨架片段与目的片段加入4μl组装酶,混匀后置于50℃环境下反应30min。转化大肠杆菌e.coli jm109，涂布于含100mg/l氨苄青霉素的固体lb平板中，37℃倒置过夜培养12-16h后，挑取单菌落接种于5ml含100mg/l氨苄青霉素的液体lb培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜后12000rpm离心3min收集菌体，使用商品化质粒抽提试剂盒获得重组质粒，由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证，最终得到突变体质粒m2、m3和m4。
[0055]
测序验证正确后转化bacillus subtilis comk，挑取单菌落接种于5ml含50mg/l的卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h后取1ml菌液接种于50ml含50mg/l的卡那霉素和0.2g/l的cacl2的液体tb培养基中，同样置于37℃，200rpm振荡培养24h后12000rpm离心3min取上清液。
[0056]
纯化方案如下：采用离子交换层析的方法纯化野生型与突变体m2，m3和m4。填料采用带正电的q sefinose琼脂糖，取1ml填料缓慢注入5ml重力柱中，待填料沉降至重力柱底部后打开重力柱出样口，缓慢加入柱平衡缓冲液至流出液ph与柱平衡缓冲液ph一致后开始上样，将上清液样品缓慢注入重力柱中，待下柱液流出后用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，获得纯酶液。纯化后蛋白胶图如图3所示。
[0057]
表4m2突变引物
[0058][0059]
表5m3突变引物
[0060][0061]
实施例4：组合突变体半衰期与比酶活验证
[0062]
(1)半衰期的测定：将纯化后的组合突变体m2、m3、m4与野生型分别取2ml纯酶液，其中1ml置于55℃金属浴，1ml置于65℃金属浴中，每30min取20μl测定总酶活，直至总酶活趋近于零。后将取样时间与对应时间点的总酶活拟合曲线算出半衰期。
[0063]
结果如图1所示，野生型与突变体m2，m3和m4在55℃的半衰期为205.07、4058.08、276.88、4250min，在65℃的半衰期为12.9、157.8、14.0、167.0min。
[0064]
(2)比酶活的测定：总酶活检测方案如下：40μl稀释适宜倍数样品和80μl终浓度为0.4mm的模式底物suc-aapf-pna，另加80μl缓冲液(ph 8.0100mm tris-hcl和0.1mm cacl2)。用酶标仪在405nm下连续监测5min，每隔1min取一次读数。
[0065]
一个酶活单位定义为25℃检测条件下每分钟产生1μmol p-na的酶量。总酶活为每毫升上清液的酶活。比酶活为每毫克纳豆激酶所具有的酶活力。蛋白浓度使用bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。
[0066]
结果如图2所示，野生型与突变体m2，m3和m4的比酶活分别是15.36、19.62、27.20和31.08u/mg。
[0067]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。