利用荧光定量PCR检测人源脐带间充质干细胞制剂中真菌的方法与流程

利用荧光定量pcr检测人源脐带间充质干细胞制剂中真菌的方法
技术领域
1.本技术属于生物医药技术领域，尤其涉及利用荧光定量pcr检测人源脐带间充质干细胞制剂中真菌的方法。


背景技术：

2.在脐带间充质干细胞培养过程中，细菌、真菌以及支原体等污染严重影响细胞生长；制备好的细胞制剂最终需要用于临床研究，无菌应贯穿于细胞制品的生产使用全过程。
3.按照《中华人民共和国药典》2020年版三部通则1101无菌检查法，供试品的无菌检查需要在规定的培养基和适宜的温度下培养14天，在实验过程中需要做好各项实验对照，同时实验要求较为严格，并且在培养过程中需逐日观察并记录培养的平皿或培养基中是否有真菌生长。《中华人民共和国药典》中的检测方法在检测时间上要求的时间较长，待到培养法检测得出结论时，细胞培养过程中也早已能够观察出来，而且脐带间充质干细胞制剂为新鲜细胞产品，有效期一般远短于药典中无菌检查法所需的时长。因此，需要一种快速灵敏的方式来检测人源间充质干细胞制剂中是否存在真菌污染，用于人源间充质干细胞制剂的快速放行。
4.实时荧光定量pcr技术作为一种新兴的检测手段，其在检测过程中具灵敏度高、重复性好、检测时间短等优点，已逐渐被应用到病原菌检测中。《欧洲药典》 2.6.21中指出，“核酸扩增技术”可用于无菌检查的快速检测。由于真菌的28srrna 具有一定的保守性，保守区序列是大部分真菌所共有的；通过设计28srrna的特异性上游引物、下游引物及荧光探针，采用荧光探针法实时荧光定量pcr技术可提高检测的特异性并且能大大缩短检测时间。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供利用荧光定量pcr检测人源脐带间充质干细胞制剂中真菌的方法。本发明采用荧光探针法实时荧光定量pcr技术可提高检测的特异性并且能大大缩短检测时间。
6.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
7.利用荧光定量pcr检测人源脐带间充质干细胞制剂中真菌的方法，具体包括如下步骤：
8.(1)将人源间充质干细胞制品进行离心弃上清后，向沉淀中加入裂解液重悬并转移至裂解管中进行研磨，对真菌进行破碎后，提取纯化获得真菌dna；
9.(2)对样本dna进行荧光定量pcr检测；
10.(3)通过ct值判断样本的结果。
11.优选的，步骤(1)中，dna提取的具体步骤：
12.1)取200μl细胞制品，13300rpm离心10min弃上清后作为样品组；
13.取200μlbufferae，13300rpm离心10min弃上清后作为阴性对照组；
14.2)取500μl裂解液分别加入上述两组中，涡旋混匀，转移至dna裂解管中，最大速度涡旋震荡10min；
15.3)取下dna裂解管，8000rpm离心5s；
16.4)将400μl上清移至一个新的1.5ml离心管中，避免吸到管中的玻璃珠；
17.5)加入24μl蛋白酶k，涡旋10s混匀，瞬时离心后56℃孵育12min，在孵育过程中偶尔涡旋混匀；
18.6)加入200μldna裂解缓冲液，涡旋15s混匀，瞬时离心；
19.7)70℃孵育10min，瞬时离心；
20.8)加入200μl无水乙醇，漩涡15s，瞬时离心；
21.9)将混合物转移至分离柱中，放置在2ml收集管中，以8000rpm离心1min，将收集管丢弃；
22.10)将分离柱放入新的2ml收集管中，加入500μl缓冲液18000rpm离心1min，将收集管丢弃；
23.11)将分离柱放入新的2ml收集管中，加入500μl缓冲液213300rpm离心 3min，将收集管丢弃；
24.12)将分离柱放入新的ml收集管中，13300rpm离心1min；
25.13)将分离柱放入新的1.5mlep管中，加入20μl洗脱液，室温孵育1min，以8000rpm离心1min，洗脱dna；
26.14)将上一步骤中的dna洗脱液重新加入到分离柱中，室温孵育1min，以 8000rpm离心1min。
27.优选的，步骤(2)中，荧光定量pcr检测
28.1)反应液配制；
29.2)按18μl/孔加入反应液，再根据反应组别加入2μl/孔各组样品dna，总体积为20μl/孔；
30.3)循环进行检测。
31.优选的，步骤(2)中的1)，各组分配制反应液的量为：premixextaqtm：10μl；28s-f：0.4μl；28s-r：0.4μl；28s-probe：0.4μl，rox：0.2μl； pcr-gradewater：6.6μl；总体积：18μl。
32.优选的，步骤(2)中的2)，反应组别为
33.1)组别：样品组；加入样品类型：提取的样品dna；
34.2)组别：阴性对照组；加入样品类型：提取的洗脱液dna；
35.3)组别：阳性对照组；加入样品类型：阳性对照品dna；
36.4)组别：空白对照组；加入样品类型：洗脱液。
37.优选的，步骤(2)中的3)，先95℃保温30s；再95℃保温5s，60℃保温 34s的顺序40个循环进行检测。
38.优选的，步骤(3)中，结果判断标准为
39.1)当阳性对照组扩增曲线呈s型，且ct值＜36；阴性对照、空白对照扩增曲线不呈s型或ct值≥36或无ct值，方可判断样品结果；
40.2)当样品扩增曲线呈s型，且ct值＜36，判断结果为阳性；
41.当样品扩增曲线不呈s型或ct值≥36或无ct值，判断结果为阴性。
42.本发明有益效果：
43.实时荧光定量pcr技术作为一种新兴的检测手段，其在检测过程中具灵敏度高、重复性好、检测时间短等优点，已逐渐被应用到病原菌检测中。《欧洲药典》 2.6.21中指出，“核酸扩增技术”可用于无菌检查的快速检测。由于真菌的28srrna 具有一定的保守性，保守区序列是大部分真菌所共有的；通过设计28srrna的特异性上游引物、下游引物及荧光探针，本发明采用荧光探针法实时荧光定量pcr 技术可提高检测的特异性并且能大大缩短检测时间。
具体实施方式
44.下面将结合本技术实施例中，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
45.如背景技术部分介绍，实时荧光定量pcr技术作为一种新兴的检测手段，其在检测过程中具灵敏度高、重复性好、检测时间短等优点，已逐渐被应用到病原菌检测中。《欧洲药典》2.6.21中指出，“核酸扩增技术”可用于无菌检查的快速检测。由于真菌的28srrna具有一定的保守性，保守区序列是大部分真菌所共有的；通过设计28srrna的特异性上游引物、下游引物及荧光探针，采用荧光探针法实时荧光定量pcr技术可提高检测的特异性并且能大大缩短检测时间。
46.基于上述分析，本技术实施例提供利用荧光定量pcr检测人源脐带间充质干细胞制剂中真菌的方法。
47.下面对本技术实施例提供的利用荧光定量pcr检测人源脐带间充质干细胞制剂中真菌的方法进行详细说明。
48.实施例1，利用荧光定量pcr检测人源脐带间充质干细胞制剂中真菌的方法，具体包括如下步骤：
49.1)将人源间充质干细胞制品进行离心弃上清后，向沉淀中加入裂解液重悬并转移至裂解管中进行研磨，对真菌进行破碎后，提取纯化获得真菌dna；
50.2)对样本dna进行荧光定量pcr检测；
51.3)通过ct值判断样本的结果。
52.dna提取的步骤：
53.1)取200μl细胞制品，13300rpm离心10min弃上清后作为样品组；取 200μlbufferae，13300rpm离心10min弃上清后作为阴性对照组；
54.2)取500μl裂解液分别加入上述两组中，涡旋混匀，转移至dna裂解管中，最大速度涡旋震荡10min；
55.3)取下dna裂解管，8000rpm离心5s；
56.4)将400μl上清移至一个新的1.5ml离心管中，避免吸到管中的玻璃珠；
57.5)加入24μl蛋白酶k，涡旋10s混匀，瞬时离心后56℃孵育12min(在孵育过程中偶尔涡旋混匀)；
58.6)加入200μldna裂解缓冲液，涡旋15s混匀，瞬时离心；
59.7)70℃孵育10min，瞬时离心；
60.8)加入200μl无水乙醇，漩涡15s，瞬时离心；
61.9)将混合物转移至分离柱中，放置在2ml收集管中，以8000rpm离心1min，将收集管丢弃；
62.10)将分离柱放入新的2ml收集管中，加入500μl缓冲液1，8000rpm离心 1min，将收集管丢弃；
63.11)将分离柱放入新的2ml收集管中，加入500μl缓冲液2，13300rpm离心 3min，将收集管丢弃；
64.12)将分离柱放入新的ml收集管中，13300rpm离心1min；
65.13)将分离柱放入新的1.5mlep管中，加入20μl洗脱液，室温孵育1min，以8000rpm离心1min，洗脱dna；
66.14)将上一步骤中的dna洗脱液重新加入到分离柱中，室温孵育1min，以 8000rpm离心1min。
67.荧光定量pcr检测的步骤：
68.1)反应液配制：根据样品量按表1配制反应液；
69.表1反应液配制表
[0070][0071]
2)按18μl/孔加入反应液，再根据表2加入2μl/孔各组样品dna，总体积为20μl/孔；
[0072]
表2反应组别
[0073][0074]
3)按95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环进行检测。
[0075]
结果判断标准：
[0076]
1)当阳性对照组扩增曲线呈s型，且ct值＜36；阴性对照、空白对照扩增曲线不呈s型或ct值≥36(或无ct值)，方可判断样品结果。
[0077]
2)当样品扩增曲线呈s型，且ct值＜36，判断结果为阳性；
[0078]
当样品扩增曲线不呈s型或ct值≥36(或无ct值)，判断结果为阴性。
[0079]
以上结合具体实施方式和范例性实例对本技术进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本技术的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本技术精神和范围的情况下，可以对本技术技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本技术的范围内。本技术的保护范围以所附权利要求为准。