金针菇菌种的保藏方法与流程

1.本发明属于菌种保藏技术领域，具体涉及一种金针菇菌种的保藏方法。


背景技术：

2.金针菇的经济实用价值高，而种植金针菇的关键是优良性状的菌种。目前菌种保藏的方法包括：常规低温继代保藏、液氮超低温保藏、冷冻干燥保藏、石蜡封存、寄主保存、土壤保藏法、硅胶保藏法、滤纸条保藏法、蒸馏水保藏法等。
3.例如，专利cn202010315370.x中采用木屑保藏法对金针菇菌种进行保藏，通过对培养基进行优化，减少金针菇菌种在长期保藏过程中发生的退化，从而使金针菇菌种在经过长期保藏后还能保持优良的性状以及产量。
4.专利cn201710882239.x提供了一种金针菇菌丝球的保藏方法，原理是在保藏过程中不对金针菇菌丝球提供营养物质，并且金针菇菌丝球保藏的温度较低，在低温环境中大大地降低或停止了金针菇菌丝球的生长，同时使金针菇菌丝球保持着菌种的生理活性和细胞形态；其采用液体培养基培养，通过温和、有序地对培养基进行摇动，能使金针菇菌种的繁殖更均匀，避免金针菇菌种集中繁殖于某空间，提高了金针菇菌种的繁殖效率和繁殖效果。
5.目前国内金针菇企业对菌种的保存都是用4℃的冰箱，试管斜面保藏，定期传代培养。其存在以下缺点：(1)保存时间短，容易退化；(2)不能长期保持菌种性状，造成生产不稳定；(3)菌种的一致性差；(4)技术员操作试管传代的工作量大；(5)频繁外购或选育菌种成本太高。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是：提供一种金针菇菌种的保藏方法，保存的菌种可以直接用于三角瓶液体菌种的接种，稳定性好、均匀性高、操作简单，且菌种性状一致，保存期限长达5到10年。
7.本发明所述的金针菇菌种的保藏方法，包括以下步骤：
8.(1)菌种制备：在平板菌种打孔，刮掉平板表面的气生菌丝，将菌块放入液体培养基内进行培养，得到金针菇菌丝球；
9.(2)冻存管的菌种的制备：将金针菇菌丝球密封在有保护剂的冻存管内，再将冻存管进行预冻，最后置于液氮罐中保藏。
10.步骤(1)中，每1l液体培养基中含有：白砂糖1.8-2.0％，豆粉0.30-0.35％，蛋白胨0.15-0.20％，玉米面0.28-0.30％，酵母浸粉0.18-0.20％，磷酸二氢钾0.06-0.10％，硫酸0.06-0.10％，余量为水。
11.优选地，液体培养基中还可以加入适量消泡剂，以消除液体培养基的泡沫。
12.步骤(1)中，培养温度为19-22℃，培养时间为6-9天。
13.步骤(2)中，冻存管为市售耐高温冻存管，一般由管帽、管体构成，分为内旋盖和外
旋盖冻存管，其中内旋冻存管带硅胶垫。
14.优选地，冻存管的体积为2-10ml。在使用前，冻存管需要121℃高温灭菌后使用。
15.步骤(2)中，保护剂为甘油或二甲基亚砜的水溶液，甘油或二甲基亚砜的含量为10-15wt％。
16.优选地，保护剂和金针菇菌丝球的质量比为1-1.2:1。
17.步骤(2)中，冻存管预冻时，冷冻速度控制在以每分钟下降1-1.5℃，使样品冻结到-35℃，等待1-2h，再置于液氮罐中快速冷冻。
18.步骤(2)中，液氮罐的保藏温度为-150～-196℃。
19.当需要恢复培养保藏的菌种时，将冻存管从液氮罐中取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止，再打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
21.(1)通过本发明方法保藏的冻存管菌种可以直接用于三角瓶液体菌种的接种，稳定性好、均匀性高、操作简单；
22.(2)本发明的保藏方法同一批次的冻存管一致性高，性状稳定，变异少，不易退化可以长期保存5到10年，保证菌种用种安全。
附图说明
23.图1为本发明金针菇菌种的保藏装置图；
24.图中：1、液氮罐；2、冻存管。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限定本发明。
26.实施例1
27.采用本发明的保藏方法对金针菇菌种进行保藏，方法如下：
28.(1)配制液体培养基：每1l液体培养基中含有：白砂糖1.8％，豆粉0.35％，蛋白胨0.20％，玉米面0.28％，酵母浸粉0.18％，磷酸二氢钾0.08％，硫酸0.08％，余量为水；按上述原料配方混合均匀，高温灭菌，冷却后备用；
29.(2)菌种制备：挑选好的平板菌种，用打孔器均匀打孔，挑选最佳的点，用接种刀刮掉平板表面的气生菌丝，将菌块放入液体培养基内进行培养，培养温度为20℃，培养时间为7天，得到金针菇菌丝球；
30.(3)冻存管的菌种的制备：挑取大小均匀的金针菇菌丝球，经无菌操作将金针菇菌丝球密封在有保护剂的冻存管内，冻存管的规格为10ml，经121℃高温灭菌后使用，用体积比10％甘油水溶液作保护剂，保护剂与金针菇菌丝球的质量比为1:1；然后将冻存管以每分钟下降1℃的速率进行预冻，使样品冻结到-35℃，等待1h，再置于-150℃～-196℃的液氮罐中快速冷冻，随时取用接三角瓶液体菌种或者长期存放。
31.(4)当需要恢复培养保藏的菌种时，将冻存管从液氮罐中取出，立即放入40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止，再打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
32.实施例2
33.采用本发明的保藏方法对金针菇菌种进行保藏，方法如下：
34.(1)配制液体培养基：每1l液体培养基中含有：白砂糖2.0％，豆粉0.30％，蛋白胨0.15％，玉米面0.30％，酵母浸粉0.20％，磷酸二氢钾0.06％，硫酸0.06％，余量为水；按上述原料配方混合均匀，高温灭菌，冷却后备用；
35.(2)菌种制备：挑选好的平板菌种，用打孔器均匀打孔，挑选最佳的点，用接种刀刮掉平板表面的气生菌丝，将菌块放入液体培养基内进行培养，培养温度为19℃，培养时间为9天，得到金针菇菌丝球；
36.(3)冻存管的菌种的制备：挑取大小均匀的金针菇菌丝球，经无菌操作将金针菇菌丝球密封在有保护剂的冻存管内，冻存管的规格为2ml，经121℃高温灭菌后使用，用体积比15％甘油水溶液作保护剂，保护剂与金针菇菌丝球的质量比为1.2:1；然后将冻存管以每分钟下降1.5℃的速率进行预冻，使样品冻结到-35℃，等待2h，再置于-150℃～-196℃的液氮罐中快速冷冻，随时取用接三角瓶液体菌种或者长期存放。
37.(4)当需要恢复培养保藏的菌种时，将冻存管从液氮罐中取出，立即放入38℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止，再打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
38.实施例3
39.采用本发明的保藏方法对金针菇菌种进行保藏，方法如下：
40.(1)配制液体培养基：每1l液体培养基中含有：白砂糖1.9％，豆粉0.32％，蛋白胨0.17％，玉米面0.28％，酵母浸粉0.20％，磷酸二氢钾0.10％，硫酸0.06-0.10％，余量为水；按上述原料配方混合均匀，高温灭菌，冷却后备用；
41.(2)菌种制备：挑选好的平板菌种，用打孔器均匀打孔，挑选最佳的点，用接种刀刮掉平板表面的气生菌丝，将菌块放入液体培养基内进行培养，培养温度为22℃，培养时间为6天，得到金针菇菌丝球；
42.(3)冻存管的菌种的制备：挑取大小均匀的金针菇菌丝球，经无菌操作将金针菇菌丝球密封在有保护剂的冻存管内，冻存管的规格为5ml，经121℃高温灭菌后使用，用体积比10％二甲基亚砜水溶液作保护剂，保护剂与金针菇菌丝球的质量比为1:1；然后将冻存管以每分钟下降1℃的速率进行预冻，使样品冻结到-35℃，等待1h，再置于-150℃～-196℃的液氮罐中快速冷冻，随时取用接三角瓶液体菌种或者长期存放。
43.(4)当需要恢复培养保藏的菌种时，将冻存管从液氮罐中取出，立即放入40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止，再打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
44.对比例1
45.采用常规4℃斜面保藏对金针菇菌种进行保藏，方法如下：
46.(1)配制液体培养基：每1l液体培养基中含有：白砂糖1.9％，豆粉0.32％，蛋白胨0.17％，玉米面0.28％，酵母浸粉0.20％，磷酸二氢钾0.10％，硫酸0.06-0.10％，余量为水；按上述原料配方混合均匀，高温灭菌，冷却后备用；
47.(2)菌种制备：挑选好的平板菌种，用打孔器均匀打孔，挑选最佳的点，用接种刀刮掉平板表面的气生菌丝，将菌块接种到装有上述液体培养基的培养容器中，用石蜡峰口，将
容器在22℃在进行斜面培养，直至培养容器内的金针菇菌种保藏培养基表面长满菌丝；
48.(3)4℃斜面保藏：将培养容器置于4℃温度下进行保藏。
49.对比例2
50.采用常规4℃蒸馏水保的保藏方法对金针菇菌种进行保藏，方法如下：
51.(1)配制液体培养基：每1l液体培养基中含有：白砂糖1.9％，豆粉0.32％，蛋白胨0.17％，玉米面0.28％，酵母浸粉0.20％，磷酸二氢钾0.10％，硫酸0.06-0.10％，余量为水；按上述原料配方混合均匀，高温灭菌，冷却后备用；
52.(2)菌种制备：挑选好的平板菌种，用打孔器均匀打孔，挑选最佳的点，用接种刀刮掉平板表面的气生菌丝，将菌块放入液体培养基内进行培养，培养温度为22℃，培养时间为6天，得到金针菇菌丝球；
53.(3)4℃蒸馏水保：挑取大小均匀的金针菇菌丝球，经无菌操作将金针菇菌丝球接种在有生理盐水的试管(经121℃高温灭菌后使用)内，然后将试管在4℃温度下保藏。
54.将实施例1-3和对比例1-2保藏的金针菇菌种进行液体栽培出菇实验，结果如表1所示。
55.表1液体栽培出菇实验结果
[0056][0057][0058]
从表1可以看出，本发明的金针菇菌种保藏方法保藏的菌丝含量和单产比4℃斜面保藏和4℃蒸馏水保的保存效果要好。