酸性果胶酶分子改造及应用的制作方法

1.本发明属于微生物改造技术领域，具体内容涉及一株高产酸性果胶酶的黑曲霉突变菌株及其应用。
技术背景
2.果胶是一种由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部可与钙、钾、钠离子，特别是与硼化物结合在一起。果胶存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，从而表现出固有的形态。
3.果胶酶(pectinase)是指能够分解果胶物质的多种酶的总称，大致可分为果胶水解酶(pectin hydrolases)、果胶裂解酶(pentinlyases)、果胶酯酶(pectin esterases) 和原果胶酶等。按照作用最适ph的不同，果胶酶又可分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。
4.目前研究和应用较多的是酸性果胶酶，酸性果胶酶指内聚半乳糖醛酸酶，可无规则的水解果胶酸分子中的α-1,4糖苷键，其作用最适ph在偏酸性范围，主要应用于食品行业的水果榨汁和果汁澄清，降低葡萄酒粘度，并可以与其它水解酶共同应用于饲料行业。其主要来源于动植物及微生物，尤其是微生物，因为它的生长速度快、生长条件简单、代谢过程特殊等特征，成为果胶酶的重要来源，其中真菌来源的果胶酶大部分在酸性ph值下具有高活性。大多数商业化生产的果胶酶也是来源于真菌，尤其是来源于黑曲霉和青霉。一些果胶酶基因已被克隆，测序并进行了表达。
5.目前采用天然菌株生产的果胶酶存在一些局限性，主要包括产酶性能较低、果胶酶的耐温性能较差以及作用ph范围较小等。因此，随着果胶酶应用越来越广泛，迫切需要对果胶酶生产菌种进行相应的改良，以提高果胶酶的产量。


技术实现要素：

6.本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产酸性果胶酶的黑曲霉（aspergillus niger）菌株及其应用。申请人以筛选得到的野生菌株aspergillus niger knpl为出发菌株，通过基因敲除与重组的方法，筛选获得一株突变菌株，能大幅度提高酸性果胶酶的产量，有利于促进该酶的广泛应用。
7.本发明一方面提供了一种突变株aspergillus niger knpl-gco4。
8.本发明一方面提供了所述黑曲霉在生产酸性果胶酶中的应用。
9.本发明还提供了一种生产酸性果胶酶的方法，是以所述黑曲霉为发酵菌株。
10.本发明还提供了一种酸性果胶酶，是由所述黑曲霉发酵获得的。
11.本发明以黑曲霉（aspergillus niger）knpl为出发菌株，通过敲除ligd和pela两个基因，过表达三个新型pgaa基因，再通过紫外诱变和高通量筛选得到knpl-gco4。所述突变菌株经20l发酵优化后，发酵7d后，其酸性果胶酶酶活达到5万 u/ml，较出发菌提高40%。
本发明提供的黑曲霉突变菌株可广泛应用于酸性果胶酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进酸性果胶酶的推广与应用。
具体实施方式
12.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning: a laboratory manual, 3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
13.下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
14.实施例1 黑曲霉knpl固体摇瓶发酵及酶活检测黑曲霉（aspergillus niger）knpl为自行筛选野生菌株。该菌株能发酵生产酸性果胶酶。
15.申请人首先将黑曲霉knpl接种到新鲜的pda平板（马铃薯200g/l，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；琼脂粉1.5%），30℃培养5d。
16.吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，接种50ml液体csl-果糖种子培养基（麦芽糖10%；果糖5%；葡萄糖1%；玉米浆10%；硫酸镁0.05%；磷酸二氢钠0.1%；ph 5.8），30℃培养2d。培养2d后，吸取2ml菌丝体接种5g固体摇瓶培养基，30℃培养3.5d，每天翻曲。培养结束后加40ml无菌水，搅拌2h洗脱，离心获得上清液即为粗酶液。将粗酶液进行酸性果胶酶酶活力测定，结果显示，所述粗酶液中酸性果胶酶酶活达到635u/g，从而说明黑曲霉knpl确实能够高产酸性果胶酶。
17.1、酸性果胶酶酶活力检测（1）酸性果胶酶酶活单位的定义在50℃，ph为3.5条件下，反应1h，1g酶粉或1ml酶液分解果胶产生1mg半乳糖醛酸定义为一个活力单位（iu）。
18.（2）酶活测定方法（2.1） 试剂和溶液：1%果胶粉水溶液：秤取果胶粉（sigma p9135）1g，加水溶解，煮沸冷却，如有不溶物则需进行过滤，调ph 3.5，用水定容至100ml，在冰箱中储存备用，使用时间不超过3d；碳酸钠溶液1mol/l：秤取无水碳酸钠106g，加水溶解，定容至1l；碘标准溶液：0.1mol/l；硫酸溶液2mol/l：取浓硫酸5.6ml，缓慢加入适量水中，冷却后用水定容至100ml；可溶性淀粉指示液：10g/l；0.1mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（ph 3.5）：秤取柠檬酸（c6h8o7·
h2o）14.7098g和柠檬酸三钠（c6h5na3o7·
2h2o）8.823g，用水溶解并定容至1l；0.05mol/l硫代硫酸钠溶液：将定量分析用的0.1mol/l硫代硫酸钠母液500ml用煮沸过的冷却水稀释，所得溶液的总体积为1000ml。配制好后，应进行标定，求出浓度校正系数f值；
（2.2）样品溶液的制备：准确吸取酶液1ml于一定体积的容量瓶中，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释并定容。酶液需要稀释至一定倍数，酶液浓度应控制在消耗0.05mol/l硫代硫酸钠标准溶液（a-b）之差在0.5~0.7ml范围内。
19.（2.3）酶活力测定：在空白管中，分别加入10g/l果胶溶液5ml和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液5ml，在样品管中加入10g/l果胶溶液5ml和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液4ml，在50℃水浴中预热5~10min。
20.向样品管中加入1ml稀释好的酶液，立刻摇匀计时，在此温度下准确反应0.5h，立即取出，煮沸5min，终止反应，冷却。
21.取上述空白管和样品管反应液各5ml，放入碘量瓶中，准确加入1mol/l碳酸钠溶液1ml、0.1mol/l碘液5ml，摇匀，于暗处放置20min。
22.取出，加入2mol/l硫酸溶液2ml，用0.05mol/l硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示液3滴，继续滴定至蓝色刚好消失为终点，记录空白管、样品管反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积。
23.酶活计算公式：x＝(a-b)
×c×
0.51
×
194.14
×n×
10/(5
×1×
0.5)=(a-b)
×c×n×
396.05式中：x ――样品的酶活力，u/ml；a ――空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml；b――样品溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml；c――硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/l；0.51――1mol硫代硫酸钠相当于0.51mol的游离半乳糖醛酸；194.14――半乳糖醛酸的毫摩尔质量，mg；n――酶液稀释倍数；10――反应液总体积，ml；5――滴定时取反应液的体积，ml；1――反应时加入稀释酶液的体积，ml；0.5 ―― 反应时间，h；酶活（u/g）y=8x，8为5g固体料加40ml水洗脱的折算倍数。
24.实施例2 分子改造及诱变筛选申请人以黑曲霉（aspergillus niger）knpl为出发菌株，进一步通过分子改造的方法筛选酸性果胶酶产量提高的突变菌株。
25.分子改造：分别以ligd基因的5’端和3’端序列为同源臂构建其打靶元件a和b，其中元件a只含有筛选标签ptra 的前2/3 段，元件b则含有ptra的后2/3 段，两者含有一段相同序列（ptra 的中间部分）。通过peg介导或电击的方式将元件a与b同时导入至原生质体中，通过吡啶硫胺素进行抗性筛选。只有当元件a和b同时整合在各自特定的ligd位点上，并且两元件之间同时也发生同源重组时的转化子才具有抗性，再通过cre/loxp重组系统，获得重组菌株。
26.确定致死率：将上述黑曲霉菌株knpl接种于pda平板，30℃培养5d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计
数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度约为1
×
107个/ml），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、60s、90s、120s、150s、180s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布pda平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射150s时，致死率为98%，选取该照射时间进行后续诱变实验。
27.诱变筛选：取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1
×
107），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射150s后稀释1000倍，取100ul涂布pda平板，30℃培养2-3d。
28.共涂布100块pda平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出10-20个菌落，先通过观察菌落形态，筛选出菌落形态发生显著变化的突变菌共 51个，分别接种到pda平板，30℃培养5d；每个突变菌菌落用5ml无菌水进行洗脱，获得孢子液；分别接种至50ml液体csl-果糖种子培养基，30℃培养2d；然后分别吸取2ml菌丝体接种至5g固体摇瓶培养基（麸皮2g；木质纤维素2g；阿拉伯树胶粉1g），30℃培养3.5d，每天翻曲；培养结束后加40ml无菌水，搅拌2h洗脱，离心获得上清液即为粗酶液。
29.通过对上述获得的粗酶液进行酸性果胶酶酶活力检测，申请人最终筛选出一株酸性果胶酶产量最高的突变菌株，命名为黑曲霉knpl-gco4（aspergillus niger knpl-gco4），该菌株发酵获得的粗酶液中酸性果胶酶的酶活达到5万 u/ml，较出发菌提高40%，取得了意料不到的技术效果。