外周血白细胞miR-150-5p在计算辐射剂量中的应用的制作方法

外周血白细胞mir-150-5p在计算辐射剂量中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及外周血白细胞mir-150-5p在计算辐射剂量中的应用。


背景技术：

2.在核动力舰艇发生核反应堆事故以及核武器爆炸的情况下，人员受到不同剂量的电离辐射照射后会发生不同程度的急性放射病，急性放射病的严重程度及其分型分度与受照剂量密切相关。因此，快速、准确的评估人员的受照剂量对于科学判断急性放射病的严重程度，以及在临床上对急性放射病进行分度、分期治疗具有重要的指导意义。
3.目前电离辐射外照射剂量估算方法有三种：物理、生物和临床，但是由于物理剂量计只能反映局部受照剂量，加之受照人员对射线的反应存在个体差异；临床诊断又难以对伤员做出快速诊断，所以通过生物学指标来估算受照剂量仍然具有不可替代性。利用生物指标分析来评估受照人员生物剂量成为目前放射生物学和辐射防护研究中最受关注的领域。
4.虽然经研究证实具有辐射剂量相关性的生物学指标很多，但实际应用的仍然较少，应用较多的仍然是细胞水平的生物剂量计。染色体畸变分析一直是辐射生物剂量估算的金标准，但其对分析者的个人技术和经验要求较高。而通过单一基因的表达或者突变评估辐射剂量具有很大的随机性，易受吸烟等环境因素的影响，个体差异也较大。亟需寻找新型的、可以科学、快速评估辐射剂量的新方法。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供外周血白细胞mir-150-5p在计算辐射剂量中的应用，用于解决现有技术中辐射剂量难以确定、现有操作繁琐的问题。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明的另一方面提供了一种计算生物体遭受辐射剂量的方法，所述方法为通过检测生物体在遭受辐射36h-52h后的外周血白细胞中mir-150-5p表达量，代入剂量-效应函数关系：
7.d＝-2.864*lg(x
mir-150-5p
)-0.0009797 r2＝0.9026
8.其中，d为照射剂量，x为mirna相对表达量，即可计算获得辐射剂量。
9.检测生物体外周血白细胞中mirna表达量的方法，可以采用现有中已知的各种检测方法，例如，可以采用二代测序检测方法，也可以是其他现有已知的检测方法。
10.优选地，所述方法中获取外周血的时间为生物体遭受辐射48h后。
11.本发明的另一方面提供了用于计算生物体遭受辐射剂量的产品，所述产品包括以下计算模块：d＝-2.864*lg(x
mir-150-5p
)-0.0009797 r2＝0.9026
12.其中，d为照射剂量，x为mirna相对表达量。
13.所述产品可以为微型计算器，微型计算器中嵌入了以上函数关系式，因此只要使用者输入各个mirna相对表达量，即可立即计算出辐射剂量。
14.优选地，所述产品中还包括用于检测外周血mirna的检测试剂。
15.优选地，所述检测试剂包括不限于：二代测序检测试剂。
16.本发明的另一方面提供给了一种计算机储存介质，所述计算机储存介质中含有如上所述的计算模块。
17.如上所述，本发明的基于一组外周血白细胞中mirna的辐射生物剂量估算方法，具有以下有益效果：
18.本方法方便快捷，操作方便，可以快速的估算出生物体遭受的辐射剂量。
附图说明
19.图1显示为实施例1中mirna相对表达量和计算获得的对应的照射剂量之间的剂量效应曲线
具体实施方式
20.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
21.本技术方案的构建过程的简要说明：
22.1)选取c57bl/6小鼠分成5组(0、2、4、6、8gy)分别接受γ射线全身照射，分别于照后24小时和照后48小时采集小鼠外周血，采用二代测序检测白细胞中mirna表达谱的变化，筛选出表达水平稳定且变化显著的mirna。
23.我们所筛选mirna的应该符合以下标准：a、辐射敏感性高，即照射前后表达量上调或者下调变化要尽量大；b、表达量与照射剂量之间依赖关系稳定，即mirna表达是明确受照射剂量依赖；c.mirna既存在于小鼠也存在于人体中。
24.另外，虽然每个小鼠的mirna基础表达水平不可能完全一致，但是这个差异相对于其变化量而言是比较小的，因此不会影响对结果的判断。
25.通过实验发现mir-150-5p的表达量在照射前后变化十分显著，具有极高的灵敏度。
26.2)将mir-150-5p表达量相对于未照射组上调或者下调的倍数结合已知相对应的照射剂量，建立照射剂量与mir-150-5p对应表达量上调或者下调的倍数的剂量-效应函数关系。
27.具体应用时通过检测未知照射剂量小鼠外周血白细胞中mir-150-5p表达量上调或者下调的倍数，带入前面建立的剂量-效应函数，即可估算出受照剂量。
28.发明人通过实验最终确定选择照后48h外周血白细胞中一条mirna(mir-150-5p)，根据其表达量变化倍数与受照剂量建立剂量-效应函数关系：
29.d＝-2.864*lg(x
mir-150-5p
)-0.0009797 r2＝0.9026
30.其中，d为照射剂量，x为mirna相对表达量。
31.以下通过具体的实施例来说本技术技术方案的具体应用。
32.实施例1外周血白细胞中mirna的辐射生物剂量估算方法的验证
33.1、血样采集：取1ml已知照射剂量的小鼠外周血于抗凝管中震荡抗凝，低温离心机4℃，3000rpm离心10分钟，取上清血浆200ul；另将细胞沉淀中加入3ml红细胞裂解液，吹匀静置10分钟(中间颠倒震荡两次)，然后低温离心机4℃，3000rpm离心10分钟，沉淀中加1ml的无菌pbs吹匀洗涤，然后低温离心机4℃，3000rpm离心10分钟得白细胞沉淀，用pbs重悬到体积200ul。
34.2、rna抽提：采用magabio plus总rna纯化试剂盒bsc53s1e及其配套的npa-32p核酸纯化仪进行样本中总rna的抽提。bsc53s1e试剂盒的96孔板室温条件下颠倒3次，去除塑封膜后手甩几次，避免挂液。然后撕掉96孔板的铝箔膜并确认板子方向。将白细胞中加入200ul的ml buffer震荡混匀，静置10分钟后转入96孔板，将96孔板放入npa-32p核酸纯化仪，装上磁棒护套，启动自动化程序提取rna。
35.3、rna浓度测定：抽提的总rna采用nano drop核酸定量仪进行浓度测定。启动rna定量程序后，rnase-free水清洗仪器上下针尖底座，实验吸水纸吸干。吸取2.5ulrnase-free水上样检测本底，然后吸取2.5ul的rna样本进行检测，记录样本浓度。
36.4、mirna反转录：一个polya加尾反应合成的cdna可以用于同时检测多种mirna，在冰浴的0.2ml rnase-free离心管中加入如下反应混合物：(不同试剂盒略有不同)
37.试剂体积(ul)2
×
mrq buffer5mirna sample(0.25-0.8ug)mrq enzyme1.25rnase-free h2o补足10ul总体积10ul
38.离心管轻轻混匀后离心3-5秒钟后，置于37℃温浴15分钟，然后85℃加热5秒钟使酶失活，然后4℃保存。加90ul dd h2o定容到100ul。即可用于后续定量pcr检测。
39.5、mirna定量检测：在冰浴上按下列组份配置pcr反应混合物：
40.试剂体积(ul)dd h2o92
×
tb green advantage premix12.550
×
rox dye0.5mirna-specific primer(10um)0.5mrq 3’primer(10um)0.5cdna2总体积25ul
41.根据所使用的定量pcr仪器设定相应的参数
42.1、预变性(1次循环)95℃
ꢀꢀ
30秒
43.2、pcr反应(40次循环)
44.95℃
ꢀꢀ
5秒
45.60℃
ꢀꢀ
34秒
46.3、溶解曲线(1次循环)
47.95℃
ꢀꢀ
15秒
48.60℃
ꢀꢀ
60秒
49.95℃
ꢀꢀ
1秒
50.记录ct值(cycle threshold),并通过如下公式得到相对表达量：
51.相对表达量＝2
—[ct(目的检测—管家检测)—ct(目的对照—管家对照)]
[0052]
6、剂量估算值的计算：每个样本设3个复孔进行检测，最后以各个剂量点的相对表达量除以0gy的相对表达量作为该条mirna的上调或者下调倍数，将拟合曲线里的各条mirna上下调倍数代入方程，即可得出受照剂量的估算值，具体实验结果如表1和2和图1，分析结果如表2。
[0053]
表1
[0054][0055]
表2
[0056][0057]
均方误差越小估算准确度越高，均方误差越大则估算准确度越低。通过表2可知本技术构建的剂量-效应函数关系，与现有方法相比，本方法操作更加的简便、快速，结果更加的客观。
[0058]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。