miR-29a-3p在制备毒性弥漫性甲状腺肿诊断产品中的应用的制作方法

mir-29a-3p在制备毒性弥漫性甲状腺肿诊断产品中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及mir-29a-3p在制备毒性弥漫性甲状腺肿诊断产品中的应用。


背景技术：

2.graves病(graves’disease，gd)，又称毒性弥漫性甲状腺肿，是一种临床上常见的器官特异性自身免疫病，是危害我国公众健康的重大疾病之一。gd是所有甲状腺功能亢进症中发病率最高的一种，约占85％。该病以患者体内出现促甲状腺素受体抗体(thyrotropin receptor antibody,trab)刺激甲状腺细胞上的促甲状腺激素(thyroid-stimμlating hormone,tsh)受体，引起甲状腺激素生成和释放过多为主要特征。普通人群发病率约0.5％，女性显著高发(4～6:1)。gd可发生于各个年龄阶段，20～50岁尤为高发。其临床表现主要分为：(1)弥漫性甲状腺肿；(2)甲状腺毒症；(3)眼征；(4)胫前粘液性水肿。本病发病机制复杂，涉及免疫、遗传、环境、饮食、精神、性别、年龄等众多因素，目前较为一致的观点认为在遗传易感因素及环境因素共同作用下，机体免疫功能发生紊乱(尤其是体液免疫)是导致发病的主要原因，但具体发病机制尚未完全阐明。随着生存环境和生活水平改变，gd患病率呈现上升趋势，严重影响了患者生存质量，给社会造成了沉重的医疗经济负担。因此，阐明cd的具体发病机制，找到能够用于gd临床诊断标志物和治疗的新靶点，对我国gd临床防治研究具有重要意义。
3.目前用于gd临床诊断的重要检查方法主要为临床表现和实验室检查。许多患者早期临床症状不明显，明确诊断时已经出现严重的临床症状及并发症，如弥漫性甲状腺肿、浸润性突眼及高代谢症群等情况，且临床上目前仍缺乏与疾病活动性明显相关的特异性指标，使得gd临床诊断面临许多困难。由于缺乏特异性诊断标志物，部分gd常常难以与单纯甲状腺肿大、桥本甲状腺炎及亚急性甲状腺炎甲亢期等疾病相鉴别，老年患者甲亢常不典型，有消瘦、厌食、表现淡漠、心律失常等，易误诊为心脏病、恶心肿瘤等，其治疗亦面临巨大挑战。因此，寻找gd的诊断标志物对临床上的诊疗过程来说是极其重要的，且对于gd的靶向治疗也具有积极意义。
4.microrna(mirna)是一类内源性、非编码的小rna。目前自然界206个物种中已发现近30424种成熟的mirnas，其中包括2560种人类mirnas和1887种鼠类mirnas。mirna合成首先是在rna聚合酶ⅱ作用下形成最原始的初级mirna即pri-mirna，长度大约为300～1000个碱基；随后在细胞核内经核糖核酸酶ⅲdrisha及其伴侣分子dgcr8剪切作用下形成带有茎环结构的pre-mirna即microrna前体，长度大约为70～90个碱基；最后在exprotein-5协助下转运至胞浆。pre-mirna再经过核糖核酸酶ⅲdicer及其伴侣分trbp(trans-activator rnabinding protein)酶切后，成为长约20～24nt的双链mirna；其中一条链与rna诱导的沉默复合物(rna-induced silencing complex，risc)结合成为成熟mirna，另一条链则被降解。成熟mirna一旦与risc形成复合物将同其靶基因mrna非编码区结合继而介导基因的表达。mirna核心区的2-8个碱基对于目的基因识别至关重要，其核心区和靶基因3’非编码区
的互补程度决定了mirna介导基因的调节方式。当前mirna-risc对靶基因的调节方式有三种：一是与靶基因完全互补结合，切割mrna；二是与靶基因不完全互补结合，进阻遏翻译但不影响mrna的稳定性；三是同时具有以上两种作用模式
‑‑‑‑
当与靶基因完全互补结合时，直接靶向切割mrna；当与靶基因不完全结合时，则起调节基因表达的作用。目前研究已发现多种mirnas在gd患者中表达异常，这些mirnas表达水平的改变与gd炎症反应密切相关，表明mirnas在gd诊断与治疗新型方法的开发应用上具有广阔的前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供mir-29a-3p在制备毒性弥漫性甲状腺肿诊断产品中的应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：
7.mir-29a-3p在制备毒性弥漫性甲状腺肿诊断产品中的应用，所述mir-29a-3p的序列为5
’‑
uagcaccaucugaaaucgguua-3’(seq id no.1)。
8.检测mir-29a-3p表达水平的试剂在制备毒性弥漫性甲状腺肿诊断试剂盒中的应用。
9.进一步地，所述试剂盒包括特异性扩增mir-29a-3p的引物对。
10.有益效果：本发明的mir-29a-3p在graves病患者外周血单个核细胞和健康对照组中存在表达差异，因此可以用作graves病诊断的标志物。本发明提供的用于检测graves病的诊断试剂盒，可用于graves病的诊断，为预防和/或治疗该疾病提供依据。由于微小rna具有结构稳定、丰度高和组织特异性表达等特征，mir-29a-3p不仅能够用来快速有效地对graves病进行诊断，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
11.图1为graves病组合健康对照组外周血单个核细胞中mir-29a-3p(a)和u6(b)的溶解曲线。
12.图2为mir-29a-3p在graves病和健康对照者外周血单个核细胞中的相对表达量。
13.图3为mir-29a-3p的roc曲线分析。
具体实施方式
14.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
15.在本发明中，mir-29a-3p特异的bulge-loop
tm mirnaqrt-pcr引物组(每组一个rt引物和一对qpcr引物)由广州锐博生物技术有限公司设计并提供。
16.实施例1
17.1、材料和试剂
[0018][0019]
2、主要溶液配制
[0020]
pbs缓冲液：氯化钠8.0g/l，氯化钾0.2g/l，磷酸氢二钠1.42g/l，磷酸二氢钾0.24g/l，调节ph值在7.2-7.4之间。
[0021]
3、实验方法
[0022]
3.1分离人外周血单个核细胞
[0023]
(1)将移液枪、大中小号枪头、ficoll-hypaque分离液、磷酸盐缓冲液(pbs)、玻璃离心管、1.5mlep管、试管架等放于层流超净工作台，紫外线照射30分钟。
[0024]
(2)使用一次性抗凝采血管分别采集graves病和健康志愿者外周血，每管约2ml，25℃、500g离心10分钟，收集上层血浆至干净的1.5ml ep管中，放于-80℃低温冰箱备用，剩余血细胞用pbs稀释至2ml混匀。
[0025]
(3)离心管标记序号，每个离心管中加入2ml ficoll-hypaque分离液，注意移液枪枪头勿接触管壁，将混匀的抗凝血缓慢沿管壁加入分离液(加入过快容易使抗凝血冲入分离液中，影响最终分离效果)，调整离心机速度为2000r，升降速为0，离心15分钟。
[0026]
(4)离心结束后液面从上至下分4层，第1层为稀释后的血浆，第2层为单个核细胞层，第3层为ficoll-hypaque分离液层，第4层为红细胞层。取干净离心管标记序号，每管加入8-10mlpbs溶液，用移液枪吸取分层后的单个核细胞，至pbs溶液中，500g，离心10分钟。
[0027]
(5)离心结束后倒掉上清液，将下层沉淀弹匀，加入1ml pbs重悬细胞，移至1.5ml ep管中再次离心，弃去上清液，剩余细胞沉淀即为pbmcs，得到的pbmcs可立即用于后续实验，或放至-80℃冰箱保存备用。
[0028]
3.2外周血单个核细胞中总rna的抽提
[0029]
(1)样本裂解：向提取的pbmcs中加入500μl lysis buffer裂解液，用移液枪吹打混匀。
[0030]
(2)上柱/rna结合：向裂解的细胞中加入500μl acs级无水乙醇，用移液枪用力涡旋10秒钟，将混合液加入rna滤柱中，12000g，离心30秒-1分钟(离心结束后取下柱子，倒掉下方收集管中的废液，将柱子重新装回收集管，注意滤柱不要接触到废液)。
[0031]
(3)rna柱清洗：向虑柱内加入500μl wash buffer清洗液，12000g，离心30秒-1分钟，离心后倒掉废液，再次空管离心，可将残留的wash buffer尽可能完全去除，取下柱子，放至干净的1.5mlep管中，开盖晾2分钟。
[0032]
(4)rna洗脱：向rna柱膜中心部位加入20-30μl的elution buffer，静置2分钟，12000g，离心30秒-1分钟，离心结束后将洗脱的rna重新加入柱子中，再次离心，以提高rna
洗脱效率。洗脱后的rna测定浓度后使用，也可放至-80℃冰箱保存备用。
[0033]
3.3rna质控
[0034]
(1)检测rna浓度和纯度：rna浓度测定由nd-1000仪器完成，纯度指标由od260/od280界定，合格的rna纯度od260/od280值范围在1.8-2.1之间。若od260/od280＜1.8提示样品中有较高的蛋白质及苯酚，若od260/od280＞2.1提示有异硫氰酸残存。rna浓度单位ng/μl，通常rt-qpcr需要rna质量500-1000ng，一般选择500ng，根据样本质量、浓度计算rna加入体积，因反应体系中rna体积与水的体积总和6.5μl，故rna浓度至少要大于76.9ng/μl，rna体积不宜超过6.5μl。注意检测rna浓度时保持冰上操作，尽量避免rna过快降解。样品本身降解，或者rna的体积过少(＜1μl)，不能在凝胶上显示，视为rna质量较差。
[0035]
(2)rna完整性质控：使用变性琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性和有无gdna污染。若28s、18s及5s条带均完整，提示rna完整性尚可。28s和18s rrna条带是尖锐、强度高的条带，并且28s条带的强度应该是18s条带强度的两倍。5s条带是低分子条带，强度较弱，呈弥散状，trna可能和5s rrna同时存在。28s条带和18s条带之间出现弥散条带提示可能是mrna和其他异质性rna，属于正常现象。若高分子量弥散或条带迁移到28s上，提示可能有dna污染。若rrna带呈弥散状提示rna降解。
[0036]
3.4qrt-pcr检测差异表达的mir-29a-3p
[0037]
(1)配制逆转录体系，逆转录体系直接使用锐博生物提供的mirna逆转录试剂盒，具体组成如表1，体系总体积为10μl(注意保持冰上操作)。逆转录体系配置完毕后，旋涡振荡器混匀，2000转离心1后放于逆转录仪器中，设置反应条件：40℃，60分钟(逆转录反应)；70℃，10分钟(逆转录酶失活反应)；4℃，维持。逆转录结束后收集产物迅速置于冰上进行后续操作，或保存于冰箱备用(短期4℃保存，长期-20℃保存)。
[0038]
表1逆转录体系
[0039][0040]
(2)使用u6作为内参，其引物由广州锐博生物技术有限公司提供。
[0041]
(3)梯度pcr验证引物质量：冰上配制梯度pcr反应体系，试剂配比见表2。梯度退火温度分别为：58.7℃，60.0℃，61.4℃，61.8℃，62.3℃，62.7℃。反应条件为：95℃，30秒；95℃，5秒；tm(梯度温度)，32秒；循环40次。
[0042]
表2梯度pcr反应体系
[0043][0044]
(4)1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物
[0045]
a、用50
×
tae电泳缓冲液和ddh2o按1:49配成1
×
tae缓冲液。
[0046]
b、在锥形瓶中加入100ml配制完成的1
×
tae缓冲液，用电子天平称量2g琼脂粉，倒入缓冲液中摇匀。
[0047]
c、将锥形瓶放于微波炉中加入3分钟左右，至锥形瓶中琼脂粉完全溶解，观察瓶中有无气泡，琼脂粉完全溶解时气泡消失，加热完毕后立即向锥形瓶中加入2.2μlgelred凝胶染色剂，震荡混匀。
[0048]
d、在制胶模具中放入玻璃底板，插上梳子，将冷却至50℃左右的琼脂糖倒入模具中凝固定型(注意倒入速度不宜过快避免产生气泡影响跑胶效果)，凝固后垂直拔出梳子，将凝胶板放入电泳槽中，注意使电泳液没过胶面。
[0049]
e、每个凝胶孔中加入7μl逆转录过的cdna和1μl loading buffer，最后一个凝胶孔加入5.5μl的dnamarker。打开电源，调整电压110v，电泳大概30分钟，使得电泳条带超过凝胶板的三分之二。电泳结束后将凝胶板放入凝胶成像仪中拍照并打印电泳图。
[0050]
(5)qrt-pcr验证mir-29a-3p的表达：结合电泳图，选择条带清晰且强度较高的条带对应的温度作为退火温度，本实验筛选的mir-29a-3p在60℃对应的条带最亮且最清晰，故选择60℃作为qrt-pcr的退火温度。qrt-pcr反应体系配制如表3。反应条件为：95℃，30秒；95℃，5秒；60℃，32秒；循环40次。扩增结束后用2-δct法分析mir-29a-3p的相对表达量。
[0051]
表3rt-qpcr反应体系
[0052][0053]
统计学分析：
[0054]
应用prism5统计软件，采用非配对样本t检验的方法分析graves病与健康对照者外周血pbmcs中mir-29a-3p表达差异，以p《0.05为差异有统计学意义。诊断价值评价应用受试者工作特征(receiver operating characteristic，roc)曲线分析，应用prism5绘制roc曲线并计算曲线下面积auc，来评价mir-29a-3p诊断graves病的敏感性和特异性。auc＜0.5时，表示诊断无意义；auc＝0.5-0.7时，表示诊断准确性较低；auc＝0.7-0.9时，表示诊断准确性较高；auc＞0.9时，表示诊断准确性极高。
[0055]
以u6作为mir-29a-3p的内参基因，mir-29a-3p和u6的溶解曲线如图1所示。mir-29a-3p在graves病患者外周血pbmcs中表达降低，如图2所示，差异有统计学意义(p《0.001)。
[0056]
利用roc曲线分析graves病患者pbmcs细胞mir-29a-3p的表达水平对graves病诊断的检验效能，如图3所示，分析结果显示：mir-29a-3p的曲线下面积(area undercurve，auc)为0.77，提示mir-29a-3p的检测有助于graves病诊断。
[0057]
以最大约登指数(约登指数＝灵敏度 特异度-1)所对应的mirna表达水平作为最佳诊断界点，进一步分析mir-29a-3p对graves病诊断的灵敏度和特异度。结果表明，graves病pbmcs中mir-29a-3p的灵敏度为73.33％、特异度为76.67％，95％可信区间为0.64-0.89。
[0058][0059]
由以上结果可知，mir-29a-3p在graves病患者外周血单个核细胞和健康对照组中存在表达差异，因此可以用作graves病诊断的标志物。