一种RNaseH突变体及其应用的制作方法

一种rnase h突变体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及rnase h突变体及其应用。


背景技术：

2.转录组测序(rna-seq)能全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的几乎所有转录本序列信息，是研究基因表达调控的主要手段。转录组测序中样品是来源于细胞或组织中经分离的总rna，包括编码rna(mrna)和非编码rna(ncrna)。而ncrna又包括lncrna、rrna、trna、mirna和circrna等。对于转录组分析中的目标rna(mrna和lncrna)，rrna的数据属于冗余信息，因为rrna含量占rna总量的80％以上，且提供的转录本信息非常少，浪费了宝贵的测序数据。所以，在rna测序的过程当中，需要进行rrna去除。
3.现主流rrna去除的方法是rnase h消化法，采用特异性的dna探针与rrna杂交，利用rnase h能够特异性消化dna-rna杂交链中的rna单链，而未与探针杂交的mrna、lncrna等不受影响，从而富集目标rna。该方法对低投入量样本(如10ng样本投入)及质量较差样本(如ffpe样本)的兼容性较好，并且rrna去除效率高，价格较低。rnase h消化法包括探针与rrna杂交、rnase h消化rrna链、dnase i消化探针三个主要步骤，其中rnase h消化rrna步骤中，利用rnase h是内切酶，能够特异性消化dna-rna杂合链中的rna链的特性，消化dna探针与rrna杂合链中的rrna。此方法中存在一个明显弊端，即dna探针多以rrna序列为模板设计，力求特异性匹配，所以一般探针长度为30nt及以上，但即使如此，在探针与rrna杂交过程中，也会存在dna探针与非rrna的rna形成短序列的非完整杂交，被rnase h识别及消化，导致非rrna的rna被打断或者降解。
4.因此，获得一种能够准确识别并切割dna-rna杂合链中的rna链rnase h突变体就变得尤为重要。


技术实现要素：

5.本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种rnase h突变体，改变亲本rnase h对杂合链的识别长度，使得rnase h突变体对短的杂交链不识别或不切割，提高rnase h对目标片段识别并切割的准确度。
6.为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明的一方面提供一种rnase h突变体，所述rnase h突变体包含在seq id no.1所示的氨基酸序列中进行突变，所述突变是指插入、取代、或缺失中的一种或多种，优选地，所述突变包含在seq id no.1序列中的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代。
8.在一些实施方案中，所述rnase h突变体包含在seq id no.1所示氨基酸序列的第67位氨基酸进行取代；优选地，所述取代为将d(天冬氨酸)取代为q(谷氨酰胺)或将d取代为n(天冬酰胺)。
9.在一些实施方案中，所述rnase h突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列中第67位的氨基酸的取代为谷氨酰胺。
10.在一些实施方案中，所述rnase h突变体是将seq id no.1序列中第67位的氨基酸的取代为天冬酰胺。
11.在一些实施方案中，所述rnase h突变体包含seq id no.2所示的氨基酸序列。
12.在一些实施方案中，所述rnase h突变体包含seq id no.3所示的氨基酸序列。
13.在一些实施方案中，所述rnase h突变体与seq id no.1或seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，且具有识别并切割dna-rna杂交链中的rna单链的活性。
14.在一些实施方案中，所述rnase h突变体能够识别并切割至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt或50nt互补配对形成的dna-rna杂交链中的rna单链。
15.在一些实施方案中，所述rnase h突变体能够耐受65℃高温至少4小时，且识别并切割dna-rna杂交链中的rna单链的活性不变。
16.编码所述rnase h突变体的核酸。
17.包含所述编码rnase h突变体的核酸的载体。
18.本发明另一方面还提供一种用于表达本发明所述的rnase h突变体的宿主细胞。
19.本发明另一方面提供一种制备本发明所述的rnase h突变体的方法。
20.本发明另一方面还提供本发明所述的rnase h突变体在去除rrna步骤中的应用。
21.本发明另一方面还提供一种试剂盒，所述试剂盒中包含有本发明所述的rnase h突变体。
22.本发明中取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸。
23.术语
24.rnase h：核糖核酸酶h，能够识别并切割dna-rna杂合链中的rna链。
25.rrna残留率：测序数据中rrna的reads在整个测序reads中的占比。
附图说明
26.图1a是实施例1中原酶rnase h对不同长度的dna-rna杂交链进行消化的变性胶检测结果；图1b是实施例1中rh1突变酶对不同长度的dna-rna杂交链进行消化的变性胶检测结果；图1c是实施例1中rh2突变酶对不同长度的dna-rna杂交链进行消化的变性胶检测结果。
27.图2是实施例3原酶rnase h和rh2突变酶消化处理的rna样本文库基因检出数。
28.图3是实施例4原酶rnase h和rh2突变酶高温处理后对rrna消化结果。
具体实施方式
29.下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本发明的示例，并不代表或限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，
所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。
30.表1实施例中涉及的序列
31.引物名称序列(5'
→
3')seq id no.gapdh基因上游引物atttggctacagcaacagggtg7gapdh基因下游引物aactggttgagcacagggtactttat8pgk1基因上游引物accaggtaggttctgagacactt9pgk1基因下游引物gtggtggattacctggaagag10
32.实施例1
33.对原酶rnase h(氨基酸序列见seq id no.1，核苷酸序列见seq id no.4)进行位点突变得到突变酶，使用原酶及突变酶分别对不同长度的dna-rna杂交链进行消化，观察杂交链是否断裂，评价突变酶识别并切割的功能。
34.获得突变体蛋白酶：对原酶rnase h分别进行rh1、rh2位突变，其中，rh1位突变指原酶rnase h第67位氨基酸由d取代为n，rh2位突变指原酶rnase h第67位氨基酸由d取代为q，突变后的序列重组至pet表达载体中，在大肠杆菌中进行蛋白表达，分别得到rnase h突变蛋白rh1突变酶(氨基酸序列见seq id no.2，核苷酸序列见seq id no.5)、rh2突变酶(氨基酸序列见seq id no.3，核苷酸序列见seq id no.6)。
35.识别切割功能的测试：原酶rnase h、rh1突变酶、rh2突变酶以相同酶活(5u/μl)分别对不同长度的dna-rna杂交链进行37℃消化30min，其中dna-rna杂交链分别为1nt互补、2nt互补、4nt互补、6nt互补、8nt互补、11nt互补，消化后的产物通过变性胶检测杂交链是否被切割。
36.识别切割功能的比较：变性胶检测结果如图1所示，当rna链与dna链存在4nt互补配对并形成杂交链时，原酶rnase h即会识别杂交链并进行切割，而rh1突变酶和rh2突变酶均不会对4nt互补配对的杂交链进行切割，当rna链与dna链存在6nt互补配对并形成杂交链时，rh1突变酶和rh2突变酶均会识别杂交链并进行切割，且rh1突变酶切割作用强于rh2突变酶。
37.实施例2
38.以1μg人源hek293细胞所提取的total rna(总rna)作为起始样本，分别使用原酶rnase h、rh2突变酶对total rna进行rrna去除，通过qpcr检测去除rrna后的rna样本中内参基因gapdh mrna、pgk1 mrna的表达量，评价突变酶对非rrna的影响。
39.获得去除rrna的rna样本：使用并参照南京诺唯赞生物科技股份有限公司ribo-off rrna depletion kit(human/mouse/rat)试剂盒(货号n406)的方法，去除total rna中的rrna，其中在rnase h消化步骤中，分别使用原酶rnase h(10u/μl)与rh2突变酶(10u/μl)进行rnase h消化步骤，再使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司rna clean beads试剂盒(货号n412)对消化后产物进行核酸纯化，最终使用35μl nuclease-free ddh2o进行洗脱，取30μl上清作为后续qpcr模板。
40.qpcr检测gapdh mrna、pgk1 mrna的表达量：使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司hiscript ii one step qrt-pcr sybr green kit试剂盒(货号q221)，检测gapdh基因mrna、pgk1基因mrna的表达量，其中使用的引物见表1。
41.qpcr检测结果：表2显示了qpcr的检测结果，无论是在gapdh基因还是在pgk1基因
的检测结果中，原酶rnase h用于消化步骤得到的ct值均大于rh2突变酶用于消化步骤得到的ct值，说明使用rh2突变酶对非rrna的其他rna影响较小。
42.表2 gapdh基因、pgk1基因mrna的表达量
[0043][0044]
实施例3
[0045]
以1μg人源hek293细胞所提取的total rna(总rna)作为起始样本，分别使用原酶rnase h、rh2突变酶对total rna进行rrna去除，对去除rrna后的rna样本进行链特异转录组文库构建。
[0046]
按照实施例2中的方法获得去除rrna的rna样本，再使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司vahts universal v8 rna-seq library prep kit for illumina试剂盒(货号nr605)进行链特异文库构建，对文库产物进行测序分析。
[0047]
测序结果如图2所示，使用rh2突变酶构建的文库基因检出数高于使用原酶rnase h构建的文库检出数。
[0048]
实施例4
[0049]
以1μg人源hek293细胞所提取的total rna(总rna)作为起始样本，原酶rnase h、rh2突变酶经过不同高温处理时间后，对total rna进行rrna去除，在对去除后的rna进行链特异转录组文库构建，评价突变酶的高温耐受性。
[0050]
分别将原酶rnase h、rh2突变酶置于65℃分别孵育1h、4h，获得高温处理后的原酶rnase h、rh2突变酶。
[0051]
按照实施例2中的方法获得去除rrna的rna样本，再使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司vahts universal v8 rna-seq library prep kit for illumina试剂盒(货号nr605)进行链特异文库构建，其中rnase h消化步骤中，分别使用未高温处理的原酶rnase h、rh2突变酶及高温处理后的原酶rnase h、rh2突变酶，对获得的文库产物进行测序分析。
[0052]
结果如图3，测序数据显示rrna残留率，当rh2突变酶进行65℃处理4h后，rrna残留率不足5％，说明高温处理后的突变酶对杂合链中rrna仍有较好的消化作用，而原酶rnase h经过高温处理后rrna残留率比高温处理前高出很多，说明其活性在高温处理后明显减弱。