一种适应猪流行性腹泻病毒的ST悬浮细胞株ST-J及其应用的制作方法

一种适应猪流行性腹泻病毒的st悬浮细胞株st-j及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适应猪流行性腹泻病毒的st悬浮细胞株(命名为st-j)及其应用，尤其涉及在培养猪流行性腹泻病毒以及生产猪流行性腹泻病毒灭活疫苗中的应用。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)引起的一种高度接触性肠道传染病，并且各年龄段的猪对pedv均易感，对养猪业造成严重的经济损失。
3.目前猪流行性腹泻病一般采取疫苗接种进行预防，国内多用vero-e6细胞(非洲绿猴肾细胞)或st细胞(猪睾丸细胞)贴壁或悬浮培养增殖猪流行性腹泻病毒，以生产预防猪流行性腹泻疾病的灭活疫苗。例如专利文献cn107412763a(以下称文献1)公开一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法，其中采用st细胞对pedv进行增殖培养，但其采用的是传统贴壁培养的方法对pedv进行增殖培养，在扩大繁殖过程中需要利用细胞转瓶、细胞工厂等，耗费较多的人力与财力；并且在病毒培养过程中需要进行换液操作，工艺繁琐。现有的悬浮培养方法中，专利文献cn111035756a(以下称文献2)虽然公开一种适用于无血清悬浮培养猪流行性腹泻病毒的st细胞株，但是用其培养pedv的时间为24-30h收获病毒液时的细胞活率低于20％，因此该st细胞株不适用于连续增殖培养pedv，不利于提升产能。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明提供一种st悬浮细胞株，命名为st-j悬浮株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c202150，保藏日期为2021年1月29日。
5.在一些实施方式中，在用上述的st-j悬浮株cctcc no：c202150培养猪流行性腹泻病毒收获的病毒培养液中，病毒的滴度为6.00tcid
50
/0.1ml以上，可选为6.50tcid
50
/0.1ml以上，且st-j细胞的活率为28％以上，可选为28.12％-71.70％。
6.本发明另一方面提供一种利用st-j悬浮株cctcc no：c202150培养猪流行性腹泻病毒的方法，其包括以下步骤：
7.s1：将st-j悬浮株在营养液中扩大培养，获得细胞悬液；
8.s2：向步骤s1的细胞悬液中加入等体积的病毒维持液，随后加入edta-胰酶，并接种猪流行性腹泻病毒种毒，培养；
9.s3：收获病毒培养液。
10.在一些实施方式中，步骤s1中所述扩大培养为至细胞浓度为(4.0-6.0)
×
106细胞/ml，细胞活率达95.0％以上。
11.在一些实施方式中，步骤s1中所述营养液为cd st 258营养液。
12.在一些实施方式中，步骤s2中所述病毒维持液为dmem和/或cd st 239。
13.在一些实施方式中，步骤s2中所述edta-胰酶的加入量为使其终浓度为5-25μg/ml。
14.在一些实施方式中，步骤s2中所述猪流行性腹泻病毒种毒的接种量为1.0％-5.0％。
15.在一些实施方式中，步骤s1中使用摇瓶进行扩所述大培养，扩大培养的条件为：35.0℃-37.0℃，5.0％co2，100rpm/min-130rpm/min摇床培养48-72h。
16.在一些实施方式中，步骤s2中使用摇瓶进行所述培养，培养的条件为：35.0℃-37.0℃，5.0％co2，100rpm/min-130rpm/min摇床培养48-96h。
17.在一些实施方式中，步骤s1中使用生物反应器进行所述扩大培养，扩大培养的条件为：35.0℃-37.0℃，溶氧浓度40％-60％，搅拌转速为：45rpm/min-65rpm/min，ph 7.0-7.4条件下培养48-72h。
18.在一些实施方式中，步骤s2中使用生物反应器进行所述培养，培养的条件为：35.0℃-37.0℃，溶氧浓度40％-60％，搅拌转速为：45rpm/min-65rpm/min，ph 7.0-7.4条件下培养24-96h。
19.在一些实施方式中，步骤s3中在收获的病毒培养液中，st-j细胞的活率为28％以上，可选为28.12％-71.70％，且病毒的滴度为6.00tcid
50
/0.1ml以上，可选为6.50tcid
50
/0.1ml以上。
20.在一些实施方式中，步骤s3中收获的病毒培养液为用于生产猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，所述收获病毒培养液的操作包括：
21.s31：收获步骤s2中培养后的病毒培养上清液，得到第一病毒培养液，并向剩余的病毒培养液中补加新的病毒维持液至培养体积，继续培养；
22.s32：重复n次步骤s31，将n次获得的病毒培养液与第一病毒培养液合并，其中n≥1。
23.在一些实施方式中，步骤s31中所述新的病毒维持液为体积比为1:(1-5)的病毒维持液dmem和cd st 239的混合液。
24.在一些实施方式中，步骤s2中所述猪流行性腹泻病毒种毒为猪流行性腹泻病毒的弱毒株或强毒株。
25.本发明再一方面还提供一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，其利用上述的方法获得的病毒培养液制备而成，其中在所述病毒培养液中，svero-e6细胞的活率为28％以上，可选为28.12％-71.70％，且病毒的滴度为6.00tcid
50
/0.1ml以上，可选为6.50tcid
50
/0.1ml以上。
26.本发明再一方面还提供上述灭活疫苗的制备方法，其在利用st-j悬浮株cctcc no：c202150培养猪流行性腹泻病毒的方法的步骤s3后还包括：
27.s4：浓缩纯化所述病毒培养液，得到浓缩毒液；
28.s5：对步骤s4的浓缩毒液进行灭活处理，得到灭活毒液；
29.s6：将步骤s5的灭活毒液与疫苗佐剂混合，制备得到灭活疫苗。
30.在一些实施方式中，步骤s4中使用500kd浓缩柱(peg 8000，8％-10％添加量)进行纯化浓缩。
31.在一些实施方式中，步骤s5中灭活处理的具体方法为：将步骤s4中的浓缩毒液用
β-丙内酯(终浓度0.02％)4℃灭活22-24h，然后置于37℃水解1.5-2.5h。
32.在一些实施方式中，步骤s6中所述疫苗佐剂为201佐剂，所述灭活毒液与疫苗佐剂的配比为1:(0.8-1.2)。
33.基于以上技术方案，本发明提供一种适应猪流行性腹泻病毒的、可以稳定传代生长的st悬浮细胞株st-j，利用该st-j悬浮株悬浮培养猪流行性腹泻病毒时，病毒能够稳定增殖，并获得高病毒含量的病毒液，并且该细胞株在增殖培养pedv以及收获病毒液时，能够保持较高的细胞活率(28％以上)，因此利用该细胞株可以连续增殖培养pedv并连续多次收获病毒液，能够节约大量的生产成本和培养时间，进而提升产能。
34.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
35.1)与传统st贴壁细胞对pedv进行增殖培养(上述文献1)相比，利用本发明提供的st-j细胞培养pedv，病毒能够稳定增殖，可以获得病毒含量高且毒力强的病毒培养液；另外，传统贴壁培养在病毒扩大繁殖过程中需要利用细胞转瓶、细胞工厂等，耗费较多的人力与财力，而本发明提供的基于悬浮细胞株st-j的悬浮培养方法在放大培养过程中无需利用细胞转瓶和细胞工厂，且在病毒培养过程中和无需进行换液操作，从而简化了疫苗生产工艺，可以明显提高培养效率。
36.2)相对于上述文献2提供的st细胞株，本发明提供的st-j悬浮株在增殖培养pedv以及收获病毒液(培养时间可为48-96h)时，能够保持较高的细胞活率(28％以上)，因此利用该细胞株可以在一次病毒接种后连续增殖培养pedv并连续多次收获具有高病毒含量的病毒液，能够节约大量的生产成本和培养时间，进而提升产能。
附图说明
37.图1为由本发明提供的st-j悬浮株繁殖获得的st-j细胞悬浮培养状态照片。
具体实施方式
38.为了稳定高效获得病毒含量高的猪流行性腹泻病毒培养液，本发明的一个目的是提供一种适应猪流行性腹泻病毒悬浮培养的st悬浮细胞株，利用该细胞株进行pedv增殖培养时，在该细胞株扩大培养后无需经过换液操作便可直接接种pedv，省时省力，并且培养的pedv增殖稳定，并可以在一次病毒接种后连续增殖培养pedv和连续多次收获病毒液，能够高效获得高病毒含量的病毒培养液。由该病毒培养液制备得到的灭活疫苗稳定安全且免疫原性强。
39.以下结合具体实施方式详细说明本发明。
40.在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
41.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
42.实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
43.实施例1：st-j悬浮株的驯化与鉴定
44.1.1、复苏冻存的st细胞(由金宇保灵生物药品有限公司提供)，用含10％新胎牛血清(fbs，购自gibco公司)的dmem(购自gibco公司)培养2代，血清降至8％；再培养3到6代，血清降至5％；再培养2到3代将血清降到3％，再连续培养3代后在培养液中加10％到20％的条件培养基(含有3％fbs的dmem)，传代分瓶比例以48h到72h生长成致密单层为宜。
45.1.2、将步骤1.1中低血清驯化适应3％fbs低血清培养条件的细胞逐步用无血清dmem培养基替代含有血清的dmem，降低分瓶比例。收集悬浮在培养液中细胞和贴附性不好的细胞，也可用胰酶轻度消化后收集剩余细胞，调整细胞密度为(2.5-6.0)
×
105/ml，培养48h离心置换一半培养液。
46.1.3、步骤1.2中无血清悬浮培养待细胞密度达2
×
105/ml以上时，离心后换用无血清dmem培养基继续悬浮培养，每72h传代一次。传代接种密度为6
×
105/ml，至细胞形态和生长规律趋于稳定后冻存，冻存的悬浮细胞保存于液氮内，冻存密度为(1.5-2.0)
×
107/ml，冻存液中加20％fbs和10％dmso。
47.1.4、对步骤1.3收获的适应无血清和悬浮培养条件的细胞进行核型分析，并按照现行版《中国兽药典》对其进行生物学特性检验，结果表明与步骤1.1中的复苏细胞st的核型和生物学特性一致，该步骤获得了适应无血清和悬浮培养的st悬浮细胞株，命名为猪睾丸细胞st-j悬浮株，该细胞株已保存于中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc no：c202150，保藏日期为2021年1月29日。图1示出了由该悬浮细胞株st-j繁殖获得的st悬浮细胞群的悬浮培养状态照片。
48.1.5、st-j悬浮细胞的复苏及传代
49.1.5.1、取cd st 258营养液(购自甘肃健顺生物科技有限公司)，在水浴锅中预热至37℃，取35ml-40ml待用；
50.1.5.2、取出液氮罐中保存的st-j细胞，在37℃水浴锅中快速摇动冻存细胞，确保其快速融化(《1min)，待管中的冰块溶解后停止解冻；
51.1.5.3、在无菌条件下，吸取解冻后的细胞液至已装有预热的营养液的离心管中(步骤1.5.1)，并反吸1ml营养液再清洗一次细胞冻存管内后加到离心管中；
52.1.5.4、将离心管在800rpm-1200rpm条件下离心5min，弃上清，轻轻摇匀管底细胞沉淀，用25ml-35ml预热的新鲜cd st 258营养液重悬细胞并缓慢吹打均匀，将细胞密度最终调整为5.0
×
105细胞/ml左右；
53.1.5.5、将步骤1.5.4的细胞液转移至摇瓶中，将其放入培养摇床中，在35.0℃-37.0℃，5.0％co2，100rpm/min-130rpm/min条件下的摇床内培养；
54.1.5.6、每天取样计数，检测细胞密度(
×
106细胞/ml)和细胞活率(％)，待细胞生长至72h计数，检测细胞密度达到4.0
×
106细胞/ml，细胞活率达到95.0％以上，进行传代；
55.1.5.7、将步骤1.5.6的细胞液以800rpm-1200rpm离心5min，弃上清，轻轻摇匀管底细胞沉淀，通过计算加入适量的cd st 258营养液重悬细胞并缓慢吹打均匀，将细胞密度最终调整为8.0
×
105细胞/ml左右；
56.1.5.8、重复步骤1.5.6与步骤1.5.7，至少传代2到3次，再进行后续处理或者接毒。
57.实施例2：利用st-j悬浮细胞增殖培养pedv
58.2.1、采用摇瓶增殖培养pedv
59.2.1.1：将生长良好的st-j悬浮细胞加入盛有cd st 258营养液(购自甘肃健顺生物科技有限公司)的摇瓶中，于35.0℃-37.0℃，5.0％co2，100rpm/min-130rpm/min摇床培养48h-72h，进行传代放大培养；
60.2.1.2：当步骤2.1.1中细胞密度达到(4.0-6.0)
×
106细胞/ml，活率达到95.0％以上时，加入与营养液体积相同的病毒维持液cd st 239(无血清病毒维持液，购自甘肃健顺生物科技有限公司)，使细胞密度为(2.0-3.0)
×
106细胞/ml；
61.2.1.3：在步骤2.1.2中的培养液内加入终浓度为5μg/ml-25μg/ml的edta-胰酶以及1.0％-5.0％的pedv种毒pedv种毒zj-08(保存于金宇保灵生物药品有限公司，为弱毒株)。接种后于35.0℃-37.0℃，5.0％co2，100rpm/min-130rpm/min摇床培养96h(下表1中示出了pedv的摇瓶中的接种培养条件)，且设置相同条件未加入种毒的摇瓶细胞作为对照组。每日取样，检测细胞密度(
×
106细胞/ml)和细胞活率(％)，并对病毒液中的猪流行性腹泻病毒毒力进行测定，三批次的接毒后测定结果如下表2、3和4所示。
62.表1：pedv的摇瓶中的接种培养条件
[0063][0064]
表2：第一批次接毒后测定结果
[0065][0066]
表3：第二批次接毒后测定结果
[0067][0068][0069]
表4：第三批次接毒后测定结果
[0070][0071]
由表2、表3和表4数据可知，当采用摇瓶将pedv弱毒株接种于st-j悬浮细胞中进行增殖培养，培养时间为72h-96h时，三批次获得的病毒培养液的毒力均可达6.00tcid
50
/0.1ml以上，因此利用st-j悬浮细胞可以稳定增殖培养pedv，获得高病毒含量的病毒液，并且此时的细胞活率为39.48％-48.14％，均具有较高的细胞活率。
[0072]
由此可见，使用本发明提供的st-j悬浮株在摇瓶中可以稳定增殖培养pedv，并且在收获高毒力的病毒培养液时，培养液中st-j悬浮细胞的活率依然处于较高的水平，因此可以通过收获病毒培养上清液并补加新的病毒维持液(其中可含有用于细胞生长的营养液)的方式继续增殖培养pedv弱毒株，可以连续多次收获pedv病毒培养液，以节约生产成本和培养时间。
[0073]
另外，本发明提供的st-j悬浮株对pedv进行增殖培养时，在接毒前可无需进行离心换液，因此操作简便，省时省力。
[0074]
2.2、采用生物反应器增殖培养pedv
[0075]
2.2.1：将st-j悬浮细胞于盛有营养液(同2.1.1)的适宜摇瓶内，于35.0℃-37.0℃，5.0％co2，100rpm/min-130rpm/min摇床培养48h-72h，用病毒维持液cd st 239(同2.1.2)将细胞稀释为(0.5-1.5)
×
106细胞/ml，随后将其转入搅拌式生物反应器(购自瑞士infors公司)，以ph 7.2，溶氧浓度40％-60％的条件进行st-j细胞全悬浮培养；
[0076]
2.2.2：当2.2.1中细胞密度达到(4.0-6.0)
×
106细胞/ml，活率达到95.0％以上时加入与营养液体积相同的病毒维持液cd st 239，使细胞密度为(2.0-3.0)
×
106细胞/ml，随后在培养液中加入终浓度为5μg/ml-25μg/ml的edta-胰酶以及1.0％-5.0％的pedv种毒(同2.1.3)，接种后于35.0℃-37.0℃，溶氧浓度40％-60％，搅拌转速为：45rpm/min-65rpm/min，ph 7.0-7.4条件下培养72h(下表5示出了pedv的生物反应器中的接种培养条件)。培养结束后检测细胞密度(
×
106细胞/ml)和细胞活率(％)，并对猪流行性腹泻病毒
毒力进行测定，三批次的接毒后测定结果见下表6所示。
[0077]
表5：pedv的生物反应器中的接种培养条件
[0078][0079]
表6：pedv的生物反应器中接毒后测定结果
[0080][0081]
由上表6数据可知，当采用生物反应器将pedv弱毒株接种于st-j悬浮细胞中进行增殖培养时，并在接毒后培养时间为72h时收获病毒培养液，三个批次均可以获得病毒毒力在6.50tcid
50
/0.1ml以上的病毒培养液，并且此时收获的三个批次病毒培养液中的细胞活率为39.73％-49.53％，均具有较高的细胞活率。由此可见，基于本发明提供的st-j悬浮株，可采用生物反应器来批量悬浮培养pedv，培养的pedv增殖稳定，并且在接毒后培养时间为72h时，便可以稳定获得毒力较高的病毒培养液，且该病毒培养液中细胞的活率仍较高，因此可以通过收获病毒培养上清液并补加新的病毒维持液的方式继续增殖培养pedv弱毒株，可以连续多次收获pedv病毒培养液，以节约生产成本和培养时间。另一方面，由表2-4和表6的结果也可知，相对于摇瓶培养的方式，在相同培养时间的条件下，采用生物反应器增殖培养pedv可以获得更高滴度的病毒培养液。
[0082]
2.3、采用生物反应器放大培养pedv
[0083]
2.3.1：将st-j悬浮细胞于盛有营养液(同2.1.1)的适宜摇瓶内，于35.0℃-37.0
℃，5.0％co2，100rpm/min-130rpm/min摇床培养48h-72h，用病毒维持液cd st 239(同2.1.2)将细胞稀释为(0.5-1.5)
×
106细胞/ml，随后将其转入两个5l生物反应器(购自瑞士infors公司，两个反应器内同时转入)，以ph 7.2，溶氧浓度40％-60％的条件进行st-j细胞全悬浮培养；
[0084]
2.3.2：当2.3.1中的两个5l生物反应器内的细胞密度均达到(3.0-9.0)
×
106细胞/ml时，将其转移至100l生物反应器(购自天信和(苏州)生物科技有限公司)，补加细胞营养液至60l，以ph 7.2，溶氧浓度40％-60％的条件进行st-j细胞全悬浮培养；
[0085]
2.3.3：当2.3.2中细胞密度达到(3.5-5.0)
×
106细胞/ml时，将其转移至500l生物反应器(购自北京清大天一生物技术有限公司)中，补加细胞营养液至200l，以ph7.2，溶氧浓度40％-60％的条件进行st-j细胞全悬浮培养。当细胞密度达到(4.0-6.0)
×
106细胞/ml时，活率达到95.0％以上时，加入与营养液体积相同的病毒维持液cd st 239，使细胞密度为(2.0-3.0)
×
106细胞/ml，随后加入终浓度为5μg/ml-25μg/ml的edta-胰酶以及1.0％-5.0％的pedv种毒(同2.1.3)，接种后于35.0℃-37.0℃，溶氧浓度40％-60％，搅拌转速为：45rpm/min-65rpm/min，ph 7.0-7.4条件下培养72h。培养结束后检测细胞密度(
×
106细胞/ml)和细胞活率(％)，并对猪流行性腹泻病毒毒力进行测定，三批次的pedv生物反应器放大培养后测定结果见下表7所示。
[0086]
表7：pedv生物反应器放大培养后测定结果
[0087][0088]
由上表7数据可知，将st-j悬浮细胞进行5l到100l再到500l生物反应器放大培养后接种pedv后，三个批次在培养72h后均可以稳定获得毒力均较强的病毒培养液，此时收获的病毒培养液中细胞活率在39.86％-50.17％，均具有较高的细胞活率，且病毒滴度在6.75-7.25tcid
50
/0.1ml。可见基于本发明提供的st-j悬浮株，可以采用生物反应器进行扩大培养后增殖培养pedv，且接毒前无需进行换液操作，接毒后培养的pedv稳定增殖，放大至500l生物反应器接毒后培养72h便可以获得毒力较高的病毒培养液，能为疫苗生产提供足量、高质量的毒液原料。
[0089]
另外，在收获高毒力的病毒液时，st-j悬浮细胞仍具有较高的细胞活率，因此可以通过收获病毒培养上清液并补加病毒维持液的方式继续增殖培养pedv弱毒株，可以连续多次收获pedv病毒培养液，以节约生产成本和培养时间。
[0090]
2.4、采用生物反应器连续增殖培养pedv
[0091]
细胞培养及病毒接种条件同上述步骤2.2.1与2.2.2，接种pedv(pedv种毒zj-08)后48h沉降细胞，收获病毒培养上清液(约占培养总体积的80％-90％)，将剩余病毒培养液保留在反应器内，补充病毒维持液dmem(购自gibco公司)加cd st 239(二者比列在1:5至1:1均可，推荐比例为1:3，此处两者的混合液即为新的病毒维持液，相对于单独使用cd st 239，更有助于pedv的连续增殖培养)至培养体积。补充新的病毒维持液后按照正常条件继续培养24h，沉降细胞，再次收获病毒培养上清液(约占培养总体积的80％-90％)，再按照上述方法继续补充新的病毒维持液至培养体积继续培养，依照此法，继续收获3次病毒培养液(其中最后一次收获所有的病毒培养液)。培养结束后检测细胞密度和细胞活率(％)，并对病毒液中pedv毒力进行测定，进行3批次实验，测定结果见下表8所示。
[0092]
表8：生物反应器中接种pedv种毒后连续收毒测定结果
[0093][0094]
由上表8数据可知，当采用生物反应器将pedv弱毒株接种于st-j悬浮细胞中进行连续增殖培养时，在接毒后培养48h时沉降细胞，可以第一次获得毒力在5.50tcid
50
/0.1ml左右的病毒培养上清液，并且此时的细胞活率为85％以上，具有较高的细胞活率。当第一次收获病毒培养上清液后，向剩余的病毒培养液中再补充新的病毒维持液，之后每24h再重复收获一次病毒培养上清液，可以连续收获4次病毒液(分别命名为1收、2收、3收和4收)。经测定三个批次试验在2收至4收中，细胞活率为28.7％-63.88％(即收获病毒液时的细胞活率在28％以上)，测定的病毒培养液的毒力均在6.50tcid
50
/0.1ml以上。可见，基于本发明提供的st-j悬浮株，可采用生物反应器来连续增殖培养pedv，培养的pedv增殖稳定，并且在一次接毒后可通过收获病毒培养上清液并补充新的病毒维持液的方法，连续多次收获毒力稳定且毒力高的pedv病毒培养液，因此可以大量节约生产成本和培养时间。并且相对于单次全部收获病毒培养液(上述步骤2.3中所述)的方式，连续增殖培养pedv并连续多次收获病毒液的方式更有利于保持较高的细胞活率。
[0095]
2.5、采用生物反应器增殖培养pedv强毒株
[0096]
2.5.1：将st-j悬浮细胞于盛有营养液(同2.1.1)的适宜摇瓶内，于35.0℃-37.0℃，5.0％co2，100rpm/min-130rpm/min摇床培养48h-72h，用病毒维持液cd st 239(同2.1.2)将细胞稀释为(0.5-1.5)
×
106细胞/ml，随后将其转入搅拌式生物反应器(购自瑞士infors公司)，以ph 7.2，溶氧浓度40％-60％的条件进行st-j细胞全悬浮培养；
[0097]
2.2.2：当2.2.1中细胞密度达到(4.0-6.0)
×
106细胞/ml，活率达到95.0％以上时加入与营养液体积相同的病毒维持液cd st 239，使细胞密度为(2.0-3.0)
×
106细胞/ml，随后在培养液中加入终浓度为5μg/ml-25μg/ml的edta-胰酶以及0.5％-2.0％的pedv-gd种毒(保存于金宇保灵生物药品有限公司，为强毒株)，接种后于35.0℃-37.0℃，溶氧浓度40％-60％，搅拌转速为：45rpm/min-65rpm/min，ph 7.0-7.4条件下培养48h(下表9示出了pedv的生物反应器中的接种培养条件)。培养结束后检测细胞密度(
×
106细胞/ml)和细胞活率(％)，并对猪流行性腹泻病毒毒力进行测定，三批次的接毒后测定结果见下表10所示。
[0098]
表9：pedv强毒株的生物反应器中的接种培养条件
[0099][0100]
表10：pedv强毒株的生物反应器中接毒后测定结果
[0101]
[0102]
由上表10数据可知，当采用生物反应器将pedv强毒株接种于st-j悬浮细胞中进行增殖培养，并在接毒后培养时间为48h时收获病毒培养液，三个批次均可以获得毒力在7.25tcid
50
/0.1ml以上的病毒培养液，且此时三批次病毒培养液中细胞的活率为35.76％-42.77％，均具有较高的细胞活率。可见，基于本发明提供的svero-e6悬浮细胞株，可采用生物反应器来批量悬浮培养pedv强毒株，培养的pedv增殖稳定，并且在接毒后培养时间为48h时，便可以获得毒力较高的病毒培养液，且该病毒培养液中细胞的活率较高，因此可以通过收获病毒培养上清液并补加新的病毒维持液的方式继续增殖培养pedv强毒株，可以连续多次收获pedv病毒液，以节约生产成本和培养时间。
[0103]
2.6、采用生物反应器连续增殖培养pedv强毒株株
[0104]
细胞培养及病毒接种条件同上述步骤2.5.1与2.5.2，接种pedv-gd毒株后24h沉降细胞，收获病毒培养上清液(约占培养总体积的80％-90％)，将剩余病毒培养液保留在反应器内，补充新的病毒维持液至培养体积。补充新的病毒维持液后按照正常条件继续培养24h，沉降细胞，收获病毒培养上清液(约占培养总体积的80％-90％)，再继续补充新的病毒维持液至培养体积继续培养，依照此法，继续收获3次病毒液。培养结束后检测细胞密度和细胞活率(％)，并对病毒液中pedv毒力进行测定，进行3批次实验，测定结果见下表11所示。
[0105]
表11：pedv-gd株生物反应器中接毒后连续收毒测定结果
[0106][0107]
由上表11数据可知，当采用生物反应器将pedv强毒株接种于st-j悬浮细胞中进行连续增殖培养，并在接毒后培养24h时沉降细胞，可以第一次获得毒力在6.50tcid
50
/0.1ml以上的病毒培养上清液，并且此时的三个批次培养液中细胞的活率为60％以上，均具有较高的细胞活率。当第一次收获病毒上清液后，向剩余的病毒培养液中补充新的病毒维持液，之后每24h再重复收获一次病毒培养上清液，可以连续收获4次病毒液(分别命名为1收、2收、3收和4收)。经测定三个批次试验在1收至4收中，细胞活率为28.12％-71.70％，测定的病毒培养液的毒力均在6.25tcid
50
/0.1ml以上。可见，基于本发明提供的st-j悬浮株，可采
130rpm/min摇床培养96h，且设置相同条件未加入种毒的摇瓶细胞作为对照组。每日取样，检测细胞密度(
×
106细胞/ml)和细胞活率(％)，并对猪流行性腹泻病毒毒力进行测定，结果如表12所示。
[0120]
表12：pedv接种于vero-e6贴壁细胞与st-j悬浮细胞的毒力比较
[0121][0122]
由上表12数据可知，在培养条件相同的情况下，将pedv接种于st-j悬浮细胞后的毒力较pedv接种于vero-e6贴壁细胞后的毒力提高了1个病毒滴度以上，甚至达到2个病毒滴度。可见本发明提供的st-j悬浮细胞以及基于该悬浮细胞株的pedv培养方法相对于传统vero-e6贴壁细胞培养方法，可以获得病毒含量更高、毒力更强的病毒培养液。
[0123]
实施例4：猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备
[0124]
4.1、猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备方法包括以下步骤：
[0125]
s1：根据实施例2中的培养方法收获病毒培养液后，使用500kd浓缩柱(peg 8000，8％-10％添加量)进行纯化浓缩，一般进行10倍浓缩，得到浓缩毒液；
[0126]
s2：将步骤s1中的浓缩毒液用β-丙内酯(终浓度可为0.02％)4℃灭活22-24h，例如24h，然后置于37℃水解1.5-2.5h，例如2h，得到灭活毒液；
[0127]
s3：在步骤s2中的灭活毒液中加isa201佐剂(购自seppic公司)，病毒液与isa201质量比为1:(0.8-1.2)，例如1:1，37℃搅拌混匀，制得油乳剂疫苗；
[0128]
s4：将油乳剂疫苗定量分装，加盖密封，贴签后，置2℃-8℃，保存，制备获得猪流行性腹泻病毒灭活疫苗。
[0129]
4.2、猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的检测
[0130]
性状：乳白色略带粘滞性乳状液。
[0131]
装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检查，符合规定。
[0132]
无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
[0133]
安全检验：选用pedv中和抗体效价小于1:8及抗原均为阴性的30-40日龄、健康仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗4ml(2头份)，连续观察14日，所有仔猪未出现由疫苗接种引起的不良反应。
[0134]
效力检验
[0135]
免疫攻毒检验法：选用pedv中和抗体效价小于1:8及抗原均为阴性的怀孕12-14周的母猪2头，随机分为免疫组与对照组，每组各1头，免疫组母猪于产前28天及14天经颈部肌肉注射疫苗各1次，每次2ml；对照组用dmem-isa 201以相同方式免疫。各组随机选取仔猪5
头，每头仔猪口服检验用病毒液2ml(含10
3.0
tcid
50
)，攻毒后放回各自母猪舍继续喂养，连续观察5天，免疫组仔猪应全部保护，对照组仔猪应至少4/5发病。
[0136]
经疫苗安全性测试和免疫攻毒试验，该实施例制备得到的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗免疫原性好，且稳定安全，能够有效用于预防猪流行性腹泻疾病。
[0137]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。