一种细胞保存液、冻存套装及细胞冻存方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，主要涉及一种可直接回输的细胞保存液、冻存套装及细胞冻存方法。


背景技术：

2.癌症是困扰人类健康的首要问题，细胞免疫疗法为肿瘤的预防和治疗提供了广阔的前景。但是在临床实际应用的过程中，存在部分肿瘤患者自身免疫细胞难以采集、细胞扩增能力差、免疫细胞与其它治疗方式的时间窗口难以配合等诸多问题；此外，从药物研发和生产的角度，新鲜免疫细胞的异地运输、保存条件和存活时间都受到一定限制。所以，免疫细胞的有效冻存为免疫细胞作为药物进行产业化应用提供必要的基础技术保障。
3.但是，目前市面上的免疫细胞冻存液多以胎牛血清、高比例二甲基亚砜、患者自体血浆、非临床应用级试剂配制而成，这些冻存液存在以下问题：1.冻存效果差；2.冻存液成分不明确；3.冻存过程和后续应用程序相对繁琐；4.临床应用存在风险性；5.不适于形成产业化。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种可直接回输人体的免疫细胞保存液及其应用，显著提高了细胞冻存及解冻的存活率，避免了回输患者体内产生的污染。该保存液新颖实用，高效便捷，具有广阔的应用前景和市场价值。
5.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
6.本发明的第一方面，公开了一种细胞保存液，其包括二甲基亚砜、人血清白蛋白；还包括羟乙基淀粉、dextran 40和勃脉力a中的至少一种。
7.进一步的，细胞保存液包括3～4.9％二甲基亚砜、16～20％人血清白蛋白、0～79％羟乙基淀粉、0～16.7％dextran 40和0～75.1％勃脉力a。
8.进一步的，所述细胞保存液用于保存免疫细胞。
9.进一步的，所述免疫细胞包括t细胞、nk细胞、单个核细胞、dc细胞、car-t细胞和ctl细胞中的任一种或至少两种的组合。
10.本发明的第二方面，公开一种冻存套装，其包括细胞保存液以及还包括保存袋，所述保存袋为可与医用输液器连接的细胞保存袋。方便解冻后的免疫细胞直接回输患者体内，减少复苏后离心洗涤的操作步骤，避免了污染。
11.本发明的第三方面，公开一种细胞冻存方法，包括如下步骤：取培养扩增后的免疫细胞至离心管中，离心10～20min。用pbs/生理盐水洗涤两遍，计数；根据计数结果，用制备得到的预冷的细胞保存液重悬细胞，使得重悬细胞密度在1.2～1.3
×
106/ml，以10～20ml每袋移至50ml保存袋，然后转移至梯度降温冻存盒置于-85～-75℃冰箱16～24h后再转移至液氮罐中保存。
12.本发明具有的有益效果：
13.(1)本发明通过优化细胞冻存液的组分及配比，避免较大体积的冰晶形成，提高冻存过程中细胞的存活率；同时在复温过程中，选用大体积的保存袋，使得解冻过程中传热更为均匀，复苏时间更短，保证较高的细胞存活率。解冻后将保存袋可以与医用输液器直接连接，直接用于回输人体，不会产生安全隐患，同时避免多步操作引发的污染。
14.(2)本发明提供的可输液的细胞保存液及保存套装新颖实用，高效便捷，保存液及保存套装制作简单，易实现且不受细胞种类的限制。
具体实施方式
15.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
16.实施例1
17.配置细胞保存液：将4.9％二甲基亚砜、16％人血清白蛋白、50％羟乙基淀粉、0％dextran40、29.1％勃脉力a。混匀后4℃冰箱待用。
18.冻存细胞：取培养扩增后的t细胞至离心管中，300g离心10min。用pbs/生理盐水洗涤两遍，计数。根据计数结果，用制备得到的预冷的细胞保存液重悬t细胞，使得细胞密度在1.25
×
106/ml，体积10ml/袋；转移至50ml冻存袋，然后转移至梯度降温冻存盒置于-80℃冰箱16h后再转移至液氮罐中保存。
19.试验细胞复苏检测：15d后复苏取冻存细胞1袋，取样检测(各取3个样)，第一次离心后再取样检测(各取3个样)，取部分细胞做流式测细胞凋亡。
20.试验细胞复苏后培养：取少量细胞于t-25瓶中培养，采集数据，绘制生长曲线。
21.试验结果数据分析见实验检测。
22.实施例2
23.配置细胞保存液：将4.9％二甲基亚砜、16％人血清白蛋白、79.1％羟乙基淀粉、0％dextran40、0％勃脉力a。混匀后4℃冰箱待用。
24.冻存细胞：取培养扩增后的t细胞至离心管中，300g离心10min。用pbs/生理盐水洗涤两遍，计数。根据计数结果，用制备得到的预冷的细胞保存液重悬t细胞，使得细胞密度在1.25
×
106/ml，体积10ml/袋；转移至50ml冻存袋，然后转移至梯度降温冻存盒置于-80℃冰箱16h后再转移至液氮罐中保存。
25.试验细胞复苏检测：15d后复苏取冻存细胞1袋，取样检测(各取3个样)，第一次离心后再取样检测(各取3个样)，取部分细胞做流式测细胞凋亡。
26.试验细胞复苏后培养：取少量细胞于t-25瓶中培养，采集数据，绘制生长曲线。
27.试验结果数据分析见实验检测。
28.实施例3
29.配置细胞保存液：将4.9％二甲基亚砜、20％人血清白蛋白、0％羟乙基淀粉、0％dextran40、75.1％勃脉力a。混匀后4℃冰箱待用。
30.冻存细胞：取培养扩增后的t细胞至离心管中，300g离心10min。用pbs/生理盐水洗涤两遍，计数。根据计数结果，用制备得到的预冷的细胞保存液重悬t细胞，使得细胞密度在1.25
×
106/ml，体积10ml/袋；转移至50ml冻存袋，然后转移至梯度降温冻存盒置于-80℃冰箱16h后再转移至液氮罐中保存。
31.试验细胞复苏检测：15d后复苏取冻存细胞1袋，取样检测(各取3个样)，第一次离心后再取样检测(各取3个样)，取部分细胞做流式测细胞凋亡。
32.试验细胞复苏后培养：取少量细胞于t-25瓶中培养，采集数据，绘制生长曲线。
33.试验结果数据分析见实验检测。
34.实施例4
35.配置细胞保存液：将4.9％二甲基亚砜、20％人血清白蛋白、0％羟乙基淀粉、16.7％dextran40、58.4％勃脉力a。混匀后4℃冰箱待用。
36.冻存细胞：取培养扩增后的t细胞至离心管中，300g离心10min。用pbs/生理盐水洗涤两遍，计数。根据计数结果，用制备得到的预冷的细胞保存液重悬t细胞，使得细胞密度在1.25
×
106/ml，体积10ml/袋；转移至50ml冻存袋，然后转移至梯度降温冻存盒置于-80℃冰箱16h后再转移至液氮罐中保存。
37.试验细胞复苏检测：15d后复苏取冻存细胞1袋，取样检测(各取3个样)，第一次离心后再取样检测(各取3个样)，取部分细胞做流式测细胞凋亡。
38.试验细胞复苏后培养：取少量细胞于t-25瓶中培养，采集数据，绘制生长曲线。
39.试验结果数据分析见实验检测。
40.实施例5
41.配置细胞保存液：将10％二甲基亚砜、20％人血清白蛋白、0％羟乙基淀粉、16.7％dextran40、53.3％勃脉力a。混匀后4℃冰箱待用。
42.冻存细胞：取培养扩增后的t细胞至离心管中，300g离心10min。用pbs/生理盐水洗涤两遍，计数。根据计数结果，用制备得到的预冷的细胞保存液重悬t细胞，使得细胞密度在1.25
×
106/ml，体积10ml/袋；转移至50ml冻存袋，然后转移至梯度降温冻存盒置于-80℃冰箱16h后再转移至液氮罐中保存。
43.试验细胞复苏检测：15d后复苏取冻存细胞1袋，取样检测(各取3个样)，第一次离心后再取样检测(各取3个样)，取部分细胞做流式测细胞凋亡。
44.试验细胞复苏后培养：取少量细胞于t-25瓶中培养，采集数据，绘制生长曲线。
45.试验结果数据分析见实验检测。
46.实验检测
47.取实施例1-5的少量解冻后的细胞用台盼蓝染色法检测细胞活率，结果见表1；
48.表1
49.样品(复苏后)活率(％)活细胞回收率(％)样品(洗涤后)活率(％)活细胞回收率(％)实施例194.1898.5实施例194.9782.0实施例289.599.7实施例296.3270.1实施例396.4574.5实施例395.1357.3实施例494.44109实施例491.4174.8实施例594.01106实施例591.9056.4
50.复苏后细胞生长曲线测定，详见表2；
51.表2
[0052][0053][0054]
由表1和表2可知，细胞冻存液的组分及配方在本发明提供的范围内，解冻后细胞存活率均高于89％以上，分析数据发现实施例4中细胞复苏离心后的活细胞回收率最高。在生长曲线对比中，实施例4中在培养效果相对更好，细胞生长速度更快。实施例5虽然细胞回收率好，但是二甲基亚砜浓度高，需要洗涤后才能进行回输，且在洗涤后的细胞回收率较低。
[0055]
综上所述，本发明提供的细胞保存液及保存套装简洁高效，细胞冻存液各组分协同增效，提供细胞冻存过程的存活率，复苏后活细胞回收率98％以上，选用冻存袋保存，在复苏后可直接回输患者体内，操作更方便，避免污染，在免疫细胞冻存和回输治疗过程有巨大的应用价值。
[0056]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。