用于肿瘤光热治疗的光驱动纳米马达群的制作方法

1.本发明属于材料技术领域，具体涉及用于肿瘤光热治疗的光驱动纳米马达群。


背景技术：

2.受自然界中自我迁移的生物体的启发，合成的微纳米马达被设计出来，能够将化学燃料或外部能量转化为自我推动力。这些小型化的移动装置在生物医学领域显示出巨大的潜力，包括主动货物运送、生物治疗、生物传感，甚至精确手术，例如一个微型机器人("neutrobot") 可以主动运送货物到体内的恶性胶质瘤。
3.在这些电机中，光驱动的电机系统因其在光学领域的高可编程性而受到越来越多的关注。 chen等人报道了一个tio
2-au纳米线马达，它可以被紫外光场精确控制并调节单神经元活动。展示了tio2微电机在光下的精确操纵。zheng和他的同事开发了由近红外驱动的janus介孔二氧化硅纳米马达，它可以有效地寻找、粘附和机械地穿透肿瘤细胞作为主动诊断成像剂。虽然在上述情况下，单个马达可以被精确控制，但当涉及到解决实际问题时，单个马达只能装载有限的药物/材料/细胞，而且小的单个马达往往难以观察。申请人非常希望能够模仿生物体的集群来操纵马达群，以实现单个马达无法完成的任务。
4.自然界中的许多生物，如鸟类、昆虫和鱼类，都能展示集群运动。这些集体行为在捕食、狩猎和迁移过程中经常涉及。自从发明了第一个合成微/纳米马达，使单个马达同步化并精确控制微纳米马达群是一个雄心勃勃的目标，以模仿自然界的集体行为。大量的努力被投入到具有仿生集体行为的人工马达群中。sun等人展示了近红外光供电的核壳微马达可以聚集成书法/绘画。altemose等人报告胶体粒子在紫外灯照射下聚集成团，在聚集和分散之间交替进行。ji和他的同事开发了聚合物刷子接枝的janus金纳米游泳器，并以葡萄糖的催化分解为动力，这种纳米游泳器能够通过葡萄糖的浓缩实现群落的自向运动，能够有效模仿细菌的运动。虽然电机集群已经开始实现，但利用电机集群来实现某些单个电机无法完成的任务仍然是一个挑战。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的，在于提供一种纳米马达的制备方法。
6.本发明的第二个目的，在于提供一种纳米马达。
7.本发明的第三个目的，在于提供上述纳米马达的应用。
8.本发明的第四个目的，在于提供一种实时光热治疗系统。
9.本发明的第五个目的，在于提供一种纳米马达的集群运动控制方法。
10.本发明所采取的技术方案是：
11.本发明的第一方面，提供一种纳米马达的制备方法，包含以下步骤：
12.s1：在聚碳酸酯膜的一侧进行喷金处理；
13.s2：以喷金后的聚碳酸酯膜作为工作电极，ag/agcl作为参比电极、铂金丝为反电极建立三电极沉积体系；
14.s3：在三电极沉积体系中，依次加入cu沉积液和au沉积液进行沉积；
15.s4：cu和au的电镀完成后，取出聚碳酸酯膜，去除膜上的金层后用蚀刻剂蚀刻以释放纳米马达。
16.在本发明的一些实施方式中，所述聚碳酸酯薄膜孔径为300～500nm，膜的直径为13～ 21mm。
17.在本发明的一些实施方式中，所述聚碳酸酯薄膜孔径为400nm，膜的直径为19mm。
18.在本发明的一些实施方式中，所述喷金处理的具体步骤为：在0-1nm厚度时，沉积速度为0.03～0.08a/s，1-15nm厚度时，沉积速度为0.1～0.15a/s，15-200时沉积速度为0.6-0.7a/s。
19.在本发明的一些实施方式中，所述cu沉积过程为：在2.5～4ma/cm2的恒定电流密度下沉积10～20min。
20.在本发明的一些实施方式中，所述cu沉积过程为：在3.75ma/cm2的恒定电流密度下沉积20min。
21.在本发明的一些实施方式中，所述au沉积过程为：在0.4～0.6ma/cm2的恒定电流密度下沉积15～25min。
22.在本发明的一些实施方式中，所述au沉积过程为：在0.55ma/cm2的恒定电流密度下沉积15min。
23.在本发明的一些实施方式中，所述cu沉积液是为本领域常用的cu沉积液均可，所述 cu沉积液为可溶性二价铜离子盐，其中铜为唯一正离子，铜离子浓度为0.3-0.5mol/l，优选为0.375mol/l；使用ph调节剂调节ph为4～5.5。
24.在本发明的一些实施方式中，所述可溶性二价铜离子盐为硫酸铜、硝酸铜和氯化铜等可溶性二价铜离子盐溶液。
25.在本发明的一些实施方式中，所述ph调节剂为硫酸、硝酸、盐酸等。
26.在本发明的一些实施方式中，所述cu沉积液还包含维持ph稳定物质，优选为硼酸。
27.在本发明的一些实施方式中，所述au沉积液为本领域常用的au沉积液均可。
28.在本发明的一些实施方式中，所述蚀刻剂为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷、四氯乙烷或四氢呋喃。
29.在本发明的一些实施方式中，所述蚀刻的目的为将聚碳酸酯膜充分溶解，将里面的马达释放出来。
30.在本发明的一些优选实施方式中，加入蚀刻剂后，利用涡旋震荡器震荡8～12min，然后超声分散4～6min。
31.在本发明的一些实施方式中，所述释放纳米马达后还需要离心、清洗。
32.在本发明的一些实施方式中，所述离心的条件为：6000～8000rpm/min；时间为2～6min。
33.在本发明的一些实施方式中，所述清洗为使用不溶解纳米马达的有机溶剂进行清洗；优选为使用乙醇清洗。
34.本发明的第二方面，提供一种纳米马达，由本发明第一方面所述方法制备。
35.本发明的第三方面，提供本发明第二方面所述的纳米马达在(i)～(iii)至少一项中的应用：
为在红外光强1.27μwμm-2
照射下的马达运动轨迹；图4f为au-cu马达在近红外光照射下的 msd曲线图；图4g为au马达在近红外光照射下的msd曲线图；图4h为马达的布朗运动速度和在近红外光照射后速度的差异图。
51.图5为au-cu马达对肿瘤的近红外光热治疗效果。其中图5a、图5b、图5c和图5d分别为在肿瘤细胞中加入马达后，打开紫外灯随时间(0s、100s、200s和300s)照射聚集的图片；图5e为在肿瘤细胞中单纯加入马达而补照射的细胞图；图5f为在肿瘤细胞中单照射近红外光后的细胞图；图5g为肿瘤细胞在加入马达后用近红外光照射后的细胞图。
52.图6为au-cu马达的元素分析图。
53.图7为au-cu马达的紫外吸收光谱。
54.图8为对照组在近红外光照射下温度的变化。
55.图9为纯金管马达的sem图片。
56.图10为au-cu马达在近红外光(0.64μw
·
cm-2
)下随着时间的聚集尺寸大小。
57.图11为3t3细胞在加入au-cu马达后的细胞活性。
58.图12为实验组(金-铜纳米马达处理的细胞)在近红外光照射下的温度变化(0.64μw
·
cm-2
)。
59.图13为大视野范围下(明场以及荧光场)细胞的局部死亡图。
具体实施方式
60.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
61.其中本发明中au-cu马达的制备以及加入马达后将细胞用于肿瘤细胞治疗的流程示意图见图1。
62.材料和方法
63.1、纳米马达的合成
64.试管状的au-cu纳米马达是按以下方法制造：
65.聚碳酸酯膜(孔径400nm)被预处理，在一侧沉积金(厚度200nm)，具体过程为在真空蒸镀机抽真空到2
×
10-4
开始蒸镀，在0-1nm厚度时，沉积速度为0.05a/s，1-15nm厚度时，沉积速度为0，1a/s，15-200时沉积速度为0.6-0.7a/s。对于金和铜的连续沉积，使用了一个三电极系统，其中浸泡在nacl中的ag/agcl电极作为参比电极，铂金丝作为反电极，聚碳酸酯膜在喷金后作为工作电极。然后用cu沉积液(6g硫酸铜、0.15g酸和1.5g硼酸分散在 100g去离子水中)在3.75ma cm-2
的恒定密度下沉积20min，得到铜棒段，接着用au沉积液 (微蓝科技公司所购买的18k电镀黄金液)，电流密度改为0.55ma cm-2
，沉积时间为15min，在铜棒上获得空心金管。
66.铜和金的电镀完成后，取出聚碳酸酯膜，通过机械抛光去除膜上的金层。然后用去离子水冲洗聚碳酸酯膜，再用dmf蚀刻以释放金属纳米棒，蚀刻的具体条件为利用涡旋震荡器震荡10min，然后超声分散5min；主要是为了将聚碳酸酯膜充分溶解，将里面的纳米马达释放出来。将得到的au-cu nms离心，转速为8000rpm/min，时间为3min，用乙醇和水清洗以
去除残留的有机溶剂。
67.结果和讨论
68.1、表征
69.通过扫描电子显微镜(sem)、能量色散x射线光谱(edx)和透射电子显微镜(tem) 对制造的试管形金-铜纳米马达进行了表征。图2a显示了从聚碳酸酯薄膜中收获的分散的金
‑ꢀ
铜纳米马达(au-cu nms)的sem图像，其特征形态为一维拉长的棒状结构。平均直径被确定为444.1
±
77纳米，总金属纳米棒的平均长度被测量为1.98
±
0.43微米(图2c，图2d)。金属纳米棒的放大图，见图2b。通过edx图谱分析(图2f，图6)，显示了元素分布。金的这段的长度为1.64μm，铜的这段的长度为0.43μm。对于金属元素含量(不包含o)比例，88.5％是金，11.5％是铜。从单个金-铜纳米马达的tem图像(图2e)可以看出，铜的这段是棒状的，而金的部分是空心的。这种半封锁的结构有利于推进运动，金的一面被加热，在结构上类似于纳米火箭。
70.在确认形态后，使用实时红外温度相机评估了光热转换。记录了分散在pbs和纯pbs 溶液中的au-cu nms(图3a)在20秒的近红外照射(808nm，0.64μwμm-2
)后的温度。纯 pbs(对照组)的温度只上升了2.9℃，而添加了au-cu nms的pbs(实验组)的温度则急剧上升了8.6℃。当近红外曝光时间延长到3min后(图3c)，实验组和对照组的温度差异变得越来越明显。对照组的温度没有随着近红外时间的增加而发生明显变化，近红外照射3min 后，温度上升了2.4℃。相反，实验组的温度从最初的28.3℃迅速上升到59.8℃的高温，温差为31.5℃。
71.为了评估该系统的光稳定性，应用了三个周期的照射(图3d)，观察到了极好的可重复的光热效应。从au-cu nms的吸收光谱可以看出，au-cu nms在808nm左右的波长范围内有明显的吸收(图7)，这可以解释这一现象。为了进一步研究au-cu nms集群的光热效应，使用相同波长和强度的光来诱导au-cu nms的聚集/集群形成(808nm，0.64μwμm-2
)。记录了近红外照射后的温度，结果显示，团簇中心的最高温度可以达到46.0℃，与初始状态(28.3℃) 相比，明显增加了17.7℃(图3b)。相比之下，没有纳米马达的对照组只经历了1.1℃的温度上升(图8)。
72.这为以后探索使用au-cu nms集群作为光热剂来根除hela肿瘤细胞提供了基础。
73.2、纳米马达的聚集和集体迁移
74.近红外(808nm)光源被夹紧并固定在一个三维可控的移动平台上。通过交替打开/关闭近红外按钮，可逆的au-cu nms的聚集被启用。光斑的位置可以通过操纵移动台来改变，在移动台中，马达集群会跟随光斑的引导而迁移(图4b)。
75.3、au-cu nms的运动分析
76.按照设计和制备的不对称au-cu nms，可以通过近红外辐照诱导au段的等离子体加热实现自推进。等离子体加热随着时间和辐照强度的增加而增强，因此在随后的运动分析中，有必要考虑这两个因素。在近红外照射下，纳米马达进行自主运动，其速度与光的强度相关 (图4f)。对速度的分析表明，通过增加激光功率，从扩散性(布朗式)运动过渡到推进性运动，这一点从轨迹距离的增加可以看出(图4c)。为了更好地理解近红外光强度和运动增强之间的关系，通过将平均平方位移(msd)曲线及其斜率与激光功率的大小相关联来研究其纳米马达的运动(图4d，图4e)。然而，为了研究铜密封的金管结构是否有利于纳米马
达的移动，研究了对称金管纳米马达在近红外下的移动(图9)。其msd曲线被绘制出来(图4e)。从实验数据来看，au-cu nms的msd曲线比没有铜帽的对照au管高20％。这是因为金的这段的光活化等离子体加热效果比铜的这段强，导致纳米马达两边的加热不对称。此外，铜棒密封金管也进一步促进了推进力。此外，在检查轨迹时发现，纳米马达(对近红外照射的反应)倾向于向光源移动，或表现出光轴。
77.以上是单个纳米马达的运动分析。
78.4、纳米马达集群运动分析
79.当纳米马达分散在去离子水(2.35
×
105纳米马达/ml)中后，纳米马达表现出不规则的布朗运动，速度为2.2
±
0.3μm/s。随着近红外的开启，au-cu nms被激活并向光点移动，形成集群(图5a)。随着近红外的持续照射，这种聚集行为可以保持，而且随着时间的推移，纳米马达的聚集尺寸变得更大(图10)。
80.纳米马达群的导航是具有挑战性的，但它们在复杂的生物应用中的使用可能具有重大意义。在这里，申请人通过移动近红外光束的照射点来展示纳米马达群的引导运动，如图4b所示。最初，在近红外照明下，au-cu nms集群保持在位置ⅰ。随着近红外光斑的移动，蜂群也跟着移动，从而按时间顺序从位置ⅰ迁移到中间站ⅱ和ⅲ，最后到目的地ⅳ。蜂群在两个位置之间移动，平均速度分别为32.2μm/s、44.5μm/s和50.9μm/s。纳米马达在移动时有轻微加速的趋势。据推测，由于蜂群不断聚集单个纳米马达，扩大了蜂群，从而增加了马达的浓度，提高了加热/移动的效率。当蜂群聚集足够长的时间后，发现速度稳定在47.8μm/s左右，与上述假设一致。通过使用近红外照射实现对蜂群的精确控制，这为纳米电机解决更复杂的问题提供了思路和可能性。
81.当近红外光(0.64μwμm-2
)在au-cu nms溶液上照射200s时，近红外照射区被选择性地加热。nir的辐照区和非辐照区之间的最大温差(δt)被确定为24.7℃(图3b)。相比之下，在没有au-cu nms的对照试验中，近红外辐照后的最大温差只有5.1℃(图8)。这些对照试验的温差进一步证明了au-cu nms在近红外辐照下具有良好的吸收能力。在含有au-cunms的实验中，所产生的温度梯度是由金的表面等离子体共振将光能转化为热能，导致纳米马达的聚集而产生的，这已被自然对流方程(1)和马兰戈尼对流方程(2)所验证。自然对流是由温度不均匀的流体不同部分之间的密度差(ρnir,ρ0)引起的对流传热现象，从而产生浮力。自然对流的强度可以用格拉什数(gr)来描述。
[0082][0083]
这里，g代表重力加速度，δt是近红外辐照水和非辐照区域的温度差，d为水滴直径，β和ν分别为水的热膨胀系数和粘度。当gr《2400时，自然对流可以被忽略。
[0084]
实验组的gr结果为18141.2，表明自然对流对纳米马达的聚集有影响。相比之下，没有au-cu nms的对照组的gr结果为1932.6，表明没有马达的自然对流的影响可以忽略不计。。为了弄清纳米马达移动和蜂拥的其他因素，申请人计算了马兰戈尼数(ma)以验证本实验中马兰戈尼对流的影响。马兰戈尼对流是由近红外辐照部分(σnir)和非辐照部分(σ0)之间的表面张力差异引起。
[0085]
[0086]
其中dy/dt代表不同温度下的表面张力变化率，δt为温差，α和μ为水的热扩散系数和动态粘度。实验组的马氏计算值为285.8(有纳米马达)和39.9(无纳米马达)，当ma《80时，马兰戈尼对流可以被忽略，因此，对于au-cu nms，它可以通过提高局部温度来产生马兰戈尼对流，马兰戈尼对流也可以在纳米马达的蜂拥中起作用。
[0087]
与操纵粒子的光学镊子的能量密度相比，本工作中应用的最大近红外功率密度 (1.27μwμm-2
)要低三个数量级，因此光学力对纳米马达的成群或集体迁移的影响是可以忽略的。
[0088]
基于上述分析，申请人得出了纳米马达集群在近红外下的迁移机制。随着近红外对nms 的照射促进了温度的上升，在未照射的区域之间产生了明显的温差，导致了马兰戈尼对流。因此，分散的纳米马达在对流阻力(fdrag)下被输送到对流中心，在那里它们聚集成团。当近红外光斑移动时，马达随着对流中心移动，因为对流中心已经改变。当近红外关闭时，温度梯度场在液体的自然对流下迅速消失，对流中心也随之消失，因此，由于静电排斥作用和布朗运动，电机之间出现轻微分离。
[0089]
5、金-铜纳米马达的光热疗法
[0090]
在验证了金-铜纳米马达在运动方面的性能后，申请人探讨了它们在光热治疗方面的潜力。近红外辐照诱导的自推进和au-cu纳米马达诱导的等离子体加热相结合，有望产生高效的局部加热，为光热疗法提供强有力的工具。首先，在有hela细胞存在的情况下，观察了近红外照射下的au-cu nms的运动(图5a)。随着近红外(808nm,0.64μwμm-2
)照射时间的增加，在近红外照射区(0.39mm2的椭圆形区域)的纳米马达聚集的数量也在增加。在近红外照射前，通过计数，视野中只有87个纳米马达，然后每隔100秒再次对马达进行计数，计数数分别增加到179、258和318，这表明纳米马达可以实现对目标细胞区域的有效聚集。同时，还测量了加入金-铜nms时的细胞活力(图11)，其中是以3t3细胞来做细胞活性，结果表明，加入金-铜nms后，细胞活力没有明显降低，证明金-铜nms的细胞毒性很小。
[0091]
在照射时间为300秒后，明视场图像显示，只对细胞进行近红外照射并不影响细胞。此外，在没有近红外照射的情况下，只用金-铜纳米马达处理的细胞在形态上没有显示任何明显的变化。在用au-cu纳米马达处理和300s的近红外辐照后，对细胞状况进行了监测，观察到了细胞的变圆(表示凋亡或坏死)。这是由于纳米马达群和光激活的等离子体共振加热的影响，造成了局部加热。在这些条件下，集群中心的温度可以达到45.5℃，这是由红外相机确定的 (图12)。为了确认hela细胞的死活状态，申请人使用了活体染色剂(calcein-am)和死体染色剂(pi)。申请人发现，在仅用au-cu nms添加处理肿瘤细胞的对照实验中，肿瘤细胞根除率只有0.73％，当肿瘤细胞仅在近红外照射(808nm，0.64μwμm-2
)下，肿瘤细胞根除率为1.36％。相反，当加入au-cu nms，然后用近红外照射时，在纳米马达聚集区，肿瘤细胞的根除率达到惊人的71.01％。这些结果与申请人以前的观察一致，即无论是添加au-cunms还是使用近红外照射都不能引起肿瘤细胞的根除(图5e，图5f，图13)，只有当添加 au-cu nms然后用近红外照射时才能引起有效的光热治疗平台。
[0092]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。