一种基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法与流程

一种基于rt-rpa-lfd技术快速检测苹果茎沟病毒的方法
技术领域
1.本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于rt-rpa-lfd技术快速检测苹果茎沟病毒(asgv)的方法。


背景技术：

2.目前，苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus，asgv)能侵染苹果、梨、柑橘、杏、李、樱桃、猕猴桃、百合等园艺作物，可导致多种病毒病。asgv侵染苹果树体后一般不表现症状，但能引起慢性衰退病，严重时可使产量减少45％～73％，导致果实品质下降，对苹果生产造成严重影响。
3.目前已报到的asgv检测方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)、rt-pcr以及定量逆转录pcr(rt-qpcr)等；指示植物法在检测过程中步骤简单易操作,但检测速度较慢,而且灵敏度也较低；elisa法依赖抗体进行检测，检测灵敏性高，由于果树中糖酚含量较高，病毒含量偏低，经常会有假阴性现象；rt-pcr和rt-qpcr是目前常用的病毒检测方法，但需要配备昂贵的pcr仪和荧光定量pcr仪，且相对费时；因此，亟需一种新的苹果asgv的检测方法，以弥补现有技术的缺陷。
4.解决以上问题及缺陷的难度为：pcr和qrt-pcr检测过程中需要以cdna为模板进行扩增，扩增需要借助专业的仪器设备，pcr产物需通过琼脂糖凝胶电泳检测，整个检测过程耗时耗力不便于田间检测。
5.解决以上问题及缺陷的意义为：rt-rpa检测以rna为模板进行恒温扩增，扩增30min后产物可通过侧流层析试纸条直接检测，整个检测过程可在1h内完成，无需昂贵的专业仪器，可用于田间样品检测。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于rt-rpa-lfd技术快速检测苹果茎沟病毒(asgv)的方法，尤其涉及一种基于一步法rt-rpa技术检测苹果茎沟病毒的方法。
7.本发明是这样实现的，一种基于rt-rpa-lfd技术快速检测苹果茎沟病毒(asgv)的方法，所述基于rt-rpa-lfd技术快速检测苹果茎沟病毒(asgv)的方法包括以下步骤：
8.步骤一，引物设计；
9.步骤二，材料采集、rna提取与cdna合成；
10.步骤三，rt-rpa法检测苹果asgv；
11.步骤四，一步法rt-rpa检测苹果asgv。
12.进一步，步骤一中，所述引物设计，包括：在ncbi上下载已报道的序列，设计rpa引物对asgv外壳蛋白基因进行克隆并测序，所测序列用dnaman与ncbi上已报道的相应病毒序列进行比对，明确位于病毒基因组的保守区，在保守区用primer premier 6或者ncbi中blast下的primerblast设计引物；rpa引物和探针位于asgv外壳蛋白基因序列的保守区，引物长度等多个方面与普通pcr引物不同，引物由生工合成。
13.进一步，所述引物和探针序列，包括：asgv检测的核苷酸序列如seq id no：1所示，aspv检测的核苷酸序列如seq id no：2所示，aclsv检测的核苷酸序列如seq id no：3所示，assvd检测的核苷酸序列如seq id no：4所示，adfvd检测的核苷酸序列如seq id no：5所示，apmv检测的核苷酸序列如seq id no：6所示，nfo-asgv的核苷酸序列如seq id no：7所示，nfo-probe的核苷酸序列如seq id no：8所示。
14.进一步，步骤二中，所述材料采集、rna提取与cdna合成，包括：
15.在苹果基地采集苹果叶片，单一感染苹果茎沟病毒asgv试管苗以及脱毒苗为苹果超低温脱毒课题组建立的脱毒苹果“嘎啦”系；
16.使用omega植物rna快速提取试剂盒，获得去除基因组的总rna，进行反转录或-80℃冰箱保存备用；反转录产物cdna置于-20℃保存；使用用于rna提取的相同叶片样品制备粗提rna：用1.5ml管盖夹取获得的约13mg叶片浸入300μl新鲜制备的碱性peg缓冲液中；粗提取物在36～37℃孵育5min，产物直接用于检测或置于冰上短暂保存。
17.进一步，所述反转录体系，包括：
18.depc水2.5μl，rna 2μl，下游引物primer-r 0.5μl，70℃水浴5min；
19.depc水1.75μl，dntps 10mm 2.5μl，m-mlv 5
×
reactionbuffer 2.5μl，m-mlv反转录酶0.5μl，rna酶抑制剂0.25μl，涡旋震荡，充分混匀，42℃孵育60min，95℃保持5min后，终止反应，cdna-20℃保存；
20.进一步，所述碱性peg缓冲液为6％peg 200和20mm naoh。
21.进一步，步骤三中，所述利用rt-rpa法检测苹果asgv，包括：
22.基于twistamp nfo试剂盒进行rt-rpa扩增反应；反应体系中依次加入2.1μlprimer-f、2.1μlprimer-r、1.2μl rpa-probe、29.5μl rehydration buffer、2μlm-mlv反转录酶、1.0μl rna模板、9.6μl ddh2o，共计47.5μl，轻轻涡旋混匀，将混合物加入到rpa反应管中，反应管中含有经真空冷冻干燥处理后的固体反应物，移液器吸打混匀，使冻干状态的固体反应物复水后，在反应管盖上滴加2.5μl 280mm mgoac，盖紧盖子后离心，当mgoac接触反应混合物时，反应开始。
23.先设定rpa反应温度为40℃，孵育时间分别为0、10、20、30和40min；选择最优反应时间后，反应温度分别设定为37、38、39、40和41℃，反应结束后置于冰上终止反应，用milenia genline dipstick assay buffer将产物稀释10倍；取10μl稀释产物点到mghd 1侧流层析试纸条的加样区域，试纸条垂直置于含有100μl hybridetect assay buffer的pcr管中，静置5min；将500ng总rna以10倍梯度进行稀释10-1
～10-7
，分别以稀释的rna为模板进行rt-rpa和rt-pcr扩增，比较rt-rpa和rt-pcr的检测灵敏性。
24.进一步，所述primer-f的浓度为10μm，所述primer-r的浓度为10μm，所述rpa-probe的浓度为10μm。
25.进一步，步骤四中，所述步骤四，利用一步法rt-rpa检测苹果asgv，包括：
26.基于twistamp nfo试剂盒进行一步法rt-rpa扩增反应；反应体系中依次加入2.1μlprimer-f、2.1μl primer-r、1.2μlrpa-probe、29.5μl rehydration buffer、2μl m-mlv反转录酶、2μl粗提rna、8.6μl rnase-free h2o，共计47.5μl，轻轻涡旋混匀，将混合物加入到rpa反应管中，反应管中含有经真空冷冻干燥处理后的固体反应物，移液器吸打混匀，使冻干状态的固体反应物复水后，在反应管盖上滴加2.5μl 280mm mgoac，离心，当mgoac接触反
应混合物时，反应开始；反应结束后置于冰上终止反应，用milenia genline dipstick assay buffer将产物稀释10倍；取10μl稀释产物点到mghd 1侧流层析试纸条的加样区域，试纸条垂直置于含有100μl hybridetect assay buffer的pcr管中，静置5min；后拍照记录。
27.进一步，所述primer-f的浓度为10μm，所述primer-r的浓度为10μm，所述rpa-probe的浓度为10μm。
28.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：目前植物病毒检测扩增方式主要包括变温扩增(rt-pcr、rt-qpcr等)和恒温扩增(lamp、sda等)两种；pcr检测过程中需要专业的变温仪器，且以cdna模板，检测过程繁琐耗时；lamp、sda等恒温检测过程中以cdna为模板，扩增时间60-120min，且需要2-3对引物；rt-rpa以rna为模板在40min，37-42℃下完成扩增检测，相比于其他方法检测更为简单、快速、灵敏，且具有其他检测方法不具备的的特性，非常适合田间检测。
29.(1)优化的rpa反应条件
30.用表1中所列3种病毒常规pcr引物，经rt-pcr检测10株苹果植株叶片的带毒情况。为了明确rpa方法检测asgv的最适反应条件，选择仅asgv阳性样品的cdna为模板进行rpa反应，将rpa反应混合物在40℃分别孵育0、10、20、30和40min，获得的rpa产物经琼脂糖凝胶电泳结果显示，孵育30min获得的目的条带较亮(见图3a，上)，而侧流层析试纸条检测结果显示孵育30min和40min都获得较亮的条带(见图3a，下)。
31.综合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的分析结果，选择30min为最适反应时间。将rpa反应混合物分别在37、38、39、40和41℃的温度下孵育30min，rpa产物经侧流层析试纸条检测结果显示，40℃反应条件下rpa产物的亮度比37℃、38℃、41℃下的明显增强，与39℃相比无明显差异；经琼脂糖凝胶电泳结果显示5个不同温度条件下39℃、40℃检测条带的亮度较亮且40℃更亮于39℃(见图3b)。综合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的分析结果，选择40℃为最适反应温度。rpa反应扩增目的条带大小为267bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示rpa反应获得了预期目的产物，产物测序后的序列在blast上对比，结果显示是asgv外壳蛋白序列，检测一致率达到95％以上，进一步证明获得的产物为目标扩增子。
32.(2)rpa的检测特异性
33.选择3株分别携带asgv、aspv、aclsv的单一感染材料为待检材料，以无病毒苗“嘎啦”系为阴性对照；三感(asgv、aspv、aclsv)“烟富-8”系组培苗为阳性对照。材料的带毒情况用asgv、aspv、aclsv、apmv、assvd、adfvd六种病毒(类病毒)引物分别进行rt-pcr检测，结果表明三株待检材料确为单一感染(见图4a)。用上述材料进行rpa反应，结果表明只有感染asgv的样品及阳性对照检测出267bp的扩增子，不含asgv样品以及阴性对照均未检测到目标扩增子，侧流层析试纸条与琼脂糖凝胶电泳结果一致(见图4b)。
34.(3)rt-rpa与rt-pcr的检测灵敏性比较
35.以asgv检测阳性的苹果叶片总rna(500ng)为模板，以10倍梯度稀释的rna为模板进行rt-rpa和rt-pcr检测的灵敏性比较，琼脂糖凝胶电泳和侧向流试纸条检测结果表明rt-pcr能检测到rna稀释至10-3
的样品(见图5a)，rpa以cdna为模板可以检测到10-4
(见图5b，上)，但是以rna为模板的rt-rpa可以检测到10-5
且条带较深(见图5b，下)，以上结果表明建立的rt-rpa检测方法比rt-pcr检测灵敏100倍。
36.(4)一步法rt-rpa检测苹果asgv
37.rt-rpa在检测过程中需要高浓度的rna，这使得该方法在田间检测过程中受限，为了提高rt-rpa检测效率，利用一种简单、廉价且快速的rna提取方法，直接从苹果叶片上粗提取rna检测苹果asgv。选取10个不同基因型的苹果样品叶片粗提进行rt-rpa检测。结果显示所检样品的rt-pcr和一步法rt-rpa的检测结果一致(见图6)，表明一步法rt-rpa法可以用于苹果asgv样品检测(见图7)。在检测过程中试管苗检测结果较大田检测结果好，大田样品检测过程中阴性样品中检测线处出现浅浅的条带，对于这样的检测结果是否是因为病毒含量太低还是由于其他因素导致，需要再使用rt-pcr法进行复检。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
39.图1是本发明实施例提供的基于rt-rpa-lfd技术快速检测苹果茎沟病毒(asgv)的方法流程图。
40.图2是本发明实施例提供的苹果茎沟病毒(asgv)外壳蛋白中的引物和探针位置示意图。
41.图3是本发明实施例提供的rpa检测asgv反应条件优化示意图；
42.图中：上：琼脂糖凝胶电泳；下：侧流层析试纸条。
43.图4是本发明实施例提供的rpa检测asgv的特异性分析示意图；
44.图中：a：rt-pcr；b：rpa；1：单一感染“asgv”；2：单一感染“aspv”；3：单一感染“aclsv”；
“‑”
无毒阴性对照；“ ”三感“asgv、aspv、aclsv”阳性对照。
45.图5是本发明实施例提供的rt-pcr(a)和rt-rpa(b)检测asgv的灵敏性比较示意图。
46.图6是本发明实施例提供的一步法rt-pra检测苹果asgv的结果示意图；
47.图中：1：单感asgv嘎啦试管苗；2：脱毒嘎啦试管苗；3～10：田间苹果树叶片。
48.图7是本发明实施例提供的一步法rt-pra检测苹果asgv流程示意图。
具体实施方式
49.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
50.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于rt-rpa-lfd技术快速检测苹果茎沟病毒(asgv)的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
51.如图1所示，本发明实施例提供的基于rt-rpa-lfd技术快速检测苹果茎沟病毒(asgv)的方法包括以下步骤：
52.s101，引物设计；
53.s102，材料采集、rna提取与cdna合成；
54.s103，rt-rpa法检测苹果asgv；
55.s104，一步法rt-rpa检测苹果asgv。
56.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
57.本发明公开了一种苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus，asgv)的检测方法，包括：材料采集、rna提取与cdna的反转录合成(reverse transcription,rt)；引物设计；重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)和侧流层析试纸条检测(lateral flow dipstick,lfd)。
58.1、材料与方法
59.1.1材料采集、rna提取与cdna合成
60.2020年5月在宝鸡华圣果业有限责任公司基地和杨凌官村苹果基地采集苹果叶片，单一感染苹果茎沟病毒(asgv)的试管苗以及王乔春老师苹果超低温脱毒课题组获得的脱毒苹果“嘎啦”系。
61.使用omega植物rna快速提取试剂盒，获得去除基因组的总rna，进行反转录或-80℃冰箱保存备用。反转录体系见表1，反转录产物cdna置于-20℃保存。使用用于rna提取的相同叶片样品制备粗提取物：用1.5ml管盖获得的叶片(约13mg)浸入300μl新鲜制备的碱性peg缓冲液(6％peg 200，20mmnaoh)中。粗提取物在36～37℃孵育5min，产物直接用于检测或置于冰上短暂保存。
62.表1反转录体系
[0063][0064]
1.2引物设计
[0065]
在ncbi上下载已报道的序列，设计rpa引物对asgv外壳蛋白基因进行克隆并测序，所测序列用dnaman与ncbi上已报道的相应病毒序列进行比对，明确位于病毒基因组的保守区，在保守区用primer premier 6或者ncbi中blast下的primer blast设计引物。rpa引物和探针位于asgv外壳蛋白基因序列的保守区，引物长度等多个方面与普通pcr引物不同，本发明中rpa引物和探针设计的注意事项见www.twistdx.co.uk网站twistamp反应试剂盒说明附录中的引物设计部分。本发明所用的全部引物序列见表2，引物由生工合成。
rehydration buffer、2μlm-mlv反转录酶、1μlrna模板、9.6μl ddh2o，共计47.5μl，轻轻涡旋混匀，将以上混合物加入到rpa反应管中，反应管中含有经真空冷冻干燥处理后的固体反应物，移液器吸打混匀，使冻干状态的固体反应物复水，然后在反应管盖上滴加2.5μl 280mm mgoac，离心，当mgoac接触反应混合物时，反应开始。先设定rpa反应温度为40℃，孵育时间分别为0、10、20、30和40min；选择最优反应时间后，反应温度分别设定为37、38、39、40和41℃，反应结束后置于冰上终止反应，用milenia genline dipstick assay buffer将产物稀释10倍。取10μl稀释产物点到mghd 1侧流层析试纸条的加样区域，试纸条垂直置于含有100μl hybridetect assay buffer的pcr管中，静置5min。将500ng总rna以10倍梯度进行稀释(10-1
～10-7
)，分别以稀释的rna为模板进行rt-rpa和rt-pcr扩增，比较rt-rpa和rt-pcr的检测灵敏性。
[0073]
2、结果与分析
[0074]
2.1优化的rpa反应条件
[0075]
用表1中所列3种病毒常规pcr引物，经rt-pcr检测10株苹果植株叶片的带毒情况。为了明确rpa方法检测asgv的最适反应条件，选择仅asgv阳性样品的cdna为模板进行rpa反应，将rpa反应混合物在40℃分别孵育0、10、20、30和40min，获得的rpa产物经琼脂糖凝胶电泳结果显示，孵育30min获得的目的条带较亮(见图3a，上)，而侧流层析试纸条检测结果显示孵育30和40min都获得较亮的条带(见图3a，下)。
[0076]
综合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的分析结果，选择30min为最适反应时间。将rpa反应混合物分别在37、38、39、40和41℃的温度下孵育30min，rpa产物经侧流层析试纸条检测结果显示，40℃反应条件下rpa产物的亮度比37℃、38℃、41℃下的明显增强，与39℃相比无明显差异；经琼脂糖凝胶电泳结果显示5个不同温度条件下39℃、40℃检测条带的亮度较亮且40℃更亮于39℃(见图3b)。综合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的分析结果，选择40℃为最适反应温度。rpa反应扩增目的条带大小为267bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示rpa反应获得了预期目的产物，产物测序后的序列在blast上对比，结果显示是asgv外壳蛋白序列，检测一致率达到95％以上，进一步证明获得的产物为目标扩增子。
[0077]
2.2rpa的检测特异性
[0078]
选择3株分别携带asgv、aspv、aclsv的单一感染材料为待检材料，以无病毒苗“嘎啦”系为阴性对照；三感(asgv、aspv、aclsv)“烟富-8”系组培苗为阳性对照。首先，用asgv、aspv、aclsv、apmv、assvd、adfvd六种病毒引物分别进行rt-pcr检测，结果表明三株待检材料确为单一感染(见图4a)。用上述材料进行rpa反应，结果表明只有感染asgv的样品及阳性对检测出267bp的扩增子，不含asgv样品以及阴性对照均未检测到目标扩增子，侧流层析试纸条与琼脂糖凝胶电泳结果一致(见图4b)。
[0079]
2.3rt-rpa与rt-pcr的检测灵敏性比较
[0080]
以asgv检测阳性的苹果叶片总rna(500ng)为模板，以10倍梯度稀释的rna为模板进行rt-rpa和rt-pcr检测的灵敏性比较，琼脂糖凝胶电泳和侧向流试纸条检测结果表明rt-pcr能检测到rna稀释至10-3
的样品(见图5a)，rpa以cdna为模板可以检测到10-4
(见图5b，上)，但是以rna为模板的rt-rpa可以检测到10-5
且条带较深(见图5b，下)，以上结果表明建立的rt-rpa检测方法比rt-pcr检测灵敏100倍。
[0081]
2.4一步法rt-rpa检测苹果asgv
[0082]
rt-rpa在检测过程中需要高浓度的rna,这使得该方法在田间检测过程中受限，为了提高rt-rpa检测效率，利用一种简单、廉价且快速的rna提取方法，直接从苹果叶片上粗提取rna检测苹果asgv。选取10个不同基因型的苹果样品叶片粗提进行rt-rpa检测。结果显示所检样品的rt-pcr和一步法rt-rpa的检测结果一致(见图6)，表明一步法rt-rpa法可以用于苹果asgv样品检测(见图7)。在检测过程中试管苗检测结果较大田检测结果好，大田样品检测过程中阴性样品中检测线处出现浅浅的条带，对于这样的检测结果是否是因为病毒含量太低还是由于其他因素导致，需要再使用rt-pcr法进行复检。
[0083]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。