持续性内切纤维素酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一类酶活提高的持续性内切纤维素酶突变体及其应用。


背景技术：

2.纤维素是地球上分布最广、储量最丰富的可再生资源，其高效的生物转化对实现人类社会的可持续发展具有重要意义。纤维素的完全降解需要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等一系列酶的协同作用，然而水解过程中需要的酶种类多、用量大，导致的酶成本过高等问题仍然是限制纤维素转化技术商业化的一个重要瓶颈。
3.持续性内切纤维素酶(processive endoglucanase)是一类新发现的双功能纤维素水解酶，既具有内切酶的作用特征，又同时具有外切酶的持续性催化降解能力，可以高效的降解纤维素产生小分子寡糖。然而目前持续性内切纤维素酶的种类较少，对结晶纤维素的催化机制并不清楚，因此提高其催化效率仍然是一个巨大的挑战。
4.随着基因工程和蛋白质工程技术的发展，2009年，himmel(chensuschem，2009，2(6):539)等首次提出了酶的活性架构概念，在蛋白质中，决定生物学功能的往往是少数氨基酸残基，这些氨基酸残基在蛋白质空间结构中连续成簇存在并在进化中有较强的关联性，被称为蛋白质功能区，而活性架构区作为最重要的区域，其由与底物相互作用的氨基酸残基组成，与酶的底物特异性和酶活力直接相关，直接参与糖类底物的识别和结合、糖苷键的断裂以及产物的释放。chen等(scientific reports，2018，8(1):2954)为了改善来源于chaetomium thermophilum的内切葡聚糖酶ctendo45的活性及其热稳定性，选择与thielavia terrestris来源的内切葡聚糖酶ttcel45a(相似性64％)进行同源建模，并基于该同源模型选择了位于底物结合位点周围的非催化残基r29、y30、w31和y173进行了突变。其中y30f和y173f突变使使酶对于cmc底物的比活分别提高了1.35倍和1.87倍，对于β-d-葡聚糖的活性也有明显的增强，同时突变体y173f热稳定性显著提高，在80℃和90℃下孵育200min后仍然保留了68.8％和36.2的活力，提升效果显著。同样，wu等(applied microbiology and biotechnology，2018，102(1):249-260)基于来自aspergillus niger的木聚糖酶xynb的酶蛋白结构进行研究，选择了活性架构中的而多个氨基酸进行定点突变或者组合突变，最终筛选得到的组合突变体s41n/t43e相对于野生型酶其活力提升了72％，md模拟分析发现41位天冬酰胺和43位谷氨酸的替换改变了催化中心的氢键网络，从而加强了酶与底物的亲和力。
5.尽管国内外研究者通过蛋白质工程改造技术提高纤维素酶的催化活性的研究已经取得了非常显著的进展。然而目前，由于持续性内切纤维素酶的种类较少，对其催化机制的研究仍然处于摸索阶段，催化活性较高的性能优良的突变酶仍然缺乏，因此，通过蛋白质工程技术改造持续性内切纤维素酶以提高其催化活性，不仅为纤维素原料的工业化生物转化提供新的可行性，同时有助于阐释该类酶的特殊催化机制。


技术实现要素：

6.本发明采用单点突变技术，基于同源建模和分子对接方法，通过选择酶活性架构中的关键氨基酸优化内切纤维素酶的分子结构、提高酶活，获得一类酶活显著提高的持续性内切纤维素酶突变体。本发明所述的持续性内切纤维素酶的突变体具有较高的催化活性，为纤维素原料的工业化生物转化提供新的可行性。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一类内切纤维素酶突变体，在于所述突变体包含氨基酸序列的第70位和/或第235位氨基酸突变，所述内切纤维素酶的氨基酸序列如seq id no：1所示，核苷酸序列如seq id no：2所示。
8.本发明是基于持续性内切纤维素酶eg5c-1进行的优化改造。
9.优选的，本发明所述突变体氨基酸序列第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，优选谷氨酰胺；和/或第235位丝氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸，优选色氨酸。
10.优选的，本发明所述突变体氨基酸序列如seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5所示。
11.作为本发明所述持续性内切纤维素酶突变体的优选实施方式，所述突变体在seq id no：1所示氨基酸序列基础上，将第70位的天冬氨酸置换位谷氨酰胺和第235位的丝氨酸置换位色氨酸。
12.本发明另一目的在于提供编码本发明所述的内切纤维素酶突变体基因以及包含所述内切纤维素酶突变体基因的重组载体及所述重组载体的转化体。
13.进一步的，本发明还提供了所述的重组载体的制备方法，通过人工合成或基因克隆的方法制备本发明所述内切纤维素酶突变体基因，构建表达载体得到重组质粒，转化至入宿主细胞。
14.优选的，所述宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母细胞或枯草芽孢杆菌，优选为大肠杆菌bl21。
15.本发明所述的内切纤维素酶突变体可以用于催化纤维素生物降解。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明采用丙氨酸扫描、饱和突变以及组合突变技术，基于同源建模和分子对接等方式，通过选择特定的氨基酸残基优化了持续性内切纤维素酶的分子结构，提高了酶活，不仅阐释该类酶的特殊催化机制，更重要的为纤维素原料的工业化生物转化提供新的可行性。
附图说明
17.图1.持续性内切纤维素酶eg5c-1及其丙氨酸突变体的sds-page电泳分析。其中m为蛋白marker，泳道1为原始酶eg5c-1发酵液破碎上清，泳道2-21分别为突变体h36a、w40a、y67a、h102a、l104a、n105a、t177a、w178a、q180a、d181a、y202a、t205a、h206a、f209a、k213a、a234a、s235a、w262a、k267a、e269a的发酵液破碎上清，箭头所指处为目的蛋白33.4kda处。
18.图2.持续性内切纤维素酶eg5c-1及其丙氨酸突变体纯化后的sds-page电泳分析。其中m为蛋白marker，泳道1为原始酶eg5c-1的纯化蛋白，泳道2-21分别为突变体h36a、w40a、y67a、h102a、l104a、n105a、t177a、w178a、q180a、d181a、y202a、t205a、h206a、f209a、
k213a、a234a、s235a、w262a、k267a、e269a的纯化蛋白，箭头所指处为目的蛋白33.4kda处。
19.图3.关键氨基酸的丙氨酸突变体对cmc(a)和avicel(b)底物的相对水解活性。
20.图4.d70、t177、a234和s235位点饱和突变体对cmc(a)和avicel(b)底物的相对水解活性。
21.图5.持续性内切纤维素酶eg5c-1及其突变体d70q、s235w、d70q/s235w的最适温度和最适ph以及温度和ph稳定分析。
22.图6.持续性内切纤维素酶eg5c-1及最佳突变体d70q/s235w以再生无定形材料pasc为底物反应30min、60min、120min、180min后反应液中可溶性还原端与不溶性还原端的比列。
23.图7.持续性内切纤维素酶eg5c-1及最佳突变体d70q/s235w以cmc、avicel和pasc为底物的水解产物分析。其中g1：葡萄糖g2：纤维二糖g3：纤维三糖g4：纤维四糖；m为产物标准样品，孔道1、4、7为对照；孔道2、5、8为eg5c-1分别对cmc、avicel、pasc的水解产物；孔道4、6、9为d70q/s235w分别对cmc、avicel、pasc的水解产物。
24.图8.持续性内切纤维素酶eg5c-1及最佳突变体d70q/s235w水解滤纸24h后的效果图。
25.图9.持续性内切纤维素酶eg5c-1及最佳突变体d70q/s235w水解滤纸6h、12h、24h、36h、72h不同时间产生的还原糖的产率。
具体实施方式
26.为了更好地说明本发明地目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例做进一步地详细说明。
27.实施例一 持续性内切纤维素酶eg5c-1酶活性架构中关键氨基酸残基的确定(1)同源建模：根据ncbi和pdb数据库进行blast分析，以b.subtilis 168来源的bscel5a催化结构域的晶体结构(pdb id：3pzt)为模板，其序列与原始酶eg5c-1氨基酸序列seq id no：1相似性为99％。使用discovery studio 3.5(ds 3.5)的modeler程序构建eg5c-1的三维结构，并使用procheck和profile-3d程序对构建的模型进行最终质量的分析。模型的可视化和分析利用discovery studio 2018client和moe2019.01软件进行。
28.(2)分子对接：以b.pumilus的内切葡聚糖酶gh48(pdb id：5cvy)中提取纤维六糖结构，并使用autodock 4.2软件将其对接至已经构建模型eg5c-1的催化中心，通过计算机预测的自由结合能选择最优的配体与受体对接构象。
29.(3)关键氨基酸残基的确定：通过分析纤维六糖与酶催化中心的相互作用，以距离配体周围为条件，将酶活性架构中与纤维六糖产生相互作用的氨基酸选出作为关键氨基酸残基进行突变，h36、w40、y67、d70、h102、l104、n105、e140、t177、w178、q180、d181、y202、t205、h206、f209、k213、e228、a234、s235、w262、k267、e269。
30.实施例二 持续性内切纤维素酶eg5c-1突变体的构建对实施例一确定的关键氨基酸残基进行丙氨酸突变，采用binwu(biotechnology for biofuels，2018，11:20)公开的方法，构建含有seq id no：2的重组质粒，以seq id no：2所示的序列为模板，参照vazyme生物产品及操作手册，利用如下设计的相应突变引物，全质粒扩增出定点突变序列，所用引物如下：
pcr反应体系如下：
pcr程序设定如下：95℃，3min；95℃，15s；60℃，15s；72℃，8min；30个循环；72℃，10min；4℃，hold。
31.全质粒扩增完成后，取2μl pcr产物进行核酸电泳验证。验证结束后，使用dpni消化酶，降解初始模板。
32.消化体系如下：pcr产物
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1μldpni酶
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl10
×
quickcut buffer
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2μl消化程序如下：37℃，30min。
33.消化结束后，将pcr产物采用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞e.colibl21(de3)，并涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素lb琼脂平板上，37℃培养14-16h。经序列测定(由南京tsingke生物公司完成)验证突变结果，获得相应突变体。
34.分别将上述构建的突变体以及原始酶eg5c-1接种至50ml的lb液体培养基中，加入硫酸卡那霉素，使其终浓度为100μg/ml，180rpm/min，37℃过夜培养；以2％的接种量将过夜培养的种子液，接种至新鲜的50ml的lb液体培养基中，180rpm/min，37℃恒温培养至od
600
为0.6～1.0时，加入诱导剂iptg(终浓度0.1mmol l-1
)，25℃诱导表达24h。
35.取诱导表达的发酵液，12000rpm/min离心20min，弃去上清，然后用50mm na2hpo
4-kh2po4(ph 6.0)缓冲重悬菌体，然后超声破碎，进行sds-page电泳检测，浓缩胶浓度为4％，分离胶浓度为12.5％，样品与上样缓冲按照3:1的比例混合，沸水浴反应5min进行上样电泳。电泳仪设定初始电压为120v，当样品移动至分离胶时提高电压至230v，直至样品移动到电泳槽底部时结束电泳。
36.结果如图1所示，持续性内切纤维素酶eg5c-1的分子量为33.4kda，结果显示诱导后突变体在33.4kda处都有明显的条带，表明持续性内切纤维素酶突变体成功诱导表达。
37.由于持续性内切纤维素酶eg5c-1的c端融合了六个组氨酸(his)标签，因此其突变体的c端同样有组氨酸标签。ni柱中的氯化镍可以与含有his标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合，因此使用镍柱分别对目的蛋白进行纯化，通过增加咪唑浓度达到蛋白洗脱的目的，从而得到纯化的目的蛋白，发酵诱导表达的菌液经离心破碎后，所得上清液经0.22μm滤膜过滤后即得粗酶液，然后使用(ge healthcare,fairfield,usa)镍柱进行目的蛋白的分离纯化。步骤如下：
a.用0.22μm滤膜过滤的蒸馏水以2ml/min的流速冲洗镍柱，洗去填料保护液同时压实填料；b.用至少5倍体积的buffer a(20mm tris-hcl，ph 7.5)以2ml/min的流速冲洗镍柱，平衡镍柱内ph；c.用注射器将预处理的蛋白样品打入进样环中，流速为0.5ml/min，收集样品的穿透峰蛋白；d.再次用至少5-10倍体积的buffer a(20mm tris-hcl，ph 7.5)以2ml/min的流速冲洗镍柱，平衡镍柱内ph，直至无蛋白被洗脱出来；e.使用梯度洗脱法，每个梯度用至少5倍体积的buffer b(20mm tris-hcl，500mm咪唑，ph7.5)以2ml/min的流速冲洗镍柱，收集每个梯度的吸收峰蛋白，直至无蛋白被洗脱出来；f.用至少5-10倍体积的已过滤蒸馏水以2ml/min的流速冲洗镍柱，直至纯化仪显示无离子曲线和蛋白吸收峰；g.加入20％乙醇保存镍柱；h.使用ge公司预装的脱盐柱desalting columns，以50mm na2hpo
4-kh2po4(ph 6.0)缓冲置换含有咪唑的buffer，去除蛋白液中的咪唑；i.将收集得到的不同梯度的额蛋白溶液进行sds-page验证，即得不同突变体得纯化蛋白。
38.结果如图2所示，持续性内切纤维素酶eg5c-1的分子量为33.4kda，结果显示诱导后突变体在33.4kda处都有明显的条带且没有其他杂蛋白的条带，表明持续性内切纤维素酶突变体纯化成功。
39.实施例三 持续性内切纤维素酶最优突变体的筛选程序将实施例二中获得的23个突变体，以羧甲基纤维素钠cmc和微晶纤维素avicel为底物测定酶活变化，关键氨基酸的丙氨酸突变对cmc(a)和avicel(b)底物的相对水解活性结果如图3所示。图3显示大多数残基经丙氨酸替代后对于cmc和avicel底物的活性均显著下降。其中，芳香族氨基酸和极性氨基酸残基的突变尤其显著。d70、t177和s235位点对于丙氨酸突变的影响较小，因此，选择d70、t177、a234和s235四个位点作为进一步改造的热点残基。
40.参照实施例二的方法，对四个位点进行定点饱和突变。设计的相应突变引物如下所示：所示：
nnn对应不同氨基酸的密码子如下：tgt(cys)、gat(asp)、gaa(glu)、ttt(phe)、ggc(gly)、cat(his)、att(ile)、aaa(lys)、ctg(leu)、atg(met)、aat(asn)、ccg(pro)、cag(gln)、cgt(arg)、tca(ser)、aca(thr)、gtt(val)、tgg(trp)、tat(tyr)。
41.上述饱和突变对cmc(a)和avicel(b)底物的相对水解活性结果如图4所示。图4显示，d70位点饱和突变后仅d70q(谷氨酰胺取代70位氨基酸残基)、突变体的酶活显著提升，s235位点饱和突变后仅s235w(色氨酸取代235位氨基酸残基)突变体酶活显著提升。t177和a234位点饱和突变显示对于cmc和avicel的酶活相比于原始酶eg5c-1并没有显著的变化。
42.进一步以d70q和s235w分别为两个位点的单点突变最佳突变体进行组合突变研究，最终筛选得到最优突变体d70q/s235w。
43.实施例四 持续性内切纤维素酶突变体的酶学性质分析持续性内切纤维素酶突变体水解活力测定方法酶活力单位定义：一个酶活力单位即为在60℃，ph 6.0条件下，每分钟由底物产1mmol还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。
44.(1)内切纤维素酶(endo-glucanase)：准确称取1g羧甲基纤维素钠(cmc-na)溶于100ml的na2hpo
4-kh2po4缓冲中(50mm，ph 6.0)，搅拌混匀，准确吸取1.5ml加入试管作为酶反应底物，60℃预热5min后加入已适当稀释的蛋白酶液0.5ml，放入60℃的水浴摇床反应10min，加入3ml的dns试剂，沸水浴反应5min后迅速冷却至室温，以灭火的酶反应液为对照测定540nm波长下的吸光度值。
45.(2)外切纤维素酶(exo-glucanase)：准确称取10g微晶纤维素(avicel)溶于100ml的na2hpo
4-kh2po4缓冲中(50mm，ph 6.0)，搅拌混匀，准确吸取1.5ml加入试管作为酶反应底物，60℃预热5min后加入已适当稀释的蛋白酶液0.5ml，放入60℃的水浴摇床反应30min，离心吸取上清液，加入3ml的dns试剂，沸水浴反应5min后迅速冷却至室温，以灭火的酶反应液为对照测定540nm波长下的吸光度值。
46.比酶活x＝(还原糖含量/180/10(30))/n其中：x
---
比酶活，u/mg180
----------
还原糖从毫克转换为微摩尔10(30)
--
反应时间n
-------------
反应蛋白含量，mg1.最适反应温度和温度稳定性。
47.将实施例三得到的纯化酶液按照一定浓度稀释并吸取500ml加入装有1.5ml cmc底物的试管中，并分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下反应10min，反应结束后加入3ml dns溶液煮沸5min，测定其酶活。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制酶活随着温度变化的曲线。
48.为了测定突变体和原始酶的温度稳定性，将纯化得到的酶液分别放入30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴锅中孵育2h，然后按照测定内切纤维素酶活力的方式测定其剩余的酶活力。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制不同孵育条件下酶活的变化曲线。
49.结果如图5所示，持续性内切纤维素酶eg5c-1与突变体d70q、s235w、d70q/s235w的最适反应温度均为60℃，当温度在30℃-60℃时，持续性内切纤维素酶eg5c-1及突变体的酶
活逐渐升高，当温度高于60℃时，eg5c-1及其突变体的酶活均显著下降。持续性内切纤维素酶eg5c-1及其突变体d70q、s235w、d70q/s235w在低于50℃条件下保温2h，仍然保留了80％以上的酶活力，而在高于60℃条件下保温2h后，持续性内切纤维素酶eg5c-1的酶活力保留了约70％，而其突变体却仍然保留了80％以上的活力，表明突变体酶的温度稳定性相比于原始酶有所提高。
50.2.最适ph和ph稳定性配制不同ph的缓冲和底物：柠檬酸-柠檬酸钠(ph 3.0-6.0)、na2hpo
4-kh2po4(ph 6.0-8.0)、甘氨酸-氢氧化钠(ph 8.0-9.0)，分别配制不同ph条件下的1％的cmc底物反应液。
51.将实施例三得到的纯化得到的酶液按照一定的浓度稀释并吸取500ml加入装有1.5ml不同ph缓冲配制的cmc底物反应液中，60℃反应10min，反应结束后加入3ml dns溶液煮沸5min，测定其酶活。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制酶活随着底物ph变化而变化的曲线。
52.将纯化得到的酶液用不同ph的缓冲进行稀释，置于冰上4℃孵育2h，然后按照测定内切纤维素酶活力的方式测定其酶活力。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制不同孵育条件下酶活的变化曲线。
53.结果如图5所示，持续性内切纤维素酶eg5c-1与突变体d70q、s235w、d70q/s235w的最适反应ph均为ph 6.0，持续性内切纤维素酶eg5c-1及其突变体在ph6.0条件下，具有最高水解活性，随着ph的升高或降低，其酶活性均减少。持续性内切纤维素酶eg5c-1与突变体d70q、s235w、d70q/s235w在ph5.0-9.0之间的稳定性较为平稳，在各个条件下孵育2h后均能保留70％以上的酶活力，而在ph3.0-5.0之间，持续性内切纤维素酶及其突变体的稳定性均下降，在各个ph条件下，eg5c-1保留的酶活力相比于突变体d70q、s235w、d70q/s235w都较低，表明突变体的ph稳定性得到了提高。
54.实施例五 持续性内切纤维素酶最佳突变体d70q/s235w的持续性能力分析持续性内切纤维素酶的持续性是通过检测降解再生无定形纤维素(pasc)所产生的可溶性还原端与不可溶性还原端的比例确定的。测定步骤如下：(1)将实施例五得到的纯化酶液按照一定的浓度稀释并吸取500ml加入装有1.5ml 1％的pasc底物(w/v)的试管中混匀；(2)试管于45℃下反应30min、60min、120min、180min后取出，立即用沸水煮沸5min，终止反应；(3)将反应物离心，12000rpm，10min；(4)将沉淀用na2hpo
4-kh2po4缓冲反复清洗离心至少三遍，然后加入等上清液体积的缓冲重悬沉淀，即为不溶性还原糖；(5)根据dns法分别测定上清液与沉淀中还原糖的含量并计算不同反应时间段的还原端比例。
55.结果如图6显示，反应时间由0.5h延长至3h时，原始酶eg5c-1所产生的可溶性与不溶性还原糖的比例由2.25增加至3.31，与此同时，最佳突变体d70q/s235w酶解pasc产生的可溶性还原糖和不溶性还原糖的比值随着时间的延长而不断增加，从0.5h比值为2.5，3h后增加至3.45。结果说明，最佳突变体d70q/s235w在内切酶和外切酶活性提高的同时其持续性能力也得到了加强。
56.实施例六 持续性内切纤维素酶最佳突变体d70q/s235w的水解产物分析根据实施例获得纯化酶液体，以cmc、avicel、pasc为底物进行产物水解分析，具体步骤如下：(1)吸取适当稀释的纯酶液与底物cmc、avicel、pasc，按照1:1的比例混合均匀；(2)反应液置于45℃下反应6h后，煮沸反应液使酶灭活；(3)将反应液离心，12000rpm，10min，弃去沉淀收集上清酶解产物；(4)水解产物中加入预冷的乙醇，过夜沉淀除去杂质后烘干；(5)加入适当的蒸馏水使产物溶解，即得水解产物。
57.薄层层析法(tlc)检测(1)将薄板置于120℃烘箱(除去挥发性杂质和水分，提高分离效率)中1h活化并置于干燥器中备用；(2)配制展开剂(约60ml)：按正丁醇：乙酸：水＝3:2:1混合，实验前加入展层缸中约15-30min，防止边缘效应；(3)点样：标准品点样量为1μl(葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖)，各个样品点样量为2μl；(4)将展层缸置于通风橱中，室温下展层两次，每次约1.5h；(5)样品显色：配制显色剂(约20ml)：按浓硫酸：乙醇＝1:9混合，将显色剂均匀的喷洒在薄板表面并用吹风机烘干，然后放入120℃烘箱中显色5min；(6)根据标准品判断eg5c-1与各个突变体的水解产物情况。
58.如图7所示，持续性内切纤维素酶eg5c-1与最佳突变体d70q/s235w对于cmc、avicel和pasc底物的水解产物主要以纤维二糖和纤维三糖为主。
59.实施例七 持续性内切纤维素酶最佳突变体对滤纸的水解性能的分析将2.5％(w/v)的烘干滤纸与na2hpo
4-kh2po4(50mm，ph6.0)混合，分别加入40μg/ml的持续性内切纤维素酶eg5c-1及其最佳突变体d70q/s235w酶液，将混合物于200rpm，45℃下振荡24h，以无酶液的混合液做对照。水解效果如图8所示。同时使用dns法测定了持续性内切纤维素酶水解滤纸6h、12h、24h、36h、72h后所产生的还原糖的含量。结果如图9所示，原始酶eg5c-1与突变体d70q/s235w初始阶段产生的还原糖含量相似，随着反应时间的延长，72h后突变体d70q/s235w产生的还原糖比原始酶eg5c-1高31.2％左右，这表明突变体d70q/s235w水解滤纸的效率更高。