一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.番茄是全世界范围内重要的蔬菜和水果作物，同时也被广泛应用于生物和非生物胁迫科学研究。在番茄生产过程中，病毒病是为害番茄的主要病害之一，病毒病具有种类多、变异快、防控难的特点，快速准确鉴定出病毒种类对番茄病毒病的防控具有重要作用。
3.番茄黄化斑驳相关病毒 (tomato yellow mottle-associated virus, tymav)是近几年在番茄上刚发现的新病毒，造成番茄叶片卷曲、皱缩、黄化斑驳等症状，影响了番茄的生长及产量 （xu et al. journal of virology, 2017, 91 (11):e00173-17）。tymav是胞质弹状病毒属病毒，其基因组为13000 nt左右的负义单链rna。除了可以侵染番茄，tymav的其他寄主目前暂无报道，tymav的传播方式也未知。对tymav的检测方式仅限于rt-pcr，无抗原抗体相关检测方法。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是为tymav的检测提供一种新选择。
5.本发明还提供了一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体，该抗体以tymav的核衣壳n基因的编码蛋白为抗原制备得到。
6.进一步的，所述tymav的核衣壳n基因序列的编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2第213～412位所示。
7.具体的，tymav的核衣壳n基因的核苷酸序列如seq id no.1第637～1236位或seq id no.5所示。
8.本发明还提供了所述抗体的制备方法，包括如下步骤：将seq id no.1第637～1236位或seq id no.5所示核苷酸克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌，收集表达蛋白；以表达蛋白为免疫原对模式动物三次免疫注射，在第一次免疫一个月后开始收集血清，分离纯化得到抗体。
9.本发明还提供采用所述抗体检测番茄黄化斑驳相关病毒的方法，包括如下步骤：包括如下步骤： 样品制备，sds-page电泳，转膜至硝酸纤维素膜上，封闭，一抗反应，二抗反应，显色，检测。
10.具体的，在一抗反应中，在封闭液中按照1︰2000稀释比例加入抗体。
11.其中，在二抗反应中，按1︰10000比例稀释比例加入羊抗兔hrp二抗。
12.本发明的有益效果：本发明克隆了番茄黄化斑驳相关病毒的核衣壳n基因序列，并对序列进行了分析和实验，获得了可用于制备番茄黄化斑驳相关病毒检测抗体的抗原序列。并进一步纯化核衣壳蛋白并制备核衣壳蛋白多克隆抗体，利用该抗体可以快速准确检
测番茄及其他感病样品中的番茄黄化斑驳相关病毒，为番茄黄化斑驳相关病毒的监测、诊断及致病机制研究具有重要的应用价值。
附图说明
13.图1、n蛋白二级结构分析。
14.图2、n蛋白亲疏水性、抗原性分析。
15.图3 、蛋白小量纯化表达检测结果，m为marker，1为未诱导对照（bl21），2和3为iptg诱导的pet30a-n（213～412）。
16.图4、蛋白大量表达的检测结果；m：marker；1：超声后全菌；2：超声后上清；3：超声后沉淀。
17.图5、蛋白纯化检测结果；m：marker；1：纯化蛋白稀释5倍；2：纯化蛋白稀释10倍。
18.图6、蛋白纯化检测结果；m：marker；1：蛋白原样；2：流穿；3：15mm 咪唑洗脱；4：60mm 咪唑洗脱；5～7：500mm 咪唑洗脱。
19.图7、抗体效价检测。
20.图8、实际样品检测结果；s1、s2、s3：样品1、2、3；h：健康对照；α-tymavn代表抗体。
具体实施方式
21.下述实施例中用到的主要试剂、遗传资源和设备jm109大肠杆菌感受态细胞：上海唯地生物技术有限公司 （dl1020）bl21大肠杆菌感受态细胞：上海唯地生物技术有限公司 （ec1002）taq酶：宝生物工程（大连）有限公司 （r004q）pmd19-t载体：北京全式金生物技术股份有限公司 (ct301-01)质粒提取试剂盒：北京全式金生物技术股份有限公司 （em101-01）基因合成：北京华大蛋白质研发中心有限公司引物合成：生工生物工程（上海）股份有限公司镍柱：ge healthcare （17531806）基因测序：北京擎科生物科技有限公司实施例1 tymav n基因全长克隆提取tymav侵染病样总rna，反转录成cdna。设计pcr引物扩增n基因全长，pcr引物为：n-f（seq id no.3）atgaacactttggcattacaattgt和n-r（seq id no.4）ttactcgttgggtgtagcagcat。扩增体系：cdna 3 μl，n-f 1 μl，n-r 1 μl，rtaq mix 10 μl，ddh2o 5 μl，总体积 20 μl。扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，32个循环；72℃ 8 min，4℃ 1 min。扩增产物连接到pmd-19t载体上，测序得到n基因全长序列为1239bp（seq id no.1），其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2。
22.seq id no.1：n基因全长序列atgaacactttggcattacaattgtcaaacaccgattacgatgacctagcttcgataacagtagcgcctggaggaagcaatgttgcgtggaatgatgaagacgtgtcgtctattaggcgatattctctagctgtgatggattctccgaccatggttttgcacggaggttatgtgtttgagagcctaaacaacaacactcgagttgacacgaatgtattaatgagtacggttcatctggctgccaatttgcgagacccagataacatcactcagtgcctactgatgacaccacccca
mm）诱导，37℃，200 rpm培养2 h。取1 ml诱导的菌液，12000 rpm，离心1 min，弃上清，沉淀用50~100 μl 10 mm tris-hcl（ph8.0）溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与缓冲液等体积的 2
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loading buffer，100℃煮5 min，12% sds-page电泳检测。检测结果见图3，经过iptg诱导的样品可以表达出预期大小的蛋白 (2和3泳道)，未经iptg诱导则没有目的蛋白表达，说明该蛋白可以成功诱导表达。
25.进一步的进行了蛋白大量表达的检测。具体如下：接100 μl活化的菌液到 5 ml相应抗性 lb液体培养基中，37℃培养过夜，200 rpm。将培养的菌液转接到250 ml相应抗性 lb液体培养基中，37℃，200 rpm，培养至od=0.6～0.8，iptg（0.5 mm）16℃诱导过夜。收菌：8000 rpm，离心6 min。弃上清。超声破菌：菌体用20～30 ml 10 mm tris-hcl（ph 8.0）溶液吹散，超声波破碎（500 w，180次，每次5 s，间隔5 s）。 电泳确定表达形式：取100 μl超声后的菌悬液，12000 rpm，离心10 min，取50 μl上清至另一ep管，上清去除干净后沉淀用50 μl 10 mm tris-hcl（ph 8.0）溶液吹散。12% sds-page电泳检测。检测结果见图4，结果显示目的蛋白绝大部分在沉淀中，上清中只有少部分。
26.进一步的，对蛋白大量表达后收集的沉淀进行纯化。具体如下：（1）20~30 ml 10 mm tris-hcl（ph8.0）溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10 min。
27.（2）12000 rpm，离心10 min，上清转入另一管中保存。
28.（3）20~30 ml 10 mm tris-hcl（ph8.0）溶液重悬沉淀，静置10 min。
29.（4）12000 rpm，离心10min，弃上清。
30.（5）重复（3）、（4）一次。
31.（6）先加入少量的10 mm tris-hcl（ph8.0）溶液重悬沉淀，再加5~10 ml含8 m尿素的10 mm tris-hcl（ph8.0）溶液溶解蛋白。
32.（7）12000 rpm，离心10 min，收集上清，取50 μl进行12% 的sds-page电泳检测。检测结果见图5，结果显示加入8m尿素可以将目的蛋白从沉淀中溶解出来。
33.用8m尿素是为了将目的蛋白溶解在上清中以便于下一步继续纯化；如果目的蛋白绝大部分在上清中，那加8m尿素步骤则可省略。继续纯化是因为上一步获得的上清不仅有目的蛋白，还有很多其他杂蛋白，所以需要利用镍柱将目的蛋白特异吸附分离纯化，最终获得仅包含目的蛋白的溶液。进一步纯化的具体如下：（1）用去离子水洗镍柱（ni sepharose 6 fast flow，ge healthcare），至ph 7.0。
34.（2）挂镍，至ph 2~3。
35.（3）去离子水洗柱至ph 7.0。
36.（4）10mm tris-hcl（ph 8.0）溶液平衡镍柱，约100 ml。
37.（5）含8m尿素、0.5 m氯化钠的10 mm tris-hcl（ph 8.0）溶液平衡镍柱，约50 ml。
38.（6）稀释样品上样。样品中含0.5 m氯化钠、8 m尿素、10 mm tris-hcl（ph 8.0）。
39.（7）上样结束后，用含8m尿素、0.5 m氯化钠的10 mm tris-hcl（ph 8.0）溶液洗柱。
40.（8）分别用含15 mm咪唑、60 mm咪唑、500 mm咪唑的10 mm tris-hcl（ph 8.0）（含8 m尿素、0.5 m氯化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰。
41.（9）12% sds-page电泳检测蛋白纯化效果。检测结果见图6，结果显示60 mm及500 mm咪唑洗脱效果较好，杂蛋白较少，量也比较充足，可以用于抗体制备。
buffer，充分混匀，沸水浴10 min，离心，12000 rpm，10 min，取上清。
56.2)sds-page凝胶电泳：取上清20 μl，进行sds-page电泳，120v，2h左右，待溴酚蓝跑出后停止。
57.3)转膜：电转移方法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上（200 ma，60 min）。
58.4)封闭：将膜浸入含有5%脱脂奶粉的1
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tbst缓冲液中，37℃孵育2h。
59.5)一抗反应：封闭结束后在封闭液中按照1︰2000稀释比例加入tymav-n抗体，37℃孵育1h。
60.6)二抗反应：一抗反应结束后，将膜在1
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tbst缓冲液中漂洗3次，每次10 min。然后按1:10000比例加入羊抗兔hrp二抗，37℃孵育40 min。
61.7)ecl显色：二抗反应结束后，将膜在1
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tbst缓冲液中漂洗3次，每次10 min。加入化学发光底物，通过化学发光仪查看结果。
62.结果见图8，发病样品中可以检测到大小为46 kda n蛋白的条带，而健康对照则没有条带，说明所制备的抗体可以成功用于tymav病毒的检测。