一种具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺的制作方法

1.本发明属于生物活性成分提取领域，尤其涉及一种具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺。


背景技术：

2.硫酸软骨素是糖胺聚糖的一种，属于酸性粘多糖，分子量一般为20-50kda，被广泛应用于膳食补充剂领域，对关节养护、消除炎症等方面有着显著的疗效。
3.目前，硫酸软骨素的市售产品主要为硫酸软骨素钠盐(市场占到95％以上)，各国药典收录的剂型均为硫酸软骨素钠。硫酸软骨素钠仅对骨关节炎有一定的抑制功效，因为绝大多数产品仅有钠元素(钠含量为7％左右)，同时，用户在服用产品后，血钠含量会有波动，对高血压人群造成一定的身体负担，对于新型软骨素原料开发应用也是市场努力寻找的热点方向。随着大健康产业的兴起，人们对更健康的、更高效、更安全的营养成分提出了迫切的需求。
4.针对这一迫切需求，现有技术已经开发出了硫酸软骨素钙盐，但通过现有技术所生产的钙并非实质意义上的“螯合钙”，而是由离子键组成的普通化合物，具有较低的生物利用度和钙吸收率，也不具备螯合结构所带来的协同效应。螯合机制“螯”意为螃蟹钳子的意思，像钳子一样夹住金属原子或离子。螯合是由中心离子和配位原子键合而成的具有环状结构的配合物的过程。当金属离子与含有两个或者更多的给电子团的物质结合，从而形成一个或更多的环，生成物被称为螯合物。硫酸软骨素螯合钙是通过配位离子键或者吸附作用将硫酸软骨素与钙离子结合而形成的螯合物。二者的结合与硫酸软骨素的糖环上含有未缩合的末端羧基和乙酰氨基密不可分，经过螯合作用后的钙离子被“钝化”，便可一同进行转运，同时在一定条件下又可以将钙离子释放出来。
5.硫酸软骨素钙盐是比较新颖的软骨素原料，但是目前所检索到的制备技术中均未对产品的钙进行螯合处理(如以下两篇专利)，导致钙元素没有得到“钝化”，大部分硫酸软骨素钙处于非螯合态，钙离子在产品中是游离状态。从而容易在吸收转运过程中出现流失，出现钙吸收率降低的情况。同时，处于螯合态的硫酸软骨素钙具有特殊的协同效应，具有抗骨关节炎同时抗骨质疏松的强化功效，而未经螯合处理的硫酸软骨素钙不具备此功效。再次，现有技术所制备的硫酸软骨素钙未做深度的的杂质去除工序，导致其杂质残留多，如硫酸盐、氯化物、重金属残留、杂蛋白等杂质超标，硫酸软骨素的有效含量低。
6.中国专利cn102816809“一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺”，公开了一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺，包括加水蒸煮、碱解提取、酶解、吸附和洗涤、脱色、沉淀和干燥等工艺步骤，可从动物软骨中直接直接提取制备出硫酸软骨素钙，但是工艺中需要添加双氧水进行脱色，双氧水不可避免会残留在终产品中，存在食品安全风险。同时，工艺中未对产品进行特殊的螯合处理，所以产品中硫酸软骨素钙处于非螯合态。
7.中国专利cn 105218703 a“一种硫酸软骨素钙生产工艺”，公开了一种硫酸软骨素钙的制备工艺，包括氢氧化钙溶液浸泡溶胀软骨、酶解、超滤、沉淀、脱水、干燥等工艺步骤，
可从动物软骨中提取出硫酸软骨素钙，但专利未对种产品进行综合指标的考量，如产品的纯度、杂质含量等等，未采用一个系统的方法对产品指标进行综合呈现，如usp、cp等国际检测手段。同时，产品中硫酸软骨素钙处于非螯合态。
8.从现有技术出发，制备的硫酸软骨素钙的制备工艺中没有特殊的螯合步骤，硫酸软骨素分子与钙离子之间未形成稳定的螯合态(即配位键)，钙原子在产品溶液中属于游离状态，在产品的吸收利用过程中，容易从分子中丢失，在吸收过程中吸收率较低，同时没有硫酸软骨螯合钙所特有的协同增效效应，不具备抗骨质疏松的功效。


技术实现要素：

9.针对上述情况，本发明提供的目的是一种具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺，改变硫酸软骨素分子与钙原子之间的化学键，使生成稳定的配位键，从而使产品从非螯合态转化成螯合态，在钙吸收利用方面以及产品在抗骨质疏松方面具有优异的效果。
10.为实现以上目的，本发明采用以下的技术方案：
11.一种具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺,包括以下步骤：
12.s1覆水破骨、s2螯合反应1、s3脱除游离钙、s4固液分离、s5螯合反应2、s6酶解处理、s7脱除游离钙、s8料液洗涤、s9真空浓缩、s10干燥包装；
13.所述s2螯合反应1包括以下步骤：在45-55℃和常压条件下，使用强还原剂和弱碱，以及高频超声波处理条件下，使硫酸软骨素分子与钙离子达到初步的结合，达到形成部分螯合态的效果。
14.进一步的，上述具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺，所述s5螯合反应2包括以下步骤：通过高压流体纳米匀质机的作用，在350-400bar的压力下，使硫酸软骨素与钙离子进行充分螯合。
15.进一步的，上述具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺，所述s8料液洗涤包括以下步骤：通过膜组件的截留作用，使用纯水对料液进行彻底的洗涤，将料液本身所残留的硫酸盐、氯化物、重金属、杂蛋白进行彻底洗涤。
16.进一步的，上述具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺，所述膜组件的截留分子量为5000da-50000da。
17.进一步的，上述具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺，步骤s1覆水破骨中的原料为猪或者牛软骨。
18.进一步的，上述具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺，包括以下步骤：
19.s1覆水破骨：将干的猪、牛软骨投入5-5.5倍体积的热水中，保持体系温度为45-55℃，加入水量1％的醋酸钙晶体，覆水3-4h，充分覆水后，软骨的体积充分膨胀，将膨胀后的骨粒分离得到湿软骨与分离液，将湿软骨进行破碎，破碎至5mm左右，过5mm筛板；
20.s2螯合反应1：将破碎后的骨粒与分离液合并，加入料液量0.005％-0.05％氢氧化钙，调节ph为10-11，加入料液量0.004％-0.005％的硼氢化钙，将反应体系加热至45-55℃，进行持续搅拌6-7h，同时开启可调频率的超声波(调节频率为20000hz)，对反应料液进行间断超声处理，超声频次为每1小时超声处理25-30min；
21.s3脱除游离钙：在搅拌条件下，向反应体系中通入高压二氧化碳气体(压力保持为1bar)，此时料液变白，检测料液电导率，当料液电导率降低为9.5-10.5ms/cm，继续通入二氧化碳气体，观察料液电导率在此区间内稳定不变时，停止通气，检测料液ph为6.5-7.5；
22.s4固液分离：启动碟式离心机(5000r/m)，使混合体系进入离心机，通过分离后得到微浑状态的料液与骨渣，将骨渣装袋运出。将料液进一步升温至50-55℃，向料液中添加料液量2％醋酸钙晶体，充分溶解，确认料液ph为6.5-7.5；
23.s5螯合反应2：启动高压流体纳米匀质机，调节压力至350-400bar，使料液缓慢通过均质机，进行循环高压处理2-2.5h，过程中保持物料温度为50-55℃，待料液状态由微浑状态变为较清状态，检测料液电导率为20-22ms/cm，停止螯合反应；
24.s6酶解处理：向料液中加入中性蛋白酶，添加比例为料液量的0.01％，搅拌酶解0.5h，酶解过程中观察料液澄清度，酶解结束后，将料液升温至85-90℃，保持0.5h；
25.s7脱除游离钙：将料液降温至55-60℃，再次向料液中通入高压二氧化碳(1bar)，料液变成微浑状态，检测料液电导率为19.5-20.5ms/cm，继续通入二氧化碳，当料液电导率在此区间内维持不变后，停止通气；
26.s8料液洗涤：启动高速碟式离心机(10000r/m)，使料液通过离心机，得到澄清的反应料液，检测420nm澄清度为0.05-0.10，开启超滤设备，使料液通过超滤膜，超滤过程中不断向料液中加入纯化水(水温55-60℃)，对料液进行洗涤，过程中保持料液总体积始终保持不变。过程中不断监测浓液的电导率数值，当料液电导率数值维持在15-16ms/cm并保持不变，停止加水，纯化水总加水量为原料液体积的3-3.5倍；
27.s9真空浓缩：将洗涤后的料液进行真空浓缩，真空度为-0.090-0.095mpa，浓缩比例为5-6倍；
28.s10干燥包装：启动真空隧道干燥机，将浓缩液均匀分布在干燥机履带表面，干燥温度为45-50℃，干燥后物料进行粉碎，粉碎颗粒度达至100目以下，进行包装。
29.进一步的，上述具有抗骨质疏松功能的硫酸软骨素螯合钙的制备工艺制备获得的硫酸软骨素螯合钙。
30.进一步的，上述硫酸软骨素螯合钙的螯合率大于95％。
31.进一步的，上述硫酸软骨素螯合钙在制备预防/治疗骨质疏松的药物/保健品中的应用。
32.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
33.本技术提供一种特殊的螯合处理技术，从而改变硫酸软骨素分子与钙原子之间的化学键，使生成稳定的配位键，从而使产品从非螯合态转化成螯合态。通过产品中钙螯合率的测定及对比，验证螯合钙的含量差异。同时，通过动物试验动物试验模型验证了螯合钙在钙吸收利用方面以及产品在抗骨质疏松方面所表现出来的功效差异。
34.本技术还提供一种特殊的硫酸软骨素分离纯化的技术，一方面缩短了传统硫酸软骨素的生产工艺步骤，进一步减少了酸、碱、盐类物质的加入以及生物反应时间，从而减少了杂质的引入量和产品生产过程中大分子物质的反应变化的时间，从而进一步保留了产品的自然活性。另一方面，采用了新型的分离方式和深度精制的技术，使产品中的杂质去除的更加彻底，产品中所含的硫酸盐、氯化物、杂蛋白、重金属得到了最大程度的去除。
35.具体表现在：
36.螯合反应1：在45-55℃和常压条件下，使用强还原剂和弱碱的条件(ph为10-12)，以及高频超声波处理条件下，通过6-7h的反应使硫酸软骨素分子与钙离子达到初步的结合，达到形成部分螯合态的效果。通过二氧化碳的充分反应，去除反应体系中未螯合的游离钙离子。
37.螯合反应2：通过高压流体纳米匀质机的作用，在350-400bar的压力下，使硫酸软骨素与钙离子进行充分螯合，在此条件下，硫酸软骨素与钙离子能够快速高效螯合。在后续的过程中使用二氧化碳气体再次去除未结合的游离钙离子。
38.料液洗涤：通过膜组件的截留作用，使用纯水对料液进行彻底的洗涤，将料液本身所残留的硫酸盐、氯化物、重金属、杂蛋白进行彻底洗涤(以上各成分分子量＜5000da)。从而达到对物料充分提纯的作用。
附图说明
39.附图1为本发明的工艺流程图；
40.附图2为检测例中的非螯合态硫酸软骨素钙、硫酸软骨素钠和硫酸软骨素螯合钙的ftir光谱。
具体实施方式
41.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
42.本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场渠道购买获得的常规试剂产品。
43.实施例1
44.制备例
45.应用实例1：czb20092507，制备流程如附图1所示
46.s1覆水破骨：将1000kg干牛软骨投入5倍体积的热水中，保持体系温度为37℃，加入水量1％的醋酸钙晶体，覆水4h，充分覆水后，软骨的体积充分膨胀，将膨胀后的骨粒分离得到软骨与分离液，将软骨进行破碎，破碎至5mm左右，过5mm筛板。
47.s2螯合反应1：将破碎后的骨粒与s1中的分离液合并，加入料液量0.045％氢氧化钙，调节ph为10，加入料液量0.0045％的硼氢化钙，将反应体系加热至50℃，进行持续搅拌6.5h，同时开启可调频率的超声波(调节频率为20000hz)，对反应料液进行间断超声处理，超声频次为每1小时超声处理30min。
48.s3脱除游离钙：反应结束后，在搅拌条件下，向反应体系中通入高压二氧化碳气体(压力保持为1bar)，此时料液变白，检测料液电导率，当料液电导率降低为10ms/cm，继续通入二氧化碳气体，观察料液电导率在此区间内稳定不变时，停止通气，检测料液ph为7.0。
49.s4固液分离：启动碟式离心机(5000r/m)，使混合体系进入离心机，通过分离后得到微浑状态的料液与骨渣，将骨渣装袋运出。将料液进一步升温至53℃，向料液中添加料液量2％醋酸钙晶体，充分溶解，确认料液ph为7.5。
50.s5螯合反应2：启动高压流体纳米匀质机，调节压力至360bar，使料液缓慢通过均
质机，进行循环高压处理2.5h，过程中保持物料温度为54℃，待料液状态由微浑状态变为较清状态，检测料液电导率为20-22ms/cm，停止螯合反应。
51.s6酶解处理：向料液中加入中性蛋白酶，添加比例为料液量的0.01％，搅拌酶解0.5h，酶解过程中观察料液澄清度，酶解结束后，将料液升温至88℃，保持0.5h。
52.s7脱除游离钙：将料液降温至57℃，再次向料液中通入高压二氧化碳(1bar)，料液变成微浑状态，检测料液电导率为20.4ms/cm，继续通入二氧化碳，当料液电导率再此区间内维持不变后，停止通气。
53.s8料液洗涤：启动高速碟式离心机(10000r/m)，使料液通过离心机，得到澄清的反应料液，检测420nm澄清度为0.09，开启超滤设备，使料液通过超滤设备，超滤过程中不断向料液中加入纯化水(水温58℃)，对料液进行循环洗涤，过程中保持料液总体积始终保持不变。过程中不断监测料液的浓液的电导率数值，当料液电导率数值维持在15.6ms/cm冰保持不变，停止加水，纯化水总加水量为原料液的3.3倍。
54.s9真空浓缩：将洗涤后的料液进行真空浓缩，真空度为-0.094mpa，浓缩比例为6倍。
55.s10干燥包装：启动真空隧道干燥机，将浓缩液均匀分布在干燥机履带表面，干燥温度为50摄氏度，干燥后物料进行粉碎，粉碎颗粒度达至100目以下，最终得成品262.35kg。
56.检测产品cpc法含量为99.78％，钙含量为8.8％，钙螯合率为95.33％。
57.实施例2
58.制备例
59.应用实例2：czp20102002，制备流程如附图1所示。
60.s1覆水破骨：将1000kg干猪软骨投入5.5倍体积的热水中，保持体系温度为36℃，加入水量1％的醋酸钙晶体，覆水4h，充分覆水后，软骨的体积充分膨胀，将膨胀后的骨粒分离得到软骨与分离液，将软骨进行破碎，破碎至5mm左右，过5mm筛板。
61.s2螯合反应1：将破碎后的骨粒与s1中的分离液合并，加入料液量0.045％氢氧化钙，调节ph为10，加入料液量0.0045％的硼氢化钙，将反应体系加热至50℃，进行持续搅拌6.5h，同时开启可调频率的超声波(调节频率为20000hz)，对反应料液进行间断超声处理，超声频次为每1小时超声处理30min。
62.s3脱除游离钙：反应结束后，在搅拌条件下，向反应体系中通入高压二氧化碳气体(压力保持为1bar)，此时料液变白，检测料液电导率，当料液电导率降低为10ms/cm，继续通入二氧化碳气体，观察料液电导率在此区间内稳定不变时，停止通气，检测料液ph为7.5。
63.s4固液分离：启动碟式离心机(5000r/m)，使混合体系进入离心机，通过分离后得到微浑状态的料液与骨渣，将骨渣装袋运出。将料液进一步升温至53℃，向料液中添加料液量2％醋酸钙晶体，充分溶解，确认料液ph为7.5。
64.s5螯合反应2：启动高压流体纳米匀质机，调节压力至360bar，使料液缓慢通过均质机，进行循环高压处理2.5h，过程中保持物料温度为55℃，待料液状态由微浑状态变为较清状态，检测料液电导率为20-22ms/cm，停止螯合反应。
65.s6酶解处理：向料液中加入中性蛋白酶，添加比例为料液量的0.01％，搅拌酶解0.5h，酶解过程中观察料液澄清度，酶解结束后，将料液升温至86℃，保持0.5h。
66.s7脱除游离钙：将料液降温至57℃，再次向料液中通入高压二氧化碳(1bar)，料液
变成微浑状态，检测料液电导率为20.8ms/cm，继续通入二氧化碳，当料液电导率再此区间内维持不变后，停止通气。
67.s8料液洗涤：启动高速碟式离心机(10000r/m)，使料液通过离心机，得到澄清的反应料液，检测420nm澄清度为0.08；开启超滤设备，使料液通过超滤设备，超滤过程中不断向料液中加入纯化水(水温57℃)，对料液进行循环洗涤，过程中保持料液总体积始终保持不变。过程中不断监测料液的浓液的电导率数值，当料液电导率数值维持在15.4ms/cm冰保持不变，停止加水，纯化水总加水量为原料液的3.5倍。
68.s9真空浓缩：将洗涤后的料液进行真空浓缩，真空度为-0.095mpa，浓缩比例为5.5倍。
69.s10干燥包装：启动真空隧道干燥机，将浓缩液均匀分布在干燥机履带表面，干燥温度为50摄氏度，干燥后物料进行粉碎，粉碎颗粒度达至100目以下，最终得成品297.01kg。
70.检测产品cpc法含量为100.13％，钙含量为8.4％，钙螯合率96.18％。
71.实施例3
72.3检验例：将不同工艺所制得得硫酸软骨素钙进行综合检测，包括cpc含量、杂蛋白含量、硫酸盐含量、氯化物含量、重金属含量、钙、钠、进行检测，得出以下检测数据，其中检验依据如下：
73.3.1usp药典：cpc含量、杂蛋白含量、硫酸盐含量、氯化物含量
74.3.2gb5009.268-2016：砷、铅、汞、镉、钙、钠
75.3.3钙螯合率检测方法：
76.将3mg/ml的硫酸软骨素钙样品与5mm充分混合，37℃保温反应10min，再加入20mm的磷酸盐缓冲液(ph 7.8)于37℃反应30min，反应结束后4000g离心20min以去除溶液中的磷酸钙沉淀。此时溶液中的钙离子则因为与硫酸软骨素钙相结合的原因故而能保持溶解状态而不被磷酸根沉淀。取上清后利用火焰原子分光光度法测定上清液中的钙离子含量。每个实验重复三个平行，并设定不加试样的实验组为空白实验。
77.螯合率按下式进行计算：
78.螯合率(％)＝(w1-w2)/w1
×
100％。
79.式中w1为1ml样品反应体系中的总钙含量(mg)，w2为上清液中游离钙的含量(mg)。结果如下表1所示：
80.表1不同工艺条件下所制得得硫酸软骨素钙综合检测结果
[0081][0082]
3.4硫酸软骨素螯合钙红外图谱差异
[0083]
本研究利用ftir光谱法，进一步明确硫酸软骨素螯合钙中ca2 和cs的结合位点，研究了硫酸软骨素螯合钙和非螯合态cs-ca的ftir，结果如附图2所示，非螯合态硫酸软骨
素钙和硫酸软骨素钠的波谱结果相似，而非螯合态硫酸软骨素钙和硫酸软骨素螯合钙的光谱存在一些差异。具体而言，在非螯合态硫酸软骨素钙和硫酸软骨素螯合钙的光谱中可以观察到3400cm-1附近的宽光谱带，其主要归因于
–
oh和n
–
h的伸缩振动，2930cm-1处的谱带归因于c
–
h伸缩振动，1560cm-1处的峰代表n
–
h带，表明存在
–
nh
–
c＝o。有研究表明未离子化的羧基吸收带在1680-1740cm-1处，而离子化的羧基吸收带为1550-1620cm-1。在本研究中，未电离的羧基吸收带在1739cm-1处，而硫酸软骨素螯合钙在1739cm-1处的吸收带消失，并加强1647cm-1处的吸收带，这表明ca2 结合使软骨素分子的羧基电离。硫酸软骨素螯合钙光谱中1560cm-1吸收峰消失，这表明ca2 的螯合影响n-h基团的伸缩。此外，硫酸软骨素分子中的不对称-so2伸缩吸收带在1255cm-1处，对称-so2伸缩吸收带在1155cm-1，而硫酸软骨素螯合钙中的这些吸收带分别转移到1253cm-1和1153cm-1。以上结果表明钙离子与硫酸软骨素之间的螯合键引起硫软骨素分子结构性的变化，而非螯合状态的硫酸软骨素钙分子中并没有显著的变化。
[0084]
实施例4
[0085]
动物实验例
[0086]
4动物试验模型设计及结果对比
[0087]
4.1去卵巢后骨质疏松大鼠模型的建立与验证
[0088]
本研究通过去卵巢手术建立骨质疏松症模型，50只雌性大鼠(体重210-230g)在接收到动物房后先进行为期7天的适应性喂养，大鼠自由饮用蒸馏水，喂养标准饲料，动物房维持在23
±
1℃的恒温环境中，每天12h光照，12h避光，模拟昼夜交替。
[0089]
去卵巢后骨质疏松大鼠模型建模的具体操作如下：
[0090]
1)大鼠按25mg/kg体重的计量腹腔注射戊巴比妥钠(37℃超声溶解)麻醉。
[0091]
2)彻底麻醉后的大鼠腹部向上，四肢以及口部用棉线固定在大鼠手术板上，将大鼠腹部中心偏下位置约100cm2大小的区域用小动物剃毛机仔细剔除鼠毛后用75％酒精擦拭干净剪除的鼠毛，避免手术中鼠毛进入伤口引发感染。
[0092]
3)剃毛后的部位沿腹部中线用11号手术刀轻轻划开鼠皮以及腹部肌肉层，暴露出肠道及内脏；为方便缝合，伤口尽量小，以1-2cm为宜。两侧鼠皮分别用止血钳夹好，止血钳的柄部放置于桌面上，依靠止血钳的重力将鼠皮始终保持分开的状态。
[0093]
4)用镊子将肠道轻轻拨到一旁，找到明显区别于肠道的输卵管，沿输卵管找到位于输卵管末端的卵巢(粉红色、扁卵圆形，表面呈凸隆状)，再用止血钳夹紧连接于卵巢下方的输卵管，用眼科手术剪刀将止血钳上部的卵巢以及输卵管全部剪掉。止血钳保持夹紧状态1-2min，防止出血。另一侧的卵巢做同样处理。
[0094]
5)手术完成后，将输卵管和肠道恢复原位，轻轻在腹腔中喷洒2万单位的青霉素，注意避免针头碰到腹内器官及组织。
[0095]
6)先缝合大鼠腹部的肌肉层(连续缝合法，每两针打一个结)，再取下鼠皮上的止血钳并缝合大鼠的外层皮肤(连续缝合法，每一针均需打结，务必缝合牢固，避免伤口开线)，完成缝合后在伤口上喷洒2万单位的青霉素，将大鼠单笼单只腹部向上放置在不锈钢鼠笼中，注意动物房空调温度应稍调高，以27-28℃左右最为适宜。
[0096]
7)24小时内注意观察大鼠苏醒后身体状态，健康状况良好的转移到普通大鼠笼中，3天内每只大鼠每天腹腔注射2万单位的青霉素。如有大鼠伤口缝合处被撕咬开，应及时
麻醉后再缝合牢固。
[0097]
8)大鼠手术后每隔3天尾部静脉取血，用雌二醇试剂盒检测血清中雌二醇含量，与正常小鼠相比雌二醇含量呈极显著降低(p《0.01)的判断为造模成功。
[0098]
注：全手术过程应在洁净环境中进行，手术中用到的所有器械均经高温高压灭菌处理，金属器械在使用过程中经常用火焰干热法灭菌，降低大鼠感染的风险。
[0099]
4.2动物实验分组与实验设计
[0100]
选取造模成功的去卵巢大鼠(共40只)，随机分为4组(每组10只)，并开始灌胃受试物，持续灌胃12周。分组以及处理如下：
[0101]
1)阴性对照组(ovx，n＝10)按7ml/kg体重灌服生理盐水；
[0102]
2)caco3对照组(caco3，n＝10)灌胃碳酸钙；
[0103]
3)硫酸软骨素螯合钙组(czb-ca，n＝10)灌胃czb20092507产品(实施例1)；
[0104]
4)硫酸软骨素螯合钙组(czp-ca，n＝10)灌胃czb20102002产品(实施例2)；
[0105]
5)市售硫酸软骨素钙盐(市售非螯合cs-ca，n＝10)灌胃市售非螯合态硫酸软骨素钙产品；
[0106]
注意：硫酸软骨素螯合钙每日推荐用量为1200mg/d，折合人体的摄入量为20mg/kg.bw，大鼠使用该剂量的10倍量，即200mg/kg.bw，含钙约为16mg/kg.bw，碳酸钙同样采用相同的钙剂量，即16mg/kg.bw进行灌胃。
[0107]
4.3钙代谢实验样品的收集以及相关指标分析
[0108]
按上所述进行动物实验，每只大鼠连续灌胃12周，记录体重变化，在动物实验的最后三天将大鼠置于不锈钢代谢笼中，进行钙代谢实验，单笼单只，每24h分别收集各笼大鼠的尿液以及粪便，并记录摄食量。尿液和粪便分别消化后用原子吸收法测定钙含量，并计算钙表观吸收率、钙储留率。钙代谢实验通过尾部取血采集各大鼠的血清，并利用血清钙含量测定试剂盒对样本的钙含量进行测定。
[0109]
钙代谢实验相关指标的计算按标准的钙代谢实验流程进行。相关计算公式下表2所示：
[0110]
表2钙代谢实验相关指标公式
[0111]
相关指标公式钙吸收率钙吸收率(％)＝(吸收钙/摄入钙)
×
100％钙储留率钙储留率(％)＝(储留钙/摄入钙)
×
100％
[0112]
相关结果如下表3所示：
[0113]
表3钙代谢实验相关结果：
[0114][0115]
注：同一列中不同的英文小写字母表示两组数据有显著性差异(p《0.05)。
[0116]
钙表观吸收率以及钙储留率是钙代谢实验中最为重要的两个关键指标，分别表示样品中的钙离子可被生物肠道吸收的程度与样品中的钙离子可在生物体重储留的程度。对钙生物利用度的结果进行分析，可以观察到无论是钙表观吸收率还是钙储留率的结果均表明：灌胃普通碳酸钙、以及非螯合态的硫酸软骨素钙与阴性对照组无显著区别(p》0.05)；结果证明口服非螯合态的钙制剂并不能促进去卵巢大鼠对钙离子的吸收利用度。而灌胃螯合钙组的钙表观吸收率以及钙储留率均呈现出明显的上升，证明与非螯合态的硫酸软骨素钙相比，硫酸软骨素螯合钙具有更好的促钙吸收活性。
[0117]
4.4血清中骨转化相关生化指标的分析
[0118]
骨骼的健康可受多种生化代谢过程因素影响，其中对骨骼健康具有最直接影响的即为骨吸收和骨重建这两个生化过程。骨吸收的作用是破除骨骼中的原有细胞与结构的过程，而骨形成的作用则是在骨骼中现有的细胞及结构基础上形成新的骨骼结构。骨代谢起到了对自身骨骼的一种“除旧建新”的功效，对于骨健康的保持十分关键。但是该进程中任何的代谢紊乱均会导致严重的后果，引发如骨质疏松等代谢疾病。骨质疏松患者最常见的代谢异常就是高骨转化率，即骨形成与骨吸收的速度均高于正常水平，机体吸收的钙离子难以在骨中沉积且难以于体内储留。
[0119]
骨钙素(ocn)、骨源碱性磷酸酶(balp)、i型胶原蛋白碳端肽(ctx-i)以及抗酒石酸酸性磷酸酶异构体5b(trap5b)为骨转化过程中最重要的四个生化标志物。其中ocn以及balp是反应骨形成活跃情况的重要生化标志物。trap5b是反应破骨细胞活性的重要标志物，ctx-i则是骨吸收过程中释放出的特征肽段，两者是反应骨吸收作用活跃情况的标志生化物质。上述生化标志物检测结果如表4所示：
[0120]
表4四种生化标志物检测结果
[0121][0122]
注：同一列中不同的英文小写字母表示两组数据有显著性差异(p《0.05)。
[0123]
对表4中的结果进行分析可知，去卵巢后骨质疏松大鼠的这四个生化指标均显著升高(p《0.05)，反应出骨质疏松大鼠体内异常增高的骨转化率，这也与去卵巢后雌性大鼠的代谢紊乱的现象相符合。在灌胃碳酸钙或市售非螯合态硫酸软骨素钙的实验组中高骨转化率的水平依然没有得到抑制，这说明二者并不能起到抑制高骨转化率的作用。而在灌胃硫酸软骨素螯合钙的实验组中，与ovx组相比，四个生化指标均显著降低，表明骨转化率受到明显抑制。
[0124]
4.5骨骼生化指标的分析
[0125]
本研究通过切片染色技术观察了各组在骨骼组织结构上的变化。本研究对其他反应骨骼健康程度的重要指标，如骨矿物质密度、骨钙含量、骨机械强度等生化指标进行了研究与分析。结果如表5所示
[0126]
表5骨密度等指标结果
[0127] 骨钙含量(mg/g)骨密度(g/cm2)骨最大载荷(n)ovx210.20
±
10.20b0.17
±
0.05b90.92
±
2.19bcaco3211.02
±
11.80b0.18
±
0.03b92.38
±
3.87b非螯合cs-ca210.45
±
10.42b0.20
±
0.08b102.15
±
1.43b螯合钙czb-ca242.88
±
10.60a0.29
±
0.05c158.35
±
4.56a螯合钙czp-ca245.05
±
11.59a0.33
±
0.04a162.17
±
4.21c[0128]
注：同一列中不同的英文小写字母表示两组数据有显著性差异(p《0.05)。
[0129]
骨钙含量、骨矿物质密度以及骨机械强度是用于反应骨骼健康程度的最重要的三个生化指标。针对表中的数据分析可以发现在ovx组中这三个指标均显著下降(p《0.05)，表现出较为明显的骨质疏松症状。尤其是骨机械强度由为90.92
±
2.19n，表明去卵巢手术对雌性大鼠造成了严重的骨质疏松症。灌胃碳酸钙以及非螯合态硫酸软骨素钙的实验组恢复效果并不明显，各指标与ovx组相比均无显著性差异(p》0.05)。灌胃硫酸软骨素螯合钙样品组大鼠的骨骼健康程度明显得到了恢复，实验证明硫酸软骨素螯合钙具有显著的增加骨密度性能以及抗骨质疏松的功能。
[0130]
由实施例1-4的结果可知：本技术提供一种特殊的螯合处理技术，从而改变硫酸软骨素分子与钙原子之间的化学键，使生成稳定的配位键，从而使产品从非螯合态转化成螯合态。通过产品中钙螯合率的测定及对比，验证螯合钙的含量差异。同时，通过动物试验动物试验模型验证了螯合钙在钙吸收利用方面以及产品在抗骨质疏松方面所表现出来的功效差异。
[0131]
本技术还提供一种特殊的硫酸软骨素分离纯化的技术，一方面缩短了传统硫酸软骨素的生产工艺步骤，进一步减少了酸、碱、盐类物质的加入以及生物反应时间，从而减少了杂质的引入量和产品生产过程中大分子物质的反应变化的时间，从而进一步保留了产品的自然活性。另一方面，采用了新型的分离方式和深度精制的技术，使产品中的杂质去除的更加彻底，产品中所含的硫酸盐、氯化物、杂蛋白、重金属得到了最大程度的去除。
[0132]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有
变化囊括在本发明内。
[0133]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。