一种基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法与流程

一种基于qrt-pcr检测方法快速测算桃品种需冷量的方法
技术领域
1.本发明属于植物基因检测技术领域，具体涉及一种基于qrt-pcr检测方法快速测算桃品种需冷量的方法。


背景技术：

2.桃(学名：amygdalus persica l.)是蔷薇科、桃属植物，多年生中型乔木。原产于我国陕西、甘肃、西藏等西部冷凉地区，需要一定的需冷量完成休眠才能进入雌雄性细胞分化阶段。需冷量是桃及其他落叶果树的重要农艺性状是其低温环境中生理休眠及其解除的量化指标，其还直接关系到果树栽培成败和分布区域。
3.在落叶果树生产中，开花整齐对于果实稳产来说是必不可少的，但这在广西这样的亚热带地区很难达到。这种情况是由芽内休眠解除无规律造成的，其原因就是品种本身的需冷量在该地区不能得到满足。因此需冷量是现今广西桃产业发展面临的瓶颈，低需冷量桃品种的选育和推广是未来广西桃产业发展的方向。
4.要进行低需冷量品种的引种和选育，首先要对品种的需冷量进行测定，而传统的测定方法(枝条水培法)耗时长，效率低，无法在育种早期进行需冷量的有效筛选。如专利公开号cn 104041368a公开了快速测定桃需冷量的方法，该方法在桃落叶后，每隔4～5天采桃当年生枝条，将枝条在室内插入水中，每隔3天剪一次桃枝条下部露出新鲜色，每隔三天换水一次,以叶芽露顶50％和花芽顶部绽开50％代表其花芽和叶芽满足其自身需冷量，该方法需要耗时15天测定桃需冷量，测定时间长，费工费时，容易耽误桃的引种栽培。如果有更加快捷有效的方法进行品种需冷量的划分，则会大大提高品种需冷量引种或育种筛选的效率。
5.实时荧光定量pcr技术(qrt-pcr)是目前应用最广泛的用于研究基因表达模式的分子生物学检测方法之一，它能检测极低含量的mrna以及基因在不同样品间细微的表达差异变化，具有高度灵敏性、特异性和稳定性的优点。因此qrt-pcr在基因定量表达中广泛的应用。
6.有很多研究结果都认为ppdam5基因有可能控制桃芽内休眠解除，那么就可以利用该ppdam5基因来进行需冷量的筛选。若能建立ppdam5基因表达量和品种需冷量间的对应关系，则今后在引种和育种初期，就能快速筛选所需的桃品种的需冷量，大大加快引种效率和育种进程，可以尽快获得优质的低需冷量桃品种。


技术实现要素：

7.针对以上问题，本发明提供一种基于qrt-pcr检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，以已确定需冷量品种作为标准物，选取桃品种落叶时叶片进行ppdam5基因的表达量测定，将获得的桃品种叶片的ppdam5基因相对表达量与其需冷量进行等级划分匹配，可以判定待测桃品种的需冷量的大致范围。本发明通过以下技术方案实现：
8.一种基于qrt-pcr检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，包括以下步骤：
9.(一)ppdam5基因相对表达量的检测：
10.(1)rna提取：取已知需冷量的桃品种的落叶时期的未落叶片，提取rna；
11.(2)反转录cdna合成：将提取得的rna反转录合成第一链cdna；
12.(3)qrt-pcr检测：以合成的cdna为模板，分别以内参基因actin基因和目的基因ppdam5基因的引物对作为引物进行qrt-pcr扩增，绘制扩增溶解曲线，获得内参基因actin基因和目的基因ppdam5基因的表达量，计算获得目的基因ppdam5基因的相对表达量；
13.(二)ppdam5基因相对表达量与需冷量的等级划分：
14.将步骤(一)中获得的已知需冷量的桃品种叶片的ppdam5基因相对表达量与其需冷量建立需冷等级划分模型，如下：
[0015][0016]
(三)待测桃品种的快速测算：
[0017]
将需冷量待测的桃树新品种进行步骤(一)ppdam5基因相对表达量的检测，然后根据步骤(二)建立的需冷等级划分模型进行匹配，初步快速测算待测桃品种的需冷量。
[0018]
进一步地，步骤(3)中，所述目的基因ppdam5基因的上、下游引物分别为ppdam5-f和ppdam5-r；ppdam5-f和ppdam5-r引物序列分别为：
[0019]
ppdam5-f：5
’‑
atctccaccacctgcaacagt-3’；
[0020]
ppdam5-r：5
’‑
cttcttaacgccccagtttgag-3’。
[0021]
进一步地，步骤(3)中，所述内参基因actin基因的上、下游引物分别为actin-f和actin-r；actin-f和actin-r引物序列分别为：
[0022]
actin-f：5
’‑
cagatcatgtttgagaccttcaatgt-3’；
[0023]
actin-r：5
’‑
catcaccagagtccagcacaat-3’。
[0024]
进一步地，步骤(3)中，所述qrt-pcr扩增的扩增体系以20μl计，包括以下组分：rnase-free ddh2o 8μl，chamq universal sybr qpcr master mix 10μl，cdna模板1μl，上、下游引物各0.5μl；
[0025]
进一步地，步骤(3)中，所述qrt-pcr扩增的扩增条件包括以下步骤：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸20s；所述预变性-变性-退火-延伸进行40个循环。
[0026]
进一步地，步骤(2)中，所述反转录合成cdna的反应体系以8μl计，包括以下组分：rnase-free ddh2o 5μl，4
×
gdna wiper mix 2μl，rna模板1μl；
[0027]
进一步地，步骤(2)中，所述反转录合成cdna的反应条件为：50℃15min，85℃5s。
[0028]
进一步地，步骤(1)中，所述rna的提取方法为采用rnaprep pure多糖多酚植物总rna提取试剂盒法提取rna。
[0029]
进一步地，步骤(1)中，所述已知需冷量的桃品种为秋蜜桃1号、鹰嘴蜜桃、霞脆、银河、金霞油蟠、紫金红2号、湖景蜜露、金霞早油蟠、霞晖5号和霞晖8号中的任一种。
[0030]
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
[0031]
1、本发明建立了基于qrt-pcr检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，以已确定需冷量品种作为标准物，选取桃品种落叶时期的未落叶片进行ppdam5基因进行表达量的测定，然后将获得的已知需冷量的桃品种叶片的ppdam5基因相对表达量与其需冷量建立需冷等级划分模型，再然后将需冷量待测的桃树新品种进行ppdam5基因相对表达量的检测，根据建立的需冷等级划分模型进行匹配，初步快速测算待测桃品种的需冷量。本发明的测算方法操作简单、省时省力、效率高，对于快速判断引进品种的需冷量具有很强的实用性，且对于今后桃品种的育种中进行需冷量快速筛选也提供了较为高效的方法。
[0032]
2、本发明对已知需冷量的桃品种叶片的ppdam5基因相对表达量与其需冷量进行等级划分匹配，根据已知的桃品种的需冷量的数据以及由qrt-pcr检测方法得出的ppdam5基因相对表达量的数据客观的、合理的进行等级划分匹配，有效的提高了桃品种种植的工作效率。通过对待测桃品种叶片的ppdam5基因相对表达量的测定，可以迅速判断该品种的需冷量，从而可以判断在需冷量是否满足的地区进行种植，有效促进桃品种的选育和推广。
[0033]
3、本发明通过采用qrt-pcr检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，具有实时、准确快速、可靠的得出ppdam5基因相对表达量，从而根据等级划分匹配的关系迅速的、客观的测算出待测桃品种的需冷量范围，qrt-pcr检测方法的检测时长为3-4h，检测时间短，而传统方法枝条水培法测定时长为15天左右，测定时间长，本发明方法避免了传统方法枝条水培法测定过程的主观因素多、易受外界环境影响以及测定过程时间长的问题，有效的提高了桃品种的引种和选育的工作效率。
附图说明
[0034]
图1为部分rna提取电泳图。
[0035]
图2为actin基因荧光定量扩增溶解曲线图。
[0036]
图3为ppdam5基因荧光定量扩增溶解曲线图。
[0037]
图4为ppdam5基因相对表达量图。
[0038]
图5为ppdam5基因相对表达量与需冷量对应图。
具体实施方式
[0039]
下面通过实施例对本发明做进一步地详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。
[0040]
本发明所用的主要仪器设备有晶弘bcd-220etck冰箱(格力)，rxz型智能人工气候箱rxm-258a(宁波江南仪器厂)，荧光定量pcr仪qtowere2.2(德国analytikjena)，全自动化学发光/荧光图像分析系统5200multi(上海天能)，台式冷冻离心机5430r(德国eppendorf)，涡旋混合器xh-c(江苏省金坛市荣华实验器材有限公司)，单人净化工作台3w-cj-1d(苏州净化设备有限公司)，酶标仪epoch(biotek)，电泳仪dycp-31dn(北京六一生物
科技有限公司)，移液器(德国eppendorf)。以上仪器均可从市场上购买。
[0041]
本发明所用的主要生化试剂有rnaprep pure多糖多酚植物总rna提取试剂盒(天根)，hiscript ii qrt supermix for qpcr( gdna wiper)(诺维赞)，chamq universal sybr qpcr master mix(诺维赞)，biowest agarose西班牙琼脂糖(biowest)，5
×
tbe buffer(南宁国拓)，超纯水(南宁国拓)，glycerol dna loading buffer(南宁国拓)。以上试剂均可从市场上购买。
[0042]
实施例1
[0043]
本发明所用各品种桃树均采集于本研究团队的引种资源圃(广西柳州市融水县同练乡高山果树试验站和南宁市武鸣县里建基地)。
[0044]
一、传统的枝条水培法对需冷量的测定
[0045]
按照传统的枝条水培法测定秋蜜桃1号、鹰嘴蜜桃、霞脆、银河、金霞油蟠、紫金红2号、湖景蜜露、金霞早油蟠、霞晖5号和霞晖8号的需冷量，测定条件为：当以上桃品种完全落叶后，取枝条放入冰箱(处理温度为4℃)中；之后分别于192h、288h、384h、480h、576h、672h和768h将各品种枝条从冰箱中取出，取出的枝条剪成2～4个芽的小段，每次共取20个饱满芽，剪去少许顶梢，插入盛有清水的玻璃杯中，玻璃杯内装水高度保持在2cm左右；再将玻璃杯置于光照培养箱中培养，温度25℃，光照10h/d，每隔2d换水1次，并剪去基部2mm左右。培养15d后统计萌芽率，当萌芽率≥50％时，表示该品种已满足需冷量。以上品种的需冷量测定结果如下表所示：
[0046]
表1枝条水培法测定的各桃品种需冷量
[0047][0048]
二、本发明的基于qrt-pcr检测方法快速测算桃品种需冷量的方法
[0049]
具体操作如下：
[0050]
(一)ppdam5基因相对表达量的检测：
[0051]
(1)rna提取：分别取秋蜜桃1号、鹰嘴蜜桃、霞脆、银河、金霞油蟠、紫金红2号、湖景蜜露、金霞早油蟠、霞晖5号和霞晖8号品种落叶时期的未落叶片，采用rnaprep pure多糖多酚植物总rna提取试剂盒法提取rna；
[0052]
rna提取的具体步骤为：
[0053]
①
取50-100mg叶片，加入液氮迅速研磨成粉末，加入500μl裂解液sl立即涡旋剧烈
震荡混匀，以12,000rpm(～13,400
×
g)的速度离心2min，取上清液；
[0054]
②
将上清液转移至过滤柱cs上(过滤柱cs放在收集管中)，以12,000rpm(～13,400
×
g)的速度离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；
[0055]
③
缓慢加入0.4倍上清液体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中，以12,000rpm(～13,400
×
g)的速度离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；
[0056]
④
在步骤
③
吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，以12,000rpm(～13,400
×
g)的速度离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；
[0057]
⑤
配制dnase i工作液：取10μl dnase i储存液放入新的rnase-free离心管中，加入70μl rdd溶液，轻柔混匀；然后在步骤
④
吸附柱cr3中加入80μl配制得的dnase i工作液，室温放置15min；
[0058]
⑥
在步骤
⑤
吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，以12,000rpm(～13,400
×
g)的速度离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；
[0059]
⑦
在步骤
⑥
吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，以12,000rpm(～13,400
×
g)的速度离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；
[0060]
⑧
重复步骤
⑦
，将所得溶液以12,000rpm(～13,400
×
g)的速度离心2min，将吸附柱cr3放入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl rnase-free ddh2o，室温放置2min，然后离心1min，得到rna溶液，保存备用，图1为部分rna提取电泳图；
[0061]
(2)反转录cdna合成：将提取得的rna反转录合成第一链cdna；
[0062]
①
将rna模板、5
×
hiscript ii qrt supermix ii和rnase-free ddh2o溶解并置于冰上备用；
[0063]
②
配置以下反应体系：
[0064][0065]
③
用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min；
[0066]
④
在上一步反应管中加入2μl 5
×
hiscript ii qrt supermix ii，轻轻混匀；
[0067]
⑤
50℃15min，85℃5s，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却备用；
[0068]
(3)qrt-pcr检测：以合成的cdna为模板，分别以内参基因actin基因和目的基因ppdam5基因的引物对作为引物进行qrt-pcr扩增；
[0069]
表2引物序列信息
[0070][0071]
①
配制反应混合液：
[0072][0073]
②
pcr循环条件：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸20s，40循环，每个样品重复3次；
[0074]
根据检测结果绘制扩增溶解曲线，图2为actin基因荧光定量扩增溶解曲线，图3为ppdam5基因荧光定量扩增溶解曲线，获得内参基因actin基因和目的基因ppdam5基因的表达量，图2-3说明了引物和qrt-pcr的条件建立合适，结果可信可靠，计算获得目的基因ppdam5基因的相对表达量，图4为各桃品种的ppdam5基因的相对表达量图，图5为各桃品种的ppdam5基因的相对表达量与需冷量的对应图；
[0075]
(二)ppdam5基因相对表达量与需冷量的等级划分：
[0076]
将步骤(一)中获得的已知需冷量的桃品种叶片的ppdam5基因相对表达量与其需冷量建立需冷等级划分模型，如下表3：
[0077]
表3桃品种的ppdam5基因相对表达量与需冷量的等级关系
[0078][0079]
(三)待测桃品种的快速测算
[0080]
以湖景蜜露为实验验证品种(待测品种)，采用上述步骤(一)ppdam5基因相对表达量的检测方法测定湖景蜜露的ppdam5基因相对表达量为16.41，根据步骤(二)建立的需冷
等级划分模型进行匹配，其属于需冷六级，初步快速测算其需冷量时间在600-750h之间，则在后续种植推广过程中需要选择满足该需冷时间的地区。
[0081]
根据前面的一、传统的枝条水培法对需冷量的测定可知，传统方法测定的湖景蜜露的需冷量为672h，而本发明的快速测算方法测算的需冷量为600-750h，与传统需冷量测定方法得出的需冷量相对应，说明本发明方法的可靠性。
[0082]
本发明的测算方法，单个品种的ppdam5基因相对表达量测定时间为3-4h，测定时间短，有效地加快了桃品种需冷量的测算，从而加快桃品种的引种效率和育种进程。
[0083]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。