一种区分H7N9亚型禽流感病毒感染与免疫动物的多肽及检测方法与流程

一种区分h7n9亚型禽流感病毒感染与免疫动物的多肽及检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够区分h7n9亚型禽流感病毒感染与免疫动物的多肽及检测方法。


背景技术：

2.h7n9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,aiv)是2013年在我国新发的一种人畜共患病。2017年，h7n9亚型aiv出现了高致病性的变异株，并造成家禽严重的疫病暴发。目前，h7n9亚型aiv在我国家禽中呈地方流行性，是家禽养殖业和公共卫生安全的重大威胁。
3.快速、高效、特异地监测家禽中h7n9病毒的流行情况对于疫病防控具有重大意义。现有三种主要方法对临床上的禽流感病毒进行检测与诊断。一是病毒的分离。这种方法可靠性较高，但是最大的缺陷在于处理h7n9亚型aiv需要生物安全三级的实验条件，在生产上的可操作性较低。二是利用分子生物学方法，如rt-pcr、荧光定量pcr等，进行病毒核酸的检测。这种方法的敏感性与实际操作性较高，但是同样需要较高的生物安全条件进行病毒样品的处理。三是利用血清学方法检测h7n9特异性抗体。这种方法不需进行活病毒的分离与操作，可操作性、特异性均较强，但是面临的最大问题是来自h7n9亚型禽流感疫苗免疫诱导的抗体的干扰。
4.自2017年以来，我国在全国范围内实行家禽h7n9亚型禽流感的强制免疫。因此，绝大多数鸡群均有较高水平的h7n9特异性抗体。但是，传统的血清学方法，如血凝抑制试验与琼脂扩散试验，均不能区分疫苗免疫诱导的抗体与野毒感染诱导的抗体。因此，为了监测免疫鸡群中h7n9亚型aiv的感染情况并及时阻断病毒传播，达到疫病净化的目的，应用能够区分野毒感染与疫苗免疫动物(differentiation between infected and vaccinated animals,diva)的策略具有重要意义。但是，目前还没有h7n9亚型禽流感的diva诊断方法。
5.现有能够实现禽流感病毒diva的策略主要包括：diva疫苗与diva血清诊断方法。diva疫苗主要包括亚单位疫苗与异源神经氨酸酶(na)疫苗。亚单位疫苗主要指仅包含血凝素(ha)的重组蛋白疫苗，这些疫苗免疫后只诱导产生针对ha蛋白的抗体，而野毒感染则可诱导产生多种病毒蛋白的抗体。例如，用检测病毒核衣壳蛋白(np)的血清学方法可以实现diva的目的。但是， ha亚单位疫苗的生产需要昆虫细胞的生产工艺，短期内难以在临床推广使用。异源na疫苗含有与流行野毒不同的na蛋白，因此可使用针对na蛋白的血清学方法区分病毒感染与疫苗免疫诱导的抗体。但是，印度尼西亚等一些国家的防控实践证明，异源na疫苗虽能达到diva的效果，但其免疫效力较低，防控效果不佳。此外，已报道的大多数diva血清学诊断技术主要检测野毒感染过程中产生的针对病毒内部蛋白，包括ns1与m2蛋白，的特异性抗体，而灭活疫苗免疫不产生这些抗体，从而实现diva的目的。但是，病毒的ns1与m2蛋白不是免疫原性较强的蛋白，诱导产生的抗体丰度较低。因此，现有的diva血清学诊断技术需要很高的灵敏度才能检测到这些低丰度抗体，这对技术的开发提出了挑战。
6.ha蛋白是流感病毒表面最重要的保护性抗原，其免疫原性较强，诱导产生的抗体水平高。但是，由于流行的野毒与疫苗中均含有ha蛋白，均能诱导ha 特异性抗体，而传统的血清学方法，如血凝抑制试验与琼脂扩散试验，均检测的是ha特异性抗体，因此难以区分野毒感染与疫苗免疫动物。所以，大多数研究者认为ha蛋白不是理想的diva抗原。但是，由于ha蛋白包含众多潜在的抗原表位，其中可能存在能够实现diva的特殊抗原区或表位。病毒感染过程中，ha蛋白被细胞的蛋白酶在其裂解位点处裂解为ha1与ha2两个亚单位，导致裂解位点附近的抗原表位可能发生变化；而灭活疫苗不会复制，ha蛋白不会发生裂解。因此，ha裂解位点附近的抗原表位与野毒感染和疫苗免疫诱导的抗体反应性可能不同，是潜在的diva诊断抗原。


技术实现要素：

7.针对目前h7n9亚型禽流感diva血清学诊断技术的缺失，以及现有diva 血清学方法针对抗体的丰度较低这一缺陷，本发明用生物信息学方法筛选了一条跨越h7n9亚型aiv ha蛋白裂解位点的多肽(330-knvpeipkgrg-340)，并以该多肽为基础建立了酶联免疫吸附试验(elisa)。该方法能够清晰地区分 h7n9病毒感染与疫苗免疫动物，达到diva的目的。本发明提供的多肽可作为家禽或人h7n9亚型aiv的diva监测的新靶标，所建立的诊断方法在疫病防控与公共卫生领域有较好的应用潜力。
8.为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
9.一种区分h7n9亚型禽流感病毒感染与免疫动物的多肽，所述多肽包含序列为knvpeipkgrg的氨基酸序列。
10.一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码上述多肽。
11.本发明还提供上述多肽在制备禽流感病毒检测试剂中的应用。
12.一种禽流感病毒的diva检测方法，采集待测禽类的血清，采用血凝抑制试验与elisa测定血清中h7n9特异性的抗体水平，血清抗体为阳性时，以权利要求1所述的多肽为检测抗原包被elisa板，h7n9病毒感染血清与疫苗免疫血清做梯度稀释后，进行多肽elisa实验测定与ha多肽的反应性，评价多肽区分h7n9病毒感染与疫苗免疫动物的性能。
13.进一步的，用血凝抑制试验测定这些血清针对h7n9病毒的血凝抑制抗体滴度，用elisa测定血清与ha蛋白结合性igg抗体水平。
14.进一步的，根据多肽elisa实验的反应曲线判断待测禽类为h7n9亚型禽流感病毒感染动物或h7n9亚型禽流感病毒免疫动物。
15.进一步的，多肽elisa实验的反应曲线中，od≥0.2时，待测禽类为h7n9 亚型禽流感病毒感染动物；od＜0.2时，待测禽类为h7n9亚型禽流感病毒免疫动物。
16.进一步的，将血清先做100倍稀释作为起始稀释度，再做2倍倍比稀释进行测定。
17.进一步的，测定h7n9病毒的血凝抑制抗体滴度方法为：
18.(1)h7n9病毒血凝效价测定与4单位抗原的配制
19.①
在96孔微量反应板中加入pbs，每孔25μl；
20.②
在第1排加入待测的h7n9病毒，每孔25μl，用移液器吹打混匀；
21.③
从第1排吸取25μl病毒液至第2排，吹打混匀，再吸取25μl至第3 排，照此操作，稀释至第11排，弃去病毒液；
22.④
补加pbs，每孔25μl；
23.⑤
加入1％鸡红细胞悬液，每孔25μl，轻柔震荡混匀，室温孵育40min；
24.⑥
各孔的凝集情况与第12排空白孔进行对照，完全凝集红细胞的病毒最高稀释度判定为病毒的血凝效价；
25.⑦
根据所测的血凝效价将病毒稀释至ha效价为2log2，即4单位抗原；
26.(2)hi抗体测定：
27.①
在96孔微量反应板中加入pbs，每孔25μl；
28.②
在第1排加入待测的h7n9阳性血清，每孔25μl，用移液器吹打混匀；
29.③
从第1排吸取25μl血清至第2排，吹打混匀，再吸取25μl至第3排，照此操作，稀释至第10排，弃去；
30.④
加入配制的4单位抗原，至第11排，每孔25μl，轻柔震荡混匀，室温孵育30min；
31.⑤
加入1％鸡红细胞悬液，每孔25μl，轻柔震荡混匀，室温孵育40min；
32.⑥
将能够完全抑制血凝现象的血清最高稀释度判定为血清的hi效价。
33.进一步的，测定血清与ha蛋白结合性igg抗体水平的方法为：
34.①
将h7n9 ha蛋白用包被缓冲液进行稀释至0.25μg/ml，加入96孔酶标板中，100μl/孔，4℃包被过夜；
35.②
弃去包被液，pbst洗4遍；
36.③
每孔加入200μl 5％脱脂乳，37℃封闭2h；
37.④
弃去封闭液，pbst洗4遍；
38.⑤
将待测血清用5％脱脂乳进行梯度稀释，取1:100至1:1562500稀释度加入微孔板，100μl/孔，37℃孵育1h；
39.⑥
弃去血清，pbst洗4遍；
40.⑦
加入1:5000稀释的羊抗鸡酶标二抗，100μl/孔，37℃孵育45min；
41.⑧
弃去二抗，pbst洗4遍；
42.⑨
每孔加入100μl tmb显色液，避光室温作用15min；
43.⑩
立即将96孔板放于酶标仪中，在370nm波长下进行读数，以od值为阴性对照血清2倍以上的血清最高稀释度判定为血清igg抗体效价。
44.进一步的，多肽elisa实验的步骤为：
45.①
将ha裂解位点多肽溶解于去离子水中，终浓度为1mg/ml；用包被缓冲液将多肽稀释至10μg/ml，加入96孔酶标板中，100μl/孔，4℃包被过夜；
46.②
弃去包被液，pbst洗4遍；
47.③
每孔加入200μl 5％脱脂乳，37℃封闭2h；
48.④
弃去封闭液，pbst洗4遍；
49.⑤
将待测血清用5％脱脂乳进行梯度稀释，取1:50至1:3200稀释度加入微孔板，100μl/孔，37℃孵1h；
50.⑥
弃去血清，pbst洗4遍；
51.⑦
加入1:5000稀释的羊抗鸡酶标二抗，100μl/孔，37℃孵育1h；
52.⑧
弃去二抗，pbst洗4遍；
53.⑨
每孔加入100μl tmb显色液，避光室温作用15min；
54.⑩
立即将96孔板放于酶标仪中，在370nm波长下进行读数，绘制血清与多肽的反应曲线。
55.(1)h7n9亚型aiv ha蛋白裂解位点附近表位的抗原潜力分析
56.用b细胞抗原表位预测工具，分析h7n9亚型aiv ha蛋白裂解位点附近潜在的抗原表位，并对抗原表位中每个氨基酸的抗原潜力进行打分，筛选抗原潜力较高的抗原表位作为潜在的diva抗原。所述h7n9病毒diva抗原的氨基酸序列如seq id no:1所示。
57.(2)横跨ha蛋白裂解位点的多肽合成
58.用化学合成法合成选定的多肽，并于多肽的n-末端添加bsa。根据多肽的溶解性分析，将合成多肽溶解于去离子水中，用于多肽elisa方法的建立。
59.(3)h7n9病毒感染血清与疫苗免疫血清特性的鉴定
60.前期研究中已经制备了不同的h7n9禽流感阳性鸡血清，包括h7n9病毒感染血清、h7n9疫苗免疫后病毒感染血清、h7n9灭活疫苗免疫血清、h7n9病毒载体疫苗免疫血清、商品化h5 h7灭活疫苗免疫血清。用血凝抑制试验测定这些血清针对h7n9病毒的血凝抑制抗体，用elisa测定血清与ha蛋白结合性igg抗体水平。
61.(4)h7n9病毒感染与疫苗免疫血清与ha多肽的反应性
62.以合成的多肽为检测抗原包被elisa板，h7n9病毒感染血清与疫苗免疫血清做梯度稀释后，进行多肽elisa实验测定与ha多肽的反应性，评价多肽区分h7n9病毒感染与疫苗免疫动物的性能。
63.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
64.(1)现有的血清学方法，如血凝抑制试验，不能区分h7n9病毒感染与免疫动物。本发明提供的ha蛋白多肽以及基于多肽建立的elisa方法则能够清晰区分h7n9禽流感病毒感染与免疫动物，可用于临床上h7n9野毒感染的监测，为疫病防控与公共卫生提供了新的诊断技术。
65.(2)已报道的禽流感diva方法大多仅区分病毒感染动物与疫苗免疫动物，在疫苗免疫动物中检测病毒的方法较少。本发明提供的ha多肽与h7n9灭活疫苗后病毒感染血清反应性较强，因此适用于在h7n9大规模强制免疫的背景下，在免疫鸡群检测h7n9野毒的流行情况。
66.(3)已发表的禽流感病毒diva方法大多针对病毒内部的免疫非优势蛋白，对diva方法的敏感性提出了挑战。本发明建立的diva方法则以禽流感病毒免疫优势抗原ha蛋白为靶标，检测病毒感染与疫苗免疫血清针对ha裂解位点多肽的反应性，敏感性较高。
67.(4)本发明首次应用横跨ha裂解点位的多肽进行禽流感病毒的diva检测，多肽氨基酸的抗原潜力较高，与h7n9阳性血清的反应性较强。
附图说明
68.图1为h7n9 ha蛋白裂解位点diva多肽的位置示意图；
69.图2为ha多肽氨基酸位点的抗原潜力打分图；
70.图3为h7n9病毒感染与疫苗免疫鸡血清的血凝抑制抗体滴度；
71.图4为h7n9病毒感染与疫苗免疫鸡血清的ha结合性igg抗体滴度；
72.图5为ha裂解位点多肽与h7n9病毒感染和疫苗免疫鸡血清的反应性；
73.图6为h7n9病毒感染和疫苗免疫鸡血清与ha裂解位点多肽的反应终点滴度。
具体实施方式
74.实施例1h7n9亚型aiv ha蛋白裂解位点附近表位的抗原潜力分析
75.利用b细胞抗原表位预测分析工具bepiprep 1.0对h7n9 ha蛋白裂解位点附近的潜在抗原表位及其抗原潜力进行预测与分析。将h7n9 ha蛋白氨基酸序列上传至预测服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/bepipred-1.0/)，筛选ha 蛋白裂解位点附近存在的抗原表位。预测工具设定0.25分为判定氨基酸是否为潜在的抗原表位的阈值，大于0.25分的氨基酸出现连续排列则可认定为潜在的 b细胞抗原表位，打分越高代表该氨基酸位点的抗原潜力越大。
76.结果：通过对h7n9 ha蛋白b细胞表位的生物信息学分析，筛选出横跨 ha蛋白裂解位点的一条多肽(330-knvpeipkgrg-340)是潜在的抗原表位(图 1)。氨基酸打分显示，第330位赖氨酸(k)到第340位甘氨酸(g)的打分均大于等于0.25，且为连续排列，可认定是一条潜在的抗原表位(图2)。除最后两个氨基酸的打分较低外，其他氨基酸的分值均在0.5以上，且第334位谷氨酸(e)、335位异亮氨酸(i)、336位脯氨酸(p)的打分均超过1.0分(图2)。因此，生物信息学分析显示，筛选到的ha裂解位点多肽的抗原潜力较好。
77.实施例2h7n9亚型禽流感病毒感染与免疫鸡血清的鉴定
78.前期研究中，已获得了h7n9亚型aiv感染鸡与疫苗免疫鸡的血清，背景信息如下：rgd15免疫血清指h7n9油乳剂灭活疫苗(rgd15株)免疫鸡血清； rgd15免疫后感染血清指h7n9油乳剂灭活疫苗(rgd15株)免疫鸡在h7n9 强毒感染14天后分离的血清；h7n9病毒感染血清指h7n9弱毒株(jt157株) 感染鸡的血清；h7n9载体疫苗免疫血清指h7n9新城疫病毒载体活疫苗免疫鸡的血清；商品疫苗免疫血清指商品化灭活疫苗(h5 h7)免疫鸡的血清。此外， h5亚型对照血清指h5n1亚型禽流感灭活疫苗免疫鸡的血清，作为无关血清对照；阴性对照血清为未免疫或感染鸡的血清。血清样品采集后于-20℃冻存，测试时将每组5-10只鸡的血清进行等量混合，用于测定血清的抗体滴度及与ha 裂解位点多肽的反应性。先用hi试验与elisa测定血清中h7n9特异性的抗体水平，认定为阳性的血清则进行下一步的diva实验。
79.进行血凝抑制(hi)试验测定血清针对h7n9病毒的hi抗体滴度，按以下步骤进行：
80.(1)h7n9病毒血凝效价测定与4单位抗原的配制
81.①
在96孔微量反应板中加入pbs，每孔25μl；
82.②
在第1排加入待测的h7n9病毒，每孔25μl，用移液器吹打混匀；
83.③
从第1排吸取25μl病毒液至第2排，吹打混匀，再吸取25μl至第3 排，照此操作，稀释至第11排，弃去病毒液；
84.④
补加pbs，每孔25μl；
85.⑤
加入1％鸡红细胞悬液，每孔25μl，轻柔震荡混匀，室温孵育40min；
86.⑥
各孔的凝集情况与第12排空白孔进行对照，完全凝集红细胞的病毒最高稀释度判定为病毒的血凝效价；
87.⑦
根据所测的血凝效价将病毒稀释至ha效价为2log2，即4单位抗原；
88.(2)hi抗体测定：
89.①
在96孔微量反应板中加入pbs，每孔25μl；
90.②
在第1排加入待测的h7n9阳性血清，每孔25μl，用移液器吹打混匀；
91.③
从第1排吸取25μl血清至第2排，吹打混匀，再吸取25μl至第3排，照此操作，稀释至第10排，弃去；
92.④
加入配制的4单位抗原，至第11排，每孔25μl，轻柔震荡混匀，室温孵育30min；
93.⑤
加入1％鸡红细胞悬液，每孔25μl，轻柔震荡混匀，室温孵育40min；
94.⑥
将能够完全抑制血凝现象的血清最高稀释度判定为血清的hi效价；
95.进行elisa测定h7n9阳性血清与ha蛋白的igg抗体滴度，按以下流程操作:
96.①
将h7n9 ha蛋白用包被缓冲液进行稀释至0.25μg/ml，加入96孔酶标板中，100μl/孔，4℃包被过夜；
97.②
弃去包被液，pbst洗4遍；
98.③
每孔加入200μl 5％脱脂乳，37℃封闭2h；
99.④
弃去封闭液，pbst洗4遍；
100.⑤
将待测血清用5％脱脂乳进行梯度稀释，取1:100至1:1562500稀释度加入微孔板，100μl/孔，37℃孵育1h；
101.⑥
弃去血清，pbst洗4遍；
102.⑦
加入1:5000稀释的羊抗鸡酶标二抗，100μl/孔，37℃孵育45min；
103.⑧
弃去二抗，pbst洗4遍；
104.⑨
每孔加入100μl tmb显色液，避光室温作用15min；
105.⑩
立即将96孔板放于酶标仪中，在370nm波长下进行读数，以od值为阴性对照血清2倍以上的血清最高稀释度判定为血清igg抗体效价；
106.结果：如图3所示，rgd15免疫血清的hi滴度为5log2，在强毒感染后， hi效价上升至9log2；h7n9病毒感染血清与商品疫苗免疫血清的hi滴度均为8 log2。虽然h7n9载体疫苗诱导的hi抗体仅为2log2，与阴性对照鸡血清的hi 滴度相同，但是该血清却能检测到阳性的ha特异性igg抗体。此外，h7n9灭活疫苗(rgd15与商品疫苗)免疫鸡与病毒感染鸡血清也均能检测到阳性的ha 特异性igg抗体。结果说明，用hi与elisa实验能够检测到h7n9灭活疫苗免疫鸡血清、病毒感染鸡血清及病毒载体疫苗免疫血清中均含有针对h7n9 ha蛋白的抗体，可用于下一步的diva检测。
107.实施例3h7n9病毒感染与疫苗免疫血清与ha裂解位点多肽的反应性
108.为了进一步评价h7n9病毒感染和免疫血清与筛选到的ha多肽的反应性，及该多肽作为diva抗原的潜力，按照以下流程进行多肽elisa实验：
109.①
将ha裂解位点多肽溶解于去离子水中，终浓度为1mg/ml；用包被缓冲液将多肽稀释至10μg/ml，加入96孔酶标板中，100μl/孔，4℃包被过夜；
110.②
弃去包被液，pbst洗4遍；
111.③
每孔加入200μl 5％脱脂乳，37℃封闭2h；
112.④
弃去封闭液，pbst洗4遍；
113.⑤
将待测血清用5％脱脂乳进行梯度稀释，取1:50至1:3200稀释度加入微孔板，100μl/孔，37℃孵1h；
114.⑥
弃去血清，pbst洗4遍；
115.⑦
加入1:5000稀释的羊抗鸡酶标二抗，100μl/孔，37℃孵育1h；
116.⑧
弃去二抗，pbst洗4遍；
117.⑨
每孔加入100μl tmb显色液，避光室温作用15min；
118.⑩
立即将96孔板放于酶标仪中，在370nm波长下进行读数，绘制血清与多肽的反应曲线；
119.结果：如图5所示，无关对照h5亚型血清及阴性对照血清与ha多肽均不反应，说明建立的多肽elisa方法特异性较强；h7n9 rgd15灭活疫苗与商品化灭活疫苗免疫鸡血清在任何稀释度均不与ha多肽反应；但是，rgd15免疫鸡在h7n9强毒感染后的血清则获得了与ha多肽的反应性,其中1:50与1:200 稀释度的od值较高；h7n9病毒感染鸡血清与ha多肽的反应性最强；h7n9 载体疫苗免疫鸡血清与ha多肽也不反应。因此，ha裂解位点多肽可以清晰区分h7n9病毒感染与疫苗免疫动物，可作为diva抗原；从反应曲线判断，可将 od＝0.2作为区分感染与免疫动物的临界值。
120.实施例4h7n9病毒感染与免疫血清与ha裂解位点多肽的反应终点滴度测定
121.由于在绘制ha多肽反应曲线时所用的血清稀释度跨度较大(5倍倍比稀释)，难以准确确定h7n9血清与ha多肽的终点反应滴度。因此，将血清先做 100倍稀释作为起始稀释度，再做2倍倍比稀释进行测定。操作流程与实施例3 相同，将od值为阴性对照血清2倍以上的血清最高稀释度判定为血清对ha多肽的反应终点滴度。
122.结果：如图6所示，h5亚型对照血清及阴性对照血清与ha多肽的反应终点滴度小于100；h7n9 rgd15灭活疫苗、商品化灭活疫苗与h7n9载体疫苗免疫鸡血清与ha多肽反应的终点滴度小于100；但是，rgd15免疫鸡在h7n9强毒感染后的血清与ha多肽的反应滴度上升至240。h7n9病毒感染鸡血清与ha 多肽的反应滴度最高，为640。因此，h7n9血清与ha多肽的反应终点滴度存在差异，可作为区分病毒感染与疫苗免疫动物的指标。
123.综上所述，通过本发明所述的具体实施例，证明ha裂解位点多肽 330-knvpeipkgrg-340与h7n9亚型aiv感染动物血清有较强的反应性，而与h7n9疫苗免疫动物血清的反应性较低。基于该条多肽建立的elisa方法能够清晰地区分h7n9亚型禽流感病毒感染与疫苗免疫动物。因此，本发明提供了一条可用于h7n9 diva的多肽及检测方法，对疫病检测与防控有重要意义。
124.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域。但是，凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。