基于REIC/Dkk-3基因与抗肿瘤剂的联用的肝癌的治疗方法与流程

基于reic/dkk-3基因与抗肿瘤剂的联用的肝癌的治疗方法
技术领域
1.本发明涉及抗肝癌组合物。


背景技术：

2.在癌症、尤其是晚期肝癌的治疗中，使用抗癌剂的化学疗法在治疗中占据重要位置。在作为晚期肝癌治疗的标准药物的索拉非尼的临床试验中，存活期的中央值为15.6个月，预后不良(参见非专利文献1)。除了索拉非尼以外，还开发出了瑞戈非尼、乐伐替尼，已得到临床应用从而增加了治疗选项，它们均已被证明是不劣于索拉非尼的药剂，但尚未达到预后的显著改善。此外，在晚期肝癌的治疗中使用了顺铂，但从有效率的方面出发还不能说充分。
3.已知reic/dkk-3基因与细胞的永生化相关。已有报告指出，该基因的表达在癌细胞中受到了抑制。此外还报告了reic/dkk-3基因在癌症治疗中的应用(参见专利文献1)。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：国际公开第wo01/038528号
7.非专利文献
8.非专利文献1：llovet jm.et al.,n engl j med 2008；359(4):378-390


技术实现要素：

9.发明所要解决的课题
10.如上所述，在现有的晚期肝癌化学疗法中，难以得到充分的治疗效果。在现有的晚期肝癌化学疗法中，所有抗癌剂的副作用均比较强，具有由于治疗不耐受而不得不减量或停药的问题。
11.本发明的目的在于提供通过将抗肿瘤剂与reic/dkk-3基因联用而治疗癌症的方法。本发明的目的还在于提供用于与抗肿瘤剂联用的包含reic/dkk-3基因作为有效成分的药物。
12.用于解决课题的手段
13.本发明人对于reic/dkk-3基因与作为化疗剂的抗肿瘤剂的联用对肝癌治疗的效果进行了研究。
14.本发明人发现，reic/dkk-3基因与抗肿瘤剂的联用会诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤增殖，该效果显著高于将二者分别单独使用的情况。这显示出，reic/dkk-3基因与抗肿瘤剂的联用在癌症治疗中非常有用。
15.即，本发明如下所述。
16.[1]一种肝癌治疗用药物，其包含reic/dkk-3基因作为有效成分并与抗肿瘤剂联用。
[0017]
[2]如[1]所述的药物，其特征在于，reic/dkk-3基因被并入到腺病毒载体中。
[0018]
[3]如[1]或[2]所述的药物，其中，抗肿瘤剂为铂制剂。
[0019]
[4]如[3]所述的药物，其中，铂制剂选自由顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、米铂、米他铂(mitaplatin)、沙铂、吡铂和特瑞铂组成的组。
[0020]
[5]如[1]或[2]所述的药物，其中，抗肿瘤剂为酪氨酸激酶抑制剂。
[0021]
[6]如[5]所述的药物，其中，酪氨酸激酶抑制剂为选自由索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、卡博替尼、阿昔替尼、舒尼替尼、帕唑帕尼和厄洛替尼组成的组中的1种或2种以上。
[0022]
[7]如[5]所述的药物，其中，酪氨酸激酶抑制剂是以vegfr(血管内皮生长因子受体)为靶的酪氨酸激酶抑制剂。
[0023]
[8]如[7]所述的药物，其中，以vegfr为靶的酪氨酸激酶抑制剂选自由索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、卡博替尼、阿昔替尼、舒尼替尼和帕唑帕尼组成的组。
[0024]
[9]如[1]或[2]所述的药物，其中，抗肿瘤剂为免疫检查点抑制剂。
[0025]
[10]如[9]所述的药物，其中，免疫检查点抑制剂为pd-1/pd-l1免疫检查点通路抑制剂。
[0026]
[11]如[1]～[10]中任一项所述的药物，其中，所述药物为局部给药剂的形式。
[0027]
[12]一种用于肝癌治疗的组合药物试剂盒，其中，组合含有抗肿瘤剂和reic/dkk-3基因。
[0028]
[13]如[12]所述的组合药物试剂盒，其特征在于，reic/dkk-3基因被并入到腺病毒载体中。
[0029]
[14]如[12]或[13]的组合药物试剂盒，其中，抗肿瘤剂为铂制剂。
[0030]
[15]如[14]所述的组合药物试剂盒，其中，铂制剂选自由顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、米铂、米他铂、沙铂、吡铂和特瑞铂组成的组。
[0031]
[16]如[12]或[13]所述的组合药物试剂盒，其中，抗肿瘤剂为酪氨酸激酶抑制剂。
[0032]
[17]如[16]所述的组合药物试剂盒，其中，酪氨酸激酶抑制剂为选自由索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、卡博替尼、阿昔替尼、舒尼替尼、帕唑帕尼和厄洛替尼组成的组中的1种或2种以上。
[0033]
[18]如[16]所述的组合药物试剂盒，其中，酪氨酸激酶抑制剂为以vegfr(血管内皮生长因子受体)为靶的酪氨酸激酶抑制剂。
[0034]
[19]如[18]所述的组合药物试剂盒，其中，以vegfr为靶的酪氨酸激酶抑制剂选自由索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、卡博替尼、阿昔替尼、舒尼替尼和帕唑帕尼组成的组。
[0035]
[20]如[12]或[13]所述的组合药物试剂盒，其中，抗肿瘤剂为免疫检查点抑制剂。
[0036]
[21]如[20]所述的组合药物试剂盒，其中，免疫检查点抑制剂为pd-1/pd-l1免疫检查点通路抑制剂。
[0037]
[22]如[12]～[21]中任一项所述的组合药物试剂盒，其中，reic/dkk-3基因为局部给药剂的形式。
[0038]
[23]一种抗肝癌组合物，其包含抗肿瘤剂和reic/dkk-3基因。
[0039]
[24]如[23]所述的抗肝癌组合物，其特征在于，reic/dkk-3基因被并入到腺病毒载体中。
[0040]
[25]如[23]或[24]所述的抗肝癌组合物，其中，抗肿瘤剂为铂制剂。
[0041]
[26]如[25]所述的抗肝癌组合物，其中，铂制剂选自由顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利
铂、米铂、米他铂、沙铂、吡铂和特瑞铂组成的组。
[0042]
[27]如[23]或[24]所述的抗肝癌组合物，其中，抗肿瘤剂为酪氨酸激酶抑制剂。
[0043]
[28]如[27]所述的抗肝癌组合物，其中，酪氨酸激酶抑制剂为选自由索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、卡博替尼、阿昔替尼、舒尼替尼、帕唑帕尼和厄洛替尼组成的组中的1种或2种以上。
[0044]
[29]如[27]所述的抗肝癌组合物，其中，酪氨酸激酶抑制剂是以vegfr(血管内皮生长因子受体)为靶的酪氨酸激酶抑制剂。
[0045]
[30]如[29]所述的抗肝癌组合物，其中，以vegfr为靶的酪氨酸激酶抑制剂选自由索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、卡博替尼、阿昔替尼、舒尼替尼和帕唑帕尼组成的组。
[0046]
[31]如[23]或[24]所述的抗肝癌组合物，其中，抗肿瘤剂为免疫检查点抑制剂。
[0047]
[32]如[31]所述的抗肝癌组合物，其中，免疫检查点抑制剂为pd-1/pd-l1免疫检查点通路抑制剂。
[0048]
[33]如[23]～[32]所述的抗肝癌组合物，其中，reic/dkk-3基因为局部给药剂的形式。
[0049]
本说明书包括作为本技术的优先权基础的日本专利申请2019-141677号的公开内容。
[0050]
发明的效果
[0051]
通过在现有的针对晚期肝癌的化学疗法中加入ad-reic的局部给药，能够有效地提高治疗效果。
[0052]
通过联用ad-reic的局部给药，能够有效地减少化疗药的用量，其结果能够减轻化疗药的副作用，能够大幅减轻对患者的负担。
[0053]
ad-reic具有诱导癌细胞特异性细胞死亡的作用和免疫活化作用。该抗癌效果与现有的化疗药的基于细胞损伤对肝癌细胞产生的效果不同。即，现有的化疗药中，由于抗癌剂的耐药性导致的效果减弱、无效成为治疗上的问题，但与ad-reic联用时，能够大幅减轻化疗药的用量，因此，结果能够减轻抗癌剂耐药性的问题。另外，由于ad-reic与现有的化疗药的作用机制不同，因此，其本身当然不用担心抗癌剂耐药性的问题，具有能够有效地抑制化疗药的抗癌剂耐药性的优点。
附图说明
[0054]
图1是示出ad-reic/dkk-3的结构例的图。
[0055]
图2是示出ad-reic/dkk-3的序列的图。
[0056]
图3是示出基于免疫印迹的reic的检测结果的图。
[0057]
图4是示出由ad-reic所致的细胞存活率的降低的图。
[0058]
图5是示出由ad-reic与顺铂的联用所致的细胞存活率的降低的图。
[0059]
图6是示出肝癌细胞株中的jnk信号通路的免疫印迹分析的结果的图。
[0060]
图7是示出小鼠肝癌异种移植模型中的由ad-reic和顺铂的联用处理所致的肿瘤增殖抑制效果的图。
[0061]
图8是示出小鼠肝癌同种移植模型中的由ad-reic和顺铂的联用处理所致的肿瘤增殖抑制效果的图。
[0062]
图9是示出小鼠肝癌同种移植模型中的由ad-reic和抗pd-1抗体的联用处理所致的肿瘤增殖抑制效果的图。
[0063]
图10a是示出小鼠肝癌同种移植模型中的由ad-reic和酪氨酸激酶抑制剂(索拉非尼)的联用处理所致的肿瘤增殖抑制效果的图。
[0064]
图10b是示出小鼠肝癌同种移植模型中的由ad-reic和酪氨酸激酶抑制剂(乐伐替尼)的联用处理所致的肿瘤增殖抑制效果的图。
[0065]
图11是示出由ad-reic和酪氨酸激酶抑制剂的联用所致的细胞存活率的降低的图。
具体实施方式
[0066]
以下详细说明本发明。
[0067]
本发明的肝癌的联用疗法中，组合使用(联用)reic/dkk-3基因和抗肿瘤剂。
[0068]
reic/dkk-3 dna的碱基序列由序列表的序列号1所表示。另外，reic/dkk-3dna所编码的reic/dkk-3蛋白的氨基酸序列由序列表的序列号2所表示。在使用序列号1所表示的碱基序列和blast(basic local alignment search tool at the national center for biological information(ncbi)(美国国家生物技术信息中心的基本局部比对搜索工具))等(例如使用默认值即初期设定的参数)进行计算时具有至少85％以上、优选至少90％以上、进一步优选至少95％以上、特别优选至少97％以上的序列相同性的dna包含在reic/dkk-3 dna中。
[0069]
也可以使用reic/dkk-3的核苷酸片段。包含序列号1所表示的reic/dkk-3 dna的碱基序列中的从第1个碱基开始到第117个碱基～第234个碱基中的任一碱基结束的碱基序列的核苷酸的示例包括从第1个碱基到第117个碱基的范围的多核苷酸(序列号3)、以及从第1个碱基到第234个碱基的范围的多核苷酸(序列号4)。
[0070]
reic/dkk-3基因可以通过现有方法导入到受试体中。作为将基因导入到受试体中的方法，可以举出使用病毒载体的方法和使用非病毒载体的方法。
[0071]
即使不使用上述病毒，也可以使用导入有质粒载体等基因表达载体的重组表达载体将reic/dkk-3基因导入到细胞或组织中。
[0072]
作为用于基因导入的代表性病毒载体，可以举出腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒。通过在脱毒后的逆转录病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒、仙台病毒(hvj)、sv40、免疫缺陷病毒(hiv)等dna或rna病毒中导入目的基因，并利用这样的重组病毒感染细胞，能够将靶基因导入到细胞内。优选使用腺病毒载体。
[0073]
载体包含含有reic/dkk-3基因的构建体。含有reic/dkk-3 dna的构建体可以适当地包含启动子、用于基因转录的增强子、多聚a信号、用于导入有基因的细胞的标记和/或筛选的标记基因等。作为此时的启动子，可以使用公知的启动子。
[0074]
该构建体包含reic/dkk-3基因和至少1个位于第1启动子的下游的多聚a附加序列，并具有在该dna构建体的下游连接有增强子或第2启动子的结构。
[0075]
启动子是以dna为模板开始转录的dna上的特定碱基序列，通常具有共有序列。例如，大肠杆菌等原核生物中，通常在转录开始位点的-10个碱基对位点处具有tataatg序列、在-35个碱基对位点处具有ttgaca序列。另外，在真核生物中，通常在-20个碱基对位点处具
有tata框。本发明的表达用盒在所要表达的基因的上游一定具有第1启动子，并且在所要表达的基因的下游可以具有第2启动子。用作这些第1启动子和第2启动子的启动子没有限定，第1启动子和第2启动子可以相同也可以不同。可以使用所有能够在细胞或组织中促进外源基因的表达的非特异性启动子，也可以使用组织或器官特异性启动子、肿瘤特异性启动子、发生或分化特异性启动子等特异性或选择性启动子。例如，可以使用特异性启动子作为第1启动子，使用非特异性启动子作为第2启动子。作为本发明中使用的启动子，可以举出：作为癌或肿瘤特异性启动子的htert(人端粒酶逆转录酶)、psa(前列腺特异抗原)、c-myc、glut启动子等；作为es细胞-癌干细胞特异性启动子的oct3/4、nanog启动子等；作为神经干细胞特异性启动子的nestin启动子等；作为细胞应激敏感性启动子的hsp70、hsp90、p53启动子等；作为肝细胞特异性启动子的白蛋白启动子等；作为放射线敏感性启动子的tnf-alpha启动子等；作为提高感染质粒的拷贝数的启动子的sv40启动子等；作为增殖性细胞特异性启动子的ef1-alpha启动子等。更具体地说，例如，作为第1启动子使用cmv-i启动子(hcmv 内含子启动子)、β肌动蛋白启动子、cag启动子、cmv启动子等，作为第2启动子使用cmv启动子等。β肌动蛋白启动子的来源动物种没有限定，可以使用哺乳类β肌动蛋白启动子、例如人β肌动蛋白启动子、鸡肌动蛋白启动子。另外，也可以使用上述cmv-i启动子等人工杂合启动子。cmv-i启动子例如可以基于美国专利第5,168,062号说明书、美国专利第5,385,839号说明书的记载进行合成。启动子也可以使用由具有启动子活性的最小序列构成的核心启动子部分。核心启动子是指具有引导准确的转录起始的作用的启动子区域，有时包含tata框。上述启动子中，htert启动子等癌和/或肿瘤特异性启动子能够优选用于基于以癌为靶的基因表达的基因治疗、癌诊断用途中。
[0076]
多聚a附加序列(多聚腺苷化序列、多聚a)的来源没有限定，可以举出生长激素基因来源的多聚a附加序列(例如牛生长激素基因来源的多聚a附加序列、人生长激素基因来源的多聚a附加序列)、sv40病毒来源的多聚a附加序列、人或兔β珠蛋白基因来源的多聚a附加序列等。通过使表达用盒中包含多聚a附加序列，转录效率增大。bga多聚a附加序列的碱基序列如序列号5中示出的碱基序列的第13个碱基之后的序列所示。
[0077]
增强子只要最终使通过转录生成的信使rna(mrna)的量增加就没有限定。增强子是具有促进启动子的作用的效果的碱基序列，通常多由100bp左右构成。无论序列的方向如何，增强子均可促进转录。本发明中使用的增强子可以为1种，也可以将2个以上的相同增强子使用多个、或者将不同的2个以上的增强子组合使用。另外，在使用2个以上不同的增强子的情况下，其顺序没有限定。例如，可以使用cmv增强子、sv40增强子、htert(端粒酶逆转录酶)增强子等。作为一例，可以举出将htert增强子、sv40增强子和cmv增强子依序连接而成的增强子。
[0078]
也可以进一步在包含编码所要表达的蛋白质的dna和多聚a附加序列的dna构建体的上游连接有2个以上的增强子、例如1～4个增强子。在其上游连接的增强子没有限定，优选cmv增强子。例如可以举出将4个cmv增强子连接而成的4
×
cmv增强子等。
[0079]
紧靠在由“启动子-所要表达的基因-多聚a附加序列”构成的dna构建体的下游插入增强子时，与现有的一般基因表达系统相比，能够强力地表达所要表达的基因的蛋白质。
[0080]
特别是通过cmv i启动子与cmv增强子的组合，在几乎所有细胞(宿主细胞)中插入所有基因的情况下，无论在使用任何转染试剂的情况下，均能够强力地表达所要表达的基
因的蛋白质。
[0081]
此外，也可以紧靠在编码所要表达的蛋白质的dna的上游连接有ru5’。紧靠在
……
的上游是指不隔着其他具有特定功能的元件而直接连接，但其间可以含有作为连接序列的短序列。ru5’为htlv来源的ltr，其是通过插入而提高蛋白质表达的元件(mol.cell.biol.,vol.8(1),p.466-472,1988)。若将ru5’按照与报告相反的方式插入，则由增强子插入所致的启动子的表达增强效果有时会被抵消。
[0082]
此外，紧靠在增强子和/或启动子的上游可以连接有uas。uas是gal4基因的结合区域，通过在其后插入gal4基因，可使蛋白质表达提高。
[0083]
此外，可以在表达用盒的最上游连接有sv40-ori。sv40-ori为sv40基因的结合区域，通过插入sv40基因，蛋白质表达提高。上述各元件需要进行功能性连接。此处，功能性连接是指按照各元件发挥出其功能、所要表达的基因的表达得到增强的方式进行了连接。
[0084]
上述dna构建体中，在reic/dkk-3 dna的上游连接cmv(巨细胞病毒)启动子、在reic/dkk-3 dna的下游连接多聚a附加序列(多聚腺苷化序列、多聚a)。此外，在该多聚a附加序列的下游连接有将htert(端粒酶逆转录酶)增强子、sv40增强子和cmv(巨细胞病毒)增强子依序连接而成的增强子(3
×
enh)。即，上述dna构建体是从5’末端侧起连接有(i)cmv启动子、(ii)reic/dkk-3 dna、(iii)多聚a附加序列、以及(iv)将htert(端粒酶逆转录酶)增强子、sv40增强子和cmv增强子依序连接而成的增强子的构建体。
[0085]
将本发明的包含reic/dkk-3 dna的dna构建体的除cmv启动子以外的部分的序列示于图2和序列号6中。图2中，在reic/dkk-3 dna与3
×
enh之间包含bga多聚a序列。本发明的包含reic/dkk-3 dna的dna构建体在序列号6所示的序列的上游(5’侧)具有cmv启动子。在序列号7中示出上述构建体中包含的含有bgh多聚a和3个增强子的区域的碱基序列。图2的碱基序列中的被(1)和(2)的框架包围的部分分别表示编码reic/dkk-3蛋白的dna和3个增强子(3
×
enh)。
[0086]
上述各元件需要进行功能性连接。此处的功能性连接是指按照各元件发挥出其功能、所要表达的基因的表达得到增强的方式进行了连接。
[0087]
上述的表达用盒例如可以如下得到：在市售的在cmv启动子的下游包含外源基因插入位点、进一步在其下游包含bga多聚a序列的pshuttle载体(clonetech公司)中插入reic/dkk-3 dna，进一步在bga多聚a序列的下游依序连接htert(端粒酶逆转录酶)增强子、sv40增强子和cmv增强子，由此得到该表达用盒。
[0088]
包含reic/dkk-3 dna的dna构建体为下述的dna构建体：
[0089]
[1]一种用于表达reic/dkk-3蛋白的dna构建体，其中，从5’末端侧起连接有：
[0090]
(i)cmv启动子；
[0091]
(ii)下述reic/dkk-3 dna：
[0092]
(a)由序列号1表示的碱基序列构成的dna、
[0093]
(b)与由序列号1表示的碱基序列具有至少90％、95％、97％或98％的序列相同性的dna；
[0094]
(iii)多聚a附加序列；以及
[0095]
(iv)将htert(端粒酶逆转录酶)增强子、sv40增强子和cmv增强子依序连接而成的增强子。
[0096]
[2]如[1]所述的dna构建体，其中，多聚a附加序列是牛生长激素基因来源的多聚a附加序列(bga多聚a)。
[0097]
[3]如[1]或[2]所述的dna构建体，其中，包含序列号6所示的将下述序列连接而成的碱基序列：(ii)reic/dkk-3 dna、(iii)多聚a附加序列、以及(iv)将htert(端粒酶逆转录酶)增强子、sv40增强子和cmv增强子依序连接而成的增强子。
[0098]
dna构建体例如可以按照国际公开第wo2011/062298号、美国专利申请公开第2012-0309050号说明书、国际公开第wo2012/161352号和美国专利申请公开第2014-0147917号说明书的记载来制备。
[0099]
本发明中，将包含reic/dkk-3 dna的腺病毒载体称为“ad-reic”或“ad-reic/dkk-3”。
[0100]
将包含本发明的dna构建体的载体系统称为sge(超级基因表达)系统，例如将含有包含reic/dkk-3 dna的dna构建体的腺病毒载体称为ad5-sge-reic/dkk-3。图1例示出ad-reic/dkk-3的结构，图2例示出ad-reic/dkk-3的序列。
[0101]
包含上述dna构建体的腺病毒载体通过向腺病毒载体中导入上述dna构建体来制作重组腺病毒而得到。dna构建体向腺病毒中的导入例如可以通过将包含上述本发明的dna构建体的pshuttle载体中的dna构建体导入到腺病毒中来进行。
[0102]
作为腺病毒载体的特征，可以举出下述特征：(1)能够在多种细胞中进行基因导入；(2)即使对增殖停止期的细胞也能效率良好地进行基因导入；(3)可通过离心进行浓缩，得到高滴度(10～11pfu/ml以上)的病毒；(4)适合于在体内的组织细胞中直接进行基因导入。
[0103]
作为基因治疗用的腺病毒，由e1/e3区域缺失的第1代腺病毒载体(miyake,s.,et al.,proc.natl.acad.sci.usa.,93,1320,1996)开发出了除e1/e3区域以外e2或e4区域也缺失的第2代腺病毒载体(lieber,a.,et al.,j.virol.,70,8944,1996；mizuguchi,h.&kay,m.a.,hum.gene ther.,10,2013,1999)、腺病毒基因组基本完全缺失的(gutless)第3代腺病毒载体(steinwaerder,d.s.,et al.,j.virol.,73,9303,1999)，在导入本发明的基因时，可以没有特别限定地使用任一种腺病毒载体。
[0104]
通过将本发明的含有包含reic/dkk-3 dna的dna构建体的重组腺病毒载体(以下有时简称为“本发明的腺病毒载体”)施用至人或作为其他哺乳动物的受试体，癌治疗用基因被运送至受试体的肝癌细胞中，在癌细胞中进行基因表达，抑制肿瘤细胞增殖，发挥出癌治疗效果。
[0105]
本发明的腺病毒载体可以通过基因治疗领域中可使用的方法、例如静脉内给药或动脉内给药等血管内给药、经口给药、腹腔内给药、气管内给药、支气管内给药、皮下给药、经皮给药等进行给药。特别是本发明的腺病毒载体对特定组织、细胞的指向性强，能够将靶基因有效地运送到特定组织、细胞中，因而即使通过血管内给药也能够有效地进行诊断、治疗。
[0106]
本发明的腺病毒载体以治疗有效量进行给药即可。基因治疗领域的本领域技术人员能够容易地确定治疗有效量。此外，给药量可以根据受试者的病情的严重度、性别、年龄、体重、习惯等适当变更。例如，将本发明的腺病毒载体以0.3
×
10
10
～3
×
10
12
vp(病毒颗粒数)的量向肿瘤内进行局部给药即可。
[0107]
本发明中，使用reic/dkk-3基因或reic/dkk-3 dna的情况也包括作为包含reic/dkk-3 dna的reic/dkk-3 dna腺病毒载体(ad-reic)使用的情况。
[0108]
作为与reic/dkk-3基因联用的抗肿瘤剂，可以举出铂制剂、酪氨酸激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂。
[0109]
作为铂制剂，可以举出顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、米铂、米他铂、沙铂、吡铂、特瑞铂等。
[0110]
作为酪氨酸激酶抑制剂，可以举出索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、卡博替尼、阿昔替尼、舒尼替尼、帕唑帕尼和厄洛替尼。另外，作为酪氨酸激酶抑制剂，可以举出以vegfr(血管内皮生长因子受体)为靶的酪氨酸激酶抑制剂，作为以vegfr为靶的酪氨酸激酶抑制剂，可以举出索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、卡博替尼、阿昔替尼、舒尼替尼和帕唑帕尼。这些之中，优选索拉非尼、瑞戈非尼和乐伐替尼。
[0111]
免疫检查点抑制剂包括抗pd-1(细胞程序性死亡1)抗体、抗pd-l1(细胞程序性死亡配体1)抗体等。免疫检查点抑制剂是抗pd-1(细胞程序性死亡1)抗体和抗pd-l1(细胞程序性死亡配体1)抗体等pd-1/pd-l1免疫检查点通路抑制剂。pd-1/pd-l1免疫检查点通路通过藉由pd-1/pd-l1等免疫检查点分子妨碍t细胞的活化而下调免疫系统。另外已知，这些免疫检查点分子促进淋巴结中的抗原特异性t细胞的凋亡(细胞程序性死亡)、减少调节性t细胞(treg)的凋亡。
[0112]
将这些抗肿瘤剂与reic/dkk-3基因联用的情况下，不仅可显著提高癌的治疗效果，而且还能够大幅减少这些化疗药的用量，作为其结果，能够减轻抗肿瘤剂的副作用。
[0113]
另外，在使用化疗药的情况下，有时癌细胞对化疗药显示出抗性(耐性)。在与reic/dkk-3基因联用的情况下，能够有效地抑制癌细胞对化疗剂的耐药性。
[0114]
这些抗肿瘤剂的给药量根据症状、年龄、体重和其他状态而变化。可以将每1天0.001mg～100mg的用量1次或分成数次，以数天、数周或数月的间隔进行给药。
[0115]
由reic/dkk-3基因编码的reic/dkk-3蛋白可以通过下调抗癌免疫系统而对癌进行治疗或预防。此外还诱导癌细胞的凋亡。具体地说，reic/dkk-3蛋白诱导ctl(细胞毒性t淋巴细胞)，ctl攻击全身的癌细胞。
[0116]
reic/dkk-3基因和抗肿瘤剂在癌的治疗中发挥出协同的效果。reic/dkk-3基因与抗肿瘤剂的联用比单独的reic/dkk-3基因或单独的抗肿瘤剂对癌的治疗更为有效。
[0117]
reic/dkk-3基因可以在抗肿瘤剂给药的同时分开地或连续地给药。reic/dkk-3基因也可以在抗肿瘤剂给药前或给药后进行给药。优选reic/dkk-3基因与抗肿瘤剂同时给药。在同时给药的情况下，可以作为分开的制剂进行给药，也包括以包含reic/dkk-3基因和抗肿瘤剂这两者的抗肿瘤组合物的形式进行给药的情况。将reic/dkk-3基因与抗肿瘤剂分开进行给药的情况下，抗肿瘤剂在reic/dkk-3基因给药的1～24小时前、1～30天之前或之后进行给药。此外，抗肿瘤剂也可以与reic/dkk-3基因以相同的间隔进行给药。在进行2次以上reic/dkk-3基因给药时，进行1次抗肿瘤剂给药。或者，在进行2次以上抗肿瘤剂给药时，进行1次reic/dkk-3基因给药。
[0118]
reic/dkk-3基因或抗肿瘤剂、或者包含reic/dkk-3基因和抗肿瘤剂的组合物的给药方式没有限定，可以通过皮下注射、肌肉内注射或静脉内注射进行给药。可以为全身给药剂、也可以为局部给药剂，优选reic/dkk-3基因是以癌部位为靶的局部给药剂、联用的抗肿
瘤剂是全身给药剂或局部给药剂。另外，顺铂等铂制剂优选为静脉内注射给药剂。
[0119]
reic/dkk-3基因或抗肿瘤剂、或者包含reic/dkk-3基因和抗肿瘤剂的组合物含有在制剂领域中通常使用的载体、稀释剂和赋型剂。例如，作为片剂用的载体、赋型剂，使用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等单糖类(包括赤藓醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇等糖醇)、乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖等二糖类(包括乳糖醇、麦芽糖醇等糖醇)、以及低聚糖、多糖类(包括增粘多糖类、淀粉、粉末纤维素、微晶纤维素、糊精、右旋糖苷、麦芽糊精、异麦芽糊精等)、以及碳酸钙、高岭土、磷酸氢钙、磷酸三钙、硫酸钙、硬脂酸镁等。作为注射用的水性液，使用生理盐水、包含葡萄糖等上述糖类和其他辅助药的等渗液等，可以与适当的助溶剂例如醇、丙二醇等多元醇、非离子表面活性剂等合用。作为油性液，使用芝麻油、大豆油等，作为助溶剂，可以合用苯甲酸苄酯、苯甲醇等。上述载体、稀释剂和赋型剂分别可以单独使用或将它们中的1种或2种以上适当地组合使用。
[0120]
作为治疗对象的癌为肝癌。肝癌包括原发性肝癌和转移性肝癌。
[0121]
本发明包括包含reic/dkk-3基因和抗肿瘤剂的组合、组合制剂或组合药物试剂盒。
[0122]
本发明还包括在用于治疗癌的药品的制造中将reic/dkk-3基因和抗肿瘤剂进行组合的方法。
[0123]
本发明还包括包含reic/dkk-3基因和抗肿瘤剂的药物。
[0124]
此外，本发明包括用于与抗肿瘤剂联用的reic/dkk-3基因。
[0125]
实施例
[0126]
通过以下的实施例具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
[0127]
[实施例1]reic/dkk-3与顺铂的联用对肿瘤增殖的抑制(体外)
[0128]
《材料和方法》
[0129]
细胞株和细胞培养：
[0130]
肝癌细胞株hep3b和huh7(以下有时分别称为“hep3b细胞”、“huh7细胞”)购自日本癌资源库(japanese cancer resources bank)(东京、日本)。将这些细胞株在添加有10％fbs、1％非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素和两性霉素b(0.5μg/ml)的杜氏改良伊格尔培养基中维持。将细胞通过常规方法在加湿的5％co2温箱中在37℃进行培养，在达到半融合的时刻在实验前利用包含0.1％透析fbs的培养基进行24小时预处理，供于实验。
[0131]
腺病毒载体的构建和生产
[0132]
将人reic/dkk-3基因的全长互补dna并入到粘粒载体paxcawt中，并且按照cos-tpc法(takara bio、滋贺、日本)移至腺病毒载体中。接着，在所插入的reic/dkk-3基因的多聚a序列后追加htert、sv40以及cmv这3个增强子，得到导入有reic/dkk-3基因的腺病毒载体(ad-reic)。另一方面，使用导入有lacz基因的腺病毒载体(ad-lacz)作为对照载体。
[0133]
《肝癌细胞株中的reic蛋白表达》
[0134]
利用肝癌细胞株(hep3b细胞和huh7细胞)评价reic蛋白表达，使用oums-24细胞作为阳性对照。reic的表达通过免疫印迹进行检测。进行β-肌动蛋白的免疫印迹，确认细胞蛋白质为等量。将结果示于图3。如图3所示，reic表达在全部肝癌细胞株中均丧失或减弱。
[0135]
《由ad-reic所致的肝癌细胞株的细胞存活率的降低作用》
[0136]
在存在或不存在ad-lacz或ad-reic的条件下将肝癌细胞株hep3b和huh7培养72小
时。使用mtt分析对细胞存活率进行评价。即，将细胞(2
×
105个)接种在平底6孔塑料组织培养板上，按照常规方法进行24小时培养。将细胞分别用50moi(感染复数)的ad-lacz和ad-reic在0.5ml的无血清培养基中处理1小时。之后添加1.5ml的新鲜培养基。将细胞培养72小时后，向各孔中添加200μl的mtt试剂，将细胞进一步在37℃温育4小时。使用dmso溶解蓝紫色甲沉淀物，将100μl的溶液转移到平底96孔微孔板中。通过使用酶标仪测定570nm的吸光度来评价反映细胞存活率的线粒体活性。将结果以平均值
±
标准偏差(n＝5)的形式来表示(**p《0.01)。
[0137]
将结果示于图4。如图4所示，利用ad-reic(50moi)进行处理时，肝癌细胞株的细胞存活率降低。与ad-lacz处理相比，hep3b和huh7的减少率分别为80.8
±
3.42％和82.2
±
1.84％。
[0138]
《由ad-reic与顺铂的联用所致的肝癌细胞株的细胞存活率的降低作用》
[0139]
在不存在或存在顺铂(1μg/ml)的条件下、在不共存或共存ad-lac z(50moi)或ad-reic(50moi)的条件下将hep3b细胞和huh7细胞培养72小时。使用上述mtt分析评价细胞存活率。将结果以平均值
±
标准偏差(n＝5)的形式来表示(**p《0.01)。
[0140]
将结果示于图5。如图5所示，在利用ad-reic(50moi)和顺铂进行处理的情况下，肝癌细胞株的细胞存活率减少。与利用ad-lacz 顺铂进行处理的情况相比时，hep3b细胞和huh7细胞的减少率分别为58.0
±
8.57％和78.6
±
0.63％。此外，hep3b细胞和huh7细胞这两者的细胞存活率依赖于顺铂的给药量而减少。
[0141]
《基于ad-reic的jnk信号通路介导的凋亡的诱导》
[0142]
此前有报告指出，reic的过度表达使前列腺癌细胞株、胰腺癌细胞株和肝细胞癌细胞株中的er应激增加，由此诱导凋亡[uchida d.et al.,j gastroenterol hepatol(2014)29:973-983]。
[0143]
对ad-reic诱导凋亡的机理进行了研究。利用免疫印迹评价了ad-reic和顺铂对jnk信号通路的信号传递分子的活化。在hep3b和huh7细胞中转染10moi的ad-lacz和ad-reic，48小时后收集细胞溶解物。通过使用特异性抗体的免疫印迹对phospho-ask1(p-ask1)、phospho-ire1α(p-ire1α)、phospho-jnk(p-jnk)、phospho-c-jun(p-c-jun)β-肌动蛋白的蛋白质表达进行了分析。对β-肌动蛋白的免疫印迹是为了验证细胞蛋白质的均等上样而进行的。
[0144]
将结果示于图6。如图6所示，使用免疫印迹分析，确认到：在肝癌细胞株(huh7)中，p-ask1、p-ire1α、p-jnk和p-c-jun的表达响应于ad-reic处理而被活化。在加入了顺铂的情况下，无论有无ad-reic，各表达均独立地被活化。
[0145]
[实施例2]由reic/dkk-3和顺铂的联用处理所致的小鼠异种移植模型中的肿瘤增殖抑制
[0146]
《材料和方法》
[0147]
实验动物：
[0148]
balb/c-nu/nu雌性小鼠(6～8周龄)购自日本slc公司，在冈山大学动物实验设施中以动物能够自由地摄取食物和水的方式维持在spf环境下。在开始实验前使小鼠在饲养环境中适应1周以上。小鼠严格按照冈山大学医学部的设施内动物管理委员会的准则进行饲养、处理。
[0149]
小鼠异种移植模型中的肿瘤增殖分析：
[0150]
为了确定ad-reic和顺铂的治疗有用性，使用huh7细胞构建小鼠异种移植模型。将huh7细胞(1.0
×
108个细胞、混悬在200μl的pbs中)皮下注射至balb/c-nu/nu小鼠的右侧腹，在肿瘤尺寸达到直径约5～10mm后，分别随机地分配成每组5只的4个处理组(ad-lacz、ad-reic、ad-lacz 顺铂、ad-reic 顺铂)。将给药开始日作为第0天，在第0、7和14天进行ad-lacz(对照、1.0
×
109pfu)、ad-reic(1.0
×
109pfu)的肿瘤内给药。在第0、7和14天进行顺铂(1mg/kg)的腹腔内给药。每周测定肿瘤尺寸，使用下述数学式计算出肿瘤体积：v＝1/2
×
(最短直径)
×
1/2
×
(最短直径)
×
1/2
×
(最长径)
×
4/3
×
π。进一步计算出平均肿瘤体积，制作肿瘤增殖曲线。将结果以平均值
±
se(n＝5)的形式来表示(*p《0.05、**p《0.01)。
[0151]
将结果示于图7。如图7所示，在给药ad-lacz的对照组中，肿瘤进行性地增殖。在ad-reic给药组、ad-reic 顺铂给药组以及ad-lacz 顺铂给药组中，肿瘤增殖受到抑制。特别是在ad-reic 顺铂联用组中，肿瘤增殖被显著抑制，与ad-lacz 顺铂给药组相比，竟抑制了68.7
±
4.9％。
[0152]
[实施例3]由reic/dkk-3和顺铂的联用处理所致的小鼠同种移植模型中的肿瘤增殖抑制
[0153]
《材料和方法》
[0154]
实验动物：
[0155]
c57bl/6雌性小鼠(6～8周龄)购自日本slc公司，在冈山大学动物实验设施中以动物能够自由摄取食物和水的方式维持在spf环境下。在开始实验前使小鼠在饲养环境中适应1周以上。小鼠严格按照冈山大学医学部的设施内动物管理委员会的准则进行饲养、处理。
[0156]
小鼠同种移植模型中的肿瘤增殖分析：
[0157]
将小鼠肝癌细胞株hep1-6(2.0
×
108个细胞、混悬在200μl的pbs中)接种于c57bl/6小鼠的右侧腹(第0天)，在肿瘤尺寸达到直径5～10mm后，开始ad-reic和顺铂的给药。在第14和16天进行ad-reic(1.0
×
109pfu)的肿瘤内给药。在第14和21天进行顺铂(1mg/kg)的腹腔内给药。每周测定2次肿瘤的尺寸，计算出肿瘤体积。
[0158]
将结果示于图8。在给药pbs的对照组中，肿瘤进行性地增殖。在ad-reic组和顺铂组中，肿瘤体积减少，确认到抗肿瘤效果。此外，在ad-reic 顺铂联用组中，与ad-reic组和顺铂组相比确认到强抗肿瘤效果。
[0159]
[实施例4]由reic/dkk-3和抗pd-1抗体的联用处理所致的小鼠同种移植模型中的肿瘤增殖抑制
[0160]
将小鼠肝癌细胞株hep1-6(2.0
×
108个细胞、混悬在200μl的pbs中)接种于c57bl/6小鼠的右侧腹(第0天)，在肿瘤尺寸达到直径5～10mm后，开始ad-reic和抗pd-1抗体的给药。在第14和16天进行ad-reic(1.0
×
109pfu)的肿瘤内给药。在第21天进行抗pd-1抗体(10mg/kg)的腹腔内给药。每周测定2次肿瘤的尺寸，计算出肿瘤体积。
[0161]
将结果示于图9。在给药pbs的对照组中，肿瘤进行性地增殖。在ad-reic组和抗pd-1抗体组中，肿瘤体积减少，确认到抗肿瘤效果。此外，在ad-reic 抗pd-1抗体联用组中，与ad-reic组和抗pd-1抗体组相比确认到强抗肿瘤效果。
[0162]
[实施例5]由reic/dkk-3和酪氨酸激酶抑制剂的联用处理所致的小鼠同种移植模
型中的肿瘤增殖抑制
[0163]
将小鼠肝癌细胞株hep1-6(2.0
×
108个细胞、混悬在200μl的pbs中)接种于c57bl/6小鼠的右侧腹(第0天)，在肿瘤尺寸达到直径5～10mm后，开始ad-reic和酪氨酸激酶抑制剂(tki)的给药。在第14和16天进行ad-reic(1.0
×
109pfu)的肿瘤内给药。在第14、16、21和23天进行tki(索拉非尼(sorafenib)：25mg/kg、乐伐替尼(lenvatinib)：1.5mg/kg)的腹腔内给药。每周测定2次肿瘤的尺寸，计算出肿瘤体积。
[0164]
将结果示于图10a(索拉非尼)和10b(乐伐替尼)。在给药pbs的对照组中，肿瘤进行性地增殖。在ad-reic tki联用组中，与ad-reic组和tki组相比确认到强抗肿瘤效果。
[0165]
[实施例6]由reic/dkk-3和酪氨酸激酶抑制剂所致的肿瘤增殖抑制(体外)
[0166]
在不存在或存在tki(索拉非尼：1μg/ml、瑞戈非尼：0.2μg/ml、乐伐替尼：0.06μg/ml)的条件下、在不共存或共存ad-lac z(50moi)或ad-reic(50moi)的条件下将hepa1-6细胞培养72小时。使用上述的mtt分析对细胞存活率进行评价，将结果以平均值
±
标准偏差(n＝9)的形式表示(**p《0.01)。
[0167]
将结果示于图11。如图11所示，在利用ad-reic(50moi)和tki进行处理的情况下，肝癌细胞株的细胞存活率减少。与利用ad-lacz tki进行处理的情况相比时，该减少率在索拉非尼的情况下为72.2
±
0.1％、在瑞戈非尼的情况下为76.2
±
0.0％、在乐伐替尼的情况下为31.8
±
0.3％。
[0168]
工业实用性
[0169]
reic/dkk-3基因和抗肿瘤剂的联用作为新的癌症治疗药是有用的。
[0170]
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接通过引用并入本说明书中。