预防、缓解或治疗肝损伤的组合物和方法与流程

1.本发明涉及一种预防、缓解或治疗肝损伤的组合物以及预防、缓解或治疗肝损伤的方法。


背景技术：

2.非酒精性脂肪肝病(nafld)的特征是代谢紊乱的肝脏疾病，从简单的脂肪变性，到非酒精性脂肪性肝炎，这是一种侵略性的组织形式，最终导致晚期纤维化和肝硬化。在大多数流行病学研究中，非酒精性脂肪肝病的全球患病率据估计为24-30％，并与肥胖症和代谢综合征同步增长。
3.最近，人们越来越关注识别和了解肠道菌群在各种代谢疾病中的具体作用。肠道失调是指肠道菌群与正常菌群相比的异常变化，与产生有益短链脂肪酸(scfa)的细菌减少、胆汁酸组成的变化、对脂多糖(lps)的免疫反应的激活、乙醇生产细菌过度生长导致的乙醇产量增加、以及磷脂酰胆碱转化为胆碱和三甲胺有关。已知，影响肠道-肝脏轴的肠道菌群的变化有助于慢性肝病的发展，如非酒精性脂肪肝病和肝硬化，以及晚期纤维化。然而，恢复在疾病状态下被富集或耗尽的大量肠道菌群并不总是能缓解疾病的严重程度。因为疾病状态下的肠道菌群的变化可能是由疾病诱发的生理变化的结果，而不是原因。
4.因此，需要一种有效的预防、治疗和诊断非酒精性脂肪肝病的方法，这种方法可以确定非酒精性脂肪肝病的组织学严重程度并很好地定义肠道菌群的变化。


技术实现要素：

5.技术问题
6.本发明旨在解决上述问题，其目的是提供一种用于预防、缓解或治疗肝损伤，例如非酒精性脂肪肝的组合物。
7.技术方案
8.本发明的一种实施方式涉及一种用于预防、缓解或治疗肝损伤的组合物，包括瘤胃球菌属(ruminococcus spp.)菌株。
9.本发明的另一种实施方式涉及一种用于培养瘤胃球菌属菌株的包含碳源和氮源的组合物。
10.本发明的另一种实施方式涉及一种预防、缓解或治疗肝损伤的方法，包括将根据本发明的预防、缓解或治疗肝损伤的组合物施用于有需要的受试者。
11.下面，将更详细地描述本发明。
12.本发明的一种实施方式涉及一种用于预防、缓解或治疗肝损伤的组合物，包含瘤胃球菌属菌株。该组合物可以是药物组合物或食品组合物。该组合物可进一步包含丁酸。
13.肝损伤可以是选自由脂肪肝、肝炎、肝纤维化和肝硬化所组成的组中的一种或多种。肝损伤可以是非酒精性肝损伤。具体来说，肝炎可以是非酒精性脂肪性肝炎，而脂肪肝可以是非酒精性脂肪肝。非酒精性脂肪肝可以是非肥胖型非酒精性脂肪肝，肥胖型非酒精
性脂肪肝，或糖尿病型非酒精性脂肪肝，但不限于此。糖尿病型非酒精性脂肪肝可能是由2型糖尿病引起的。
14.2型糖尿病患者伴有非酒精性脂肪性肝炎(nash)的几率为40％，且与没有患有2型糖尿病的非酒精性脂肪肝患者相比，患有非酒精性脂肪肝的2型糖尿病患者的非酒精性脂肪性肝炎(80.2％相对于64.4％；p《0.001)和肝纤维化(40.3％相对于17.0％；p《0.001)的发病率更高。因此，有必要为患有2型糖尿病的非酒精性脂肪肝患者开发一种治疗剂。伴有2型糖尿病的肝损伤很难治疗，因为其预后比没有患有2型糖尿病的情况要差，然而，根据本发明的组合物可以治疗伴有2型糖尿病的肝损伤。
15.该组合物可以独立于胰岛素而预防、缓解或治疗肝损伤。在本实施例中，由于使用具有胰岛素抗性的动物模型确认根据本发明的组合物的肝损伤效果，肝损伤得到了明显的缓解，因此，确认根据本发明的组合物可以独立于胰岛素而缓解和治疗肝损伤。
16.根据本发明的组合物，通过施用于具有肝损伤的受试者，显示出明显改善的治疗肝损伤的效果。患有肝损伤的受试者可具有以下(1)至(5)中的一种或多种特征。
17.(1)血液alt浓度增加的情况，例如，血液alt浓度超过正常对照组的血液alt浓度的1倍，1.1倍或更多，1.2倍或更多，1.3倍或更多，1.4倍或更多，1.5倍或更多，1.6倍或更多，1.7倍或更多，1.8倍或更多，1.9倍或更多，2倍或更多，2.1倍或更多，2.2倍或更多，2.3倍或更多，2.4倍或更多，2.5倍或更多，2.6倍或更多，2.7倍或更多，2.8倍或更多，2.9倍或更多，3倍或更多，3.5倍或更多，4倍或更多，4.5倍或更多，5倍或更多，5.5倍或更多，6倍或更多，6.5倍或更多，7倍或更多，7.5倍或更多，8倍或更多，8.5倍或更多，9倍或更多，9.5倍或更多，或10倍或更多。
18.(2)血液ast浓度增加的情况，例如，血液ast浓度超过正常对照组的血液ast浓度的1倍，1.1倍或更多，1.2倍或更多，1.3倍或更多，1.4倍或更多，1.5倍或更多，1.6倍或更多，1.7倍或更多，1.8倍或更多，1.9倍或更多，2倍或更多，2.1倍或更多，2.2倍或更多，2.3倍或更多，2.4倍或更多，2.5倍或更多，2.6倍或更多，2.7倍或更多，2.8倍或更多，2.9倍或更多，3倍或更多，3.5倍或更多，4倍或更多，4.5倍或更多，5倍或更多，5.5倍或更多，6倍或更多，6.5倍或更多，7倍或更多，7.5倍或更多，8倍或更多，8.5倍或更多，9倍或更多，9.5倍或更多，10倍或更多。
19.(3)盲肠内次级胆汁酸浓度降低的情况，例如，盲肠内次级胆汁酸浓度低于正常对照组的盲肠内次级胆汁酸浓度的1倍、0.9倍或更低、0.8倍或更低、0.7倍或更低、0.6倍或更低、0.5倍或更低、0.4倍或更低、0.3倍或更低、0.2倍或更低或0.1倍或更低。
20.(4)纤维化标志基因表达的增加情况，例如，纤维化标志基因的表达超过正常对照组的纤维化标志基因的表达的1倍，1.1倍或更多，1.2倍或更多，1.3倍或更多，1.4倍或更多，1.5倍或更多，1.6倍或更多，1.7倍或更多，1.8倍或更多，1.9倍或更多，2倍或更多，2.1倍或更多，2.2倍或更多，2.3倍或更多，2.4倍或更多，2.5倍或更多，2.6倍或更多，2.7倍或更多，2.8倍或更多，2.9倍或更多，3倍或更多，3.5倍或更多，4倍或更多，4.5倍或更多，5倍或者更多，5.5倍或更多，6倍或更多，6.5倍或更多，7倍或更多，7.5倍或更多，8倍或更多，8.5倍或更多，9倍或更多，9.5倍或更多，10倍或更多，11倍或更多，12倍或更多，13倍或更多，14倍或更多，15倍或更多，16倍或更多，17倍或更多，18倍或更多，19倍或更多，或20倍或更多，其中纤维化标志基因可以是选自由col1a1、timp1和α-sma所组成的组中的一种或多
种。
21.(5)肝脏重量与体重的比率升高的情况，例如，肝脏重量与体重的比率超过正常对照组的肝脏重量与体重的比率的1倍、1.1倍或更多、1.2倍或更多、1.3倍或更多、1.4倍或更多、1.5倍或更多、1.6倍或更多、1.7倍或更多、1.8倍或更多、1.9倍或更多、2倍或更多，2.1倍或更多，2.2倍或更多，2.3倍或更多，2.4倍或更多，2.5倍或更多，2.6倍或更多，2.7倍或更多，2.8倍或更多，2.9倍或更多，或3倍或更多。
22.正常对照组是指无肝损伤的对照组。
23.此外，受试者的肝损伤可以是选自由脂肪肝、肝炎、肝纤维化和肝硬化所组成的组中的一种或多种。肝损伤可以是非酒精性肝损伤。具体来说，肝炎可以是非酒精性脂肪性肝炎，且脂肪肝可以是非酒精性脂肪肝。非酒精性脂肪肝可以是非肥胖型非酒精性脂肪肝、肥胖型非酒精性脂肪肝或糖尿病型非酒精性脂肪肝，但不限于此。
24.根据本发明的组合物可被施用于患有糖尿病的受试者，特别是根据本发明的组合物可独立于胰岛素预防、缓解或治疗肝损伤，因此，可被施用于患有2型糖尿病的受试者。
25.在本实施例中，由于确认根据本发明的组合物治疗肝损伤，例如非酒精性脂肪肝的效果，诸如降低血液alt浓度的能力、降低血液ast浓度的能力、降低肝脏重量与体重的比率的能力等治疗效果，都明显优于无2型糖尿病的模型中显示的治疗效果，这意味着根据本发明的组合物具有优秀的治疗效果，尤其对2型糖尿病受试者。
26.特别地，在2型糖尿病受试者中的治疗效果更为出色，且胰岛素抗性的差异在与瘤胃球菌属缓解或治疗肝损伤有关的敏感性差异中起着重要作用。
27.根据本发明的组合物可被施用于患有肝损伤的受试者，以产生以下(1)至(5)中的一种或多种特征。
28.(1)降低血液alt浓度，例如，当施用该组合物时，基于未施用该组合物的对照组的100％血液alt浓度，血液alt浓度低于100％，99％或更低，98％或更低，97％或更低、96％或更低，95％或更低，94％或更低，93％或更低，92％或更低，91％或更低，90％或更低，80％或更低，70％或更低，65％或更低，60％或更低，59％或更低，58％或更低，50％或更低，45％或更低，或40％或更低(作为一个实例，在图1b中，当共同施用mcd和粪便瘤胃球菌(ruminococcus faecis)菌株时，与单一施用mcd相比，显示出39.21％的alt水平)。
29.(2)降低血液ast浓度，例如，当施用该组合物时，基于未施用该组合物的对照组的100％血液ast浓度，血液ast浓度低于100％，99％或更低，98％或更低，97％或更低，96％或更低，95％或更低，94％或更低，93％或更低，92％或更低，91％或更低。90％或更低，80％或更低，70％或更低，65％或更低，64％或更低，63％或更低，62％或更低，61％或更低，60％或更低，或59％或更低(作为一个实例，在图1b中，当共同施用mcd和粪便瘤胃球菌菌株时，与单一施用mcd相比，显示出57.52％的ast水平)。
30.(3)升高次级胆汁酸(例如，盲肠次级胆汁酸)浓度，例如，当施用组合物时，基于未施用该组合物的对照组的100％次级胆汁酸浓度，次级胆汁酸浓度超过100％、105％或更多、110％或更多、115％或更多、120％或更多、125％或更多、130％或更多、135％或更多、140％或更多、145％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多，或200％或更多(作为一个实例，在图1i中，当共同施用mcd和粪便瘤胃球菌菌株时，与单一施用mcd相比，显示217.50％的lca浓度和143.37％的dca浓度)。
31.(4)减少纤维化基因的表达，例如，当施用该组合物时，基于未施用该组合物的对照组表达的100％，纤维化相关基因，例如col1a1、timp1和α-sma中的一种或多种的表达低于100％，99％或更低，98％或更低，97％或更低，96％或更低，95％或更低，94％或更低，93％或更低，92％或更低，91％或更低，90％或更低，80％或更低，78％或更低，75％或更低，70％或更低，65％或更低，或60％或更低(作为一个实例，在图1h中，当共同施用mcd和粪便瘤胃球菌菌株时，与单一施用mcd相比，显示90.60％col1a1表达，77.17％α-sma表达，58.50％timp1表达)。
32.(5)降低肝脏重量与体重的比率，例如，当施用该组合物时，基于未施用该组合物的对照组的100％肝脏重量与体重的比率，肝脏重量与体重的比率少于100％，99％或更低，98％或更低，97％或更低，96％或更低，95％或更低，94％或更低，93％或更低，92％或更低，91％或更低，90％或更低，89％或更低，88％或更低，或87％或更低(作为一个实例，在图1g中，当共同施用mcd和粪便瘤胃球菌菌株时，与单一施用mcd相比，显示86.27％的肝脏比率)。
33.未施用该组合物的对照组是指具有相同疾病，但未对其施用根据本发明的组合物的非施用组。
34.次级胆汁酸可以是选自由脱氧胆酸(dca)、石胆酸(lca)和熊去氧胆酸(udca)组成的组中的一种或多种。
35.纤维化基因可以是选自由col1a1、timp1和α-sma组成的组中的一种或多种。
36.根据本发明的组合物可被施用于患有肝损伤和具有胰岛素抗性的受试者，例如，患有2型糖尿病型肝损伤的受试者，并产生以下(1)至(3)中的一种或多种特征：
37.(1)与无胰岛素抗性的对照组相比，alt水平的降低比率超过1倍，1.1倍或更多，1.2倍或更多，1.3倍或更多，1.4倍或更多，1.5倍或更多，1.6倍或更多，1.7倍或更多，1.8倍或更多，1.9倍或更多，2倍或更多，2.1倍或更多，2.2倍或更多，2.3倍或更多，2.4倍或更多，2.5倍或更多，或2.6倍或更多。
38.(2)与无胰岛素抗性的对照组相比，ast水平的降低比率超过1倍，1.1倍或更多，1.2倍或更多，1.3倍或更多，1.4倍或更多，1.5倍或更多，1.6倍或更多，1.7倍或更多，1.8倍或更多，1.9倍或更多，2倍或更多，2.1倍或更多，或2.2倍或更多。
39.(3)与无胰岛素抗性的对照组相比，肝脏重量与体重的比率的降低比率超过1倍，1.1倍或更多，1.2倍或更多，1.3倍或更多，1.4倍或更多，1.5倍或更多，2倍或更多，3倍或更多，4倍或更多，5倍或更多，6倍或更多，7倍或更多，8倍或更多，9倍或更多，或10倍或更多。
40.在本发明中，术语“活性成分”是指可以单独显示所需活性或与本身没有活性的载体一起显示活性的成分。
41.在本发明中，术语“预防”是指抑制或延缓患病、紊乱或疾病的发生。当在一个预定的时期内，患病、紊乱或疾病的发生被抑制或延迟时，可以认为预防完成。
42.在本发明中，术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、减轻、抑制或延迟特定的患病、紊乱和/或疾病或根据疾病的症状，并降低一种或多种症状或特征的严重程度或发病率。
43.本发明的药物组合物除了活性成分外，还可以进一步包含显示相同或类似功能的一种或多种活性成分。
44.此外，根据本发明的药物组合物可以按照本发明相关领域技术人员可以明确进行的方法，以单位剂量形式制备，或通过插入多剂量容器制备，或通过使用药学上可接受的载体进行配制。在本发明中，术语“载体”是指便于将化合物添加到细胞或组织中的化合物，术语“药学上可接受的”是指生理上可接受的组合物，当施用于人时，一般不会引起过敏反应，如胃肠道紊乱、头晕或类似反应。
45.药学上可接受的载体通常用于配制，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等，但不限于此。
46.此外，根据本发明的药物组合物除了成分外，还可以进一步包括添加剂，如填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。在本发明中，药物组合物中所包含的添加剂的含量可以不受特别限制，可以在普通配方中使用的含量范围内适当调整。
47.此外，根据本发明的药物组合物可以被配制成口服制剂。口服制剂的非限制性实施例可包括片剂、糖锭、锭剂、水悬浮液、油悬浮液、配制粉末、颗粒、乳剂、硬胶囊、软胶囊、糖浆或酏剂等。为了配制根据本发明的口服药物组合物，可使用粘合剂如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂如磷酸二钙；分裂剂，如玉米淀粉或红薯淀粉；硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠等，还可使用甜味剂、调味剂、糖浆等。此外，在胶囊的情况下，除了上述物质外，还可以进一步使用液体载体，如脂肪油等。
48.在本发明中，术语“赋形剂”是指不是治疗剂的任何物质，是指用作递送治疗剂的载体或介质或添加到药物组合物中的物质。因此，它可以改善处理和储存特性，或允许和促进组合物的剂量单位形成。
49.根据本发明的药物组合物可以通过配制成各种形式来使用，例如包括液体、悬浮液、粉末、颗粒、片剂、胶囊、丸剂、提取物、乳剂、糖浆、气溶胶等的口服制剂，以及无菌注射溶液的注射液，其可以口服，或通过包括静脉内、腹膜内、皮下、直肠内和局部给药等各种途径给药。在本发明中，术语“口服给药”是指将活性成分施用于胃肠道吸收，也就是准备消化的物质。
50.根据本发明的药物组合物的优选剂量可以有各种范围，取决于病人的情况和体重、年龄、性别、健康状况、饮食结构的特殊性、制剂的特性、疾病程度、组合物的给药时间、给药方法、给药期或间隔期、排泄率和药物形式，且可由本领域技术人员适当地选择。
51.在本发明中，术语“药物组合物的有效剂量”是指足以治疗特定症状的组合物的有效成分的量。这可能取决于药物组合物的配制方法、给药方法、给药时间和/或给药途径，并且这可能取决于各种因素，包括通过施用药组合物所要达到的反应的类型或程度，被施用受试者的类型、年龄、体重、一般健康状况、疾病的症状或程度、性别、饮食、排泄，以及同时或一次对相应受试者使用的药物或其他组合物的成分，以及制药领域已知的类似因素，本领域技术人员可随时确定并开具治疗所需的有效剂量。
52.根据本发明的药物组合物的给药可每天给药一次，也可分数次给药。该组合物可作为单独的治疗剂给药，或与其他治疗剂联合给药，并可与常规治疗剂依次或同时给药。考虑到上述所有因素，可以用最小的量获得最大的效果而不产生副作用的方式给药。
53.例如，根据本发明的组合物可按每日剂量0.001至10,000mg，0.001至5000mg，0.001至1000mg，0.001至500mg，0.001至300mg，0.001至100mg，0.001至50mg，0.001至30mg，
0.001至10mg，0.001至5mg，0.001至1mg，.001至0.5mg，0.001至0.1mg，0.001至0.05mg，0.001至0.01mg，0.01至10000mg，0.01至5000mg，0.01至1000
㎎
，0.01至500mg，0.01至300mg，0.01至100mg，0.01至50mg，0.01至30mg，0.01至10mg，0.01至5mg，0.01至1mg，0.01至0.5mg，0.01至0.1mg，0.01至0.05mg，0.1至10000mg，0.1至5,000mg，0.1至1,000mg，0.1至500mg，0.1至300mg，0.1至200mg，0.1至100mg，0.1至50mg，0.1至30mg，0.1至10mg，0.1至5mg，0.1至1mg，0.1至0.5mg，1至10000mg，1至5,000mg，1至1000mg，1至500mg，1至300mg，1至200mg，1至100mg，1至50mg，1至10mg，1至5mg，10至10000mg，10至5000mg，10至1000mg，10至500mg，10至300mg，10至200mg，10至100mg，10至50mg，10至40mg，10至30mg，10至20mg，100至10000mg，100至5000mg，100至1000mg，100至500mg，100至300mg，或100至200mg每1kg体重，但不限于此。作为一个实例，根据本发明的组合物的日剂量可以是，基于成年患者的口服给药，0.001至10克/天，0.001至5克/天，0.01至10克/天，或0.01至5克/天。此外，如有必要，每天的总剂量可被分散并连续或不连续地给药。
54.根据本发明的组合物可进一步包括冻干保护剂。冻干保护剂可包括选自由单糖、双糖、多糖、碳水化合物、矿物质、氨基酸、蔗糖、磷酸钙、精氨酸、氯化钠、果糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和海藻糖所组成的组中的一种或多种。
55.蔗糖可按100至300g/l、100至250g/l、100至200g/l、150至300g/l、150至250g/l、150至200g/l、200至300g/l或200至250g/l加入冻干保护剂，且作为一个实例，可按200g/l加入。
56.磷酸钙可以5-20g/l、5-15g/l、5-12g/l、5-11g/l、7-20g/l、7-15g/l、7-12g/l、7-11g/l、10-20g/l、10-15g/l、10-12g/l或10-11g/l的浓度加入冻干保护剂中，作为一个实例，可以按10.5g/l加入。
57.氨基酸可以1-10g/l、1-8g/l、1-6g/l、1-5g/l、3-10g/l、3-8g/l、3-6g/l、3-5g/l、4-10g/l、4-8g/l、4-6g/l或4-5g/l的浓度加入冻干保护剂中，且作为一个实例，可以按4g/l加入。
58.氯化钠可按0.1-5g/l、0.1-3g/l、0.1-1g/l、0.5-5g/l、0.5-3g/l或0.5-1g/l的浓度加入冻干保护剂中，且作为一个实例，可按0.8g/l加入。
59.根据本发明的瘤胃球菌属菌株可以是粪便瘤胃球菌。作为一个实例，该瘤胃球菌属菌株可以是具有登录号kctc号5757的粪便瘤胃球菌。在本说明中，具有登录号kctc号5757的粪便瘤胃球菌可以用粪便瘤胃球菌kbl1028表示。
60.该菌株可在碳源浓度为5至30％(w/v)、氮源浓度为50至90％(w/v)、矿物质浓度为5至15％(w/v)、氨基酸浓度为0.1至10％(w/v)的培养基中，培养8小时、培养9小时、培养10小时、培养11小时、培养12小时、培养13小时或培养14小时后，继续生长。
61.该菌株在具有根据表3的组成的fmk1028培养基中具有优异的培养效率。例如，该菌株的特点是，在具有根据表3的组成的fmk1028培养基中培养后的吸光度高于在选自由ybhi培养基、gam培养基、mrs培养基、bl培养基和rcm培养基所组成的组中的一种或多种中的吸光度。作为一个实例，该菌株可以是在具有根据表3的组成的fmk1028培养基中培养14小时后，在ybhi培养基中培养时每单位体积的活细胞数为10倍或更多，50倍或更多，100倍或更多，150倍或更多，200倍或更多，250倍或更多，300倍或更多，350倍或更多，400倍或更多，450倍或更多，500倍或更多，550倍或更多，或600倍或更多。
62.本发明的其他实施方式涉及一种用于培养瘤胃球菌属菌株的组合物，包含碳源和氮源。碳源可以是选自由葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜和半乳糖所组成的组中的一种或多种。氮源可以是选自由酵母提取物、大豆蛋白胨、脱脂牛奶、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、马铃薯蛋白胨、豌豆蛋白胨、小麦蛋白胨、蚕豆蛋白胨、木瓜蛋白酶大豆蛋白胨和羽扇豆蛋白胨所组成的组中的一种或多种。
63.本发明的其他实施方式涉及用于培养瘤胃球菌属菌株的组合物，包括碳源和氮源。碳源的浓度可以是5-30％(w/v)，氮源的浓度可以是50-90％(w/v)。该瘤胃球菌属菌株如上所述。
64.碳源可以包括一种或多种选自由葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜和半乳糖所组成的组。
65.氮源可包括选自由酵母提取物、大豆蛋白胨、脱脂牛奶、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、马铃薯蛋白胨、豌豆蛋白胨、小麦蛋白胨、蚕豆蛋白胨、木瓜蛋白酶大豆蛋白胨和羽扇豆蛋白胨所组成的组中的一种或多种。
66.用于培养瘤胃球菌属菌株的组合物可在培养瘤胃球菌属菌株8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时或14小时后促进生长。
67.培养瘤胃球菌属菌株的组合物可进一步包含选自由矿物质、氨基酸、维生素、核酸和无机盐所组成的组中的一种或多种。
68.矿物质可包括选自由乙酸钠、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、硫酸镁和硫酸锰所组成的组中的一种或多种。
69.氨基酸可包括l-半胱氨酸、l-亮氨酸、l-异亮氨酸、l-缬氨酸、l-色氨酸、l-苏氨酸、l-苯丙氨酸和l-甲硫氨酸。
70.碳源的浓度可以是5-30％(w/v)，氮源的浓度可以是50-90％(w/v)，矿物质的浓度可以是5-15％(w/v)，以及氨基酸的浓度可以是0.1-10％(w/v)。
71.本发明的其他实施方式涉及一种培养瘤胃球菌属菌株的方法，包括将瘤胃球菌属菌株接种到根据本发明的用于培养瘤胃球菌属菌株的组合物中，并进行培养。
72.培养方法可以在培养瘤胃球菌属菌株8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时或14小时后促进生长。
73.培养可以是静止培养、补料分批培养或分批培养，但不限于此。
74.本发明的其他实施方式涉及一种预防、缓解或治疗肝损伤的方法，包括向有需要的受试者施用根据本发明的预防、缓解或治疗肝损伤的组合物。该组合物可包括瘤胃球菌属菌株。用于预防、缓解或治疗肝损伤的组合物、瘤胃球菌属菌株等如上所述。受试者是患有肝损伤的受试者，并且该患有肝损伤的受试者如上所述。例如，患有肝损伤的受试者可以是具有胰岛素抗性的受试者，并且作为一个实例，可以是具有糖尿病的受试者，具体地说，是患有2型糖尿病的受试者。
75.有益效果
76.本发明的预防或治疗的药物组合物可以有效地用于治疗肝损伤，例如非酒精性脂肪肝病。
附图说明
77.图1a是显示在mcd饮食诱导的肝损伤动物模型中，根据粪便瘤胃球菌的施用来研究治疗肝损伤的效果的实验过程的图。
78.图1b是显示在mcd饮食诱导的肝损伤动物模型中，根据粪便瘤胃球菌的施用测量alt和ast的结果的图。
79.图1c至图1e是显示mcd饮食诱导的肝损伤的组织学严重程度在喂食粪便瘤胃球菌的小鼠中得到明显缓解的图，以及
80.图1c是显示通过h&e(顶部)和天狼星红(底部)染色方法，根据粪便瘤胃球菌的施用，肝脏组织得到缓解的图。
81.图1d是显示用非酒精性脂肪肝病活动性评分来量化施用粪便瘤胃球菌的病理缓解的图。
82.图1e是显示通过施用粪便瘤胃球菌缓解肝脏中胶原蛋白分布的图。
83.图1f是显示通过mcd饮食改变体重。
84.图1g是显示与对照施用组小鼠(mcd)相比，施用粪便瘤胃球菌(mcd 粪便瘤胃球菌)时体重中的肝脏比的图。
85.图1h是显示根据施用粪便瘤胃球菌，纤维化的产生和增殖的标志得到缓解的图。
86.图1i是显示通过mcd饮食减少的次级胆汁酸(dca和lca)的局部水平通过粪便瘤胃球菌的治疗而增加的图。
87.图2a是显示在cdahfd饮食诱导的肝损伤动物模型中，根据粪便瘤胃球菌的施用来研究治疗肝损伤的效果的实验过程的图。
88.图2b是显示在cdahfd饮食诱导的肝损伤动物模型中，根据粪便瘤胃球菌的施用来降低alt水平的图。
89.图2c是显示在cdahfd饮食诱导的肝损伤动物模型中，根据粪便瘤胃球菌的施用来降低ast水平的图。
90.图2d是显示在cdahfd饮食诱导的肝损伤动物模型中，根据粪便瘤胃球菌施用的肝脏重量与体重比率的图。
91.图3a是显示在遗传性瘦素缺乏的动物模型中，根据粪便瘤胃球菌的施用来研究治疗肝损伤的效果的实验过程的图。
92.图3b是显示在遗传性瘦素缺乏的动物模型中，根据粪便瘤胃球菌的施用，降低alt水平的图。
93.图3c是显示在遗传性瘦素缺乏的动物模型中，根据粪便瘤胃球菌的施用，降低ast水平的图。
94.图3d是显示在遗传性瘦素缺乏的动物模型中，根据粪便瘤胃球菌的施用，降低肝脏重量与体重比率的图。
95.图3e是显示在遗传性瘦素缺乏的动物模型中，通过ipgtt测量的空腹血清胰岛素水平和胰岛素抗性的图。
96.图4a是显示在肝纤维化病组中，布氏瘤胃球菌(ruminococcus bromii)明显减少的图。
97.图4b是显示根据施用布氏瘤胃球菌的肝脏体重比水平的图。
98.图4c是显示根据施用布氏瘤胃球菌的alt水平的图。
99.图5a是显示在ybhi培养基、rcm培养基、bl培养基、mrs培养基、gam培养基或fmk1028培养基中比较粪便瘤胃球菌的培养潜力和细胞形态的结果的图。
100.图5b是显示粪便瘤胃球菌的生长曲线和每单位体积的活细胞数的图。
101.图5c是显示在发酵罐中培养的粪便瘤胃球菌的生长曲线和活细胞数的图。
具体实施方式
102.下面，本发明将通过以下实施例进行更详细的描述。然而，这些实施例只是为了说明本发明，但本发明的范围不受这些实施例的限制。
103.实施例1：利用实验动物进行肝损伤治疗的测试
104.(1)实验动物的准备
105.粪便瘤胃球菌(kctc号5757[jcm号15917])购自韩国生命工学研究院，韩国典型培养物保藏中心(kctc,jeollabuk-do,republic of korea)，在ybhi培养基中厌氧培养，24小时后收集，用pbs( 0.5％半胱氨酸)清洗两次，然后口服。6周龄的雄性c57bl/6n小鼠(orient bio,gyeonggi-do,republic of korea)是根据大学指南在首尔国立大学的普通动物设施中饲养的实验动物，所有动物实验都得到了首尔国立大学机构动物保护和使用委员会的批准。
[0106]
为了进行mcd饮食诱导的nafld动物模型实验，在小鼠适应标准食物饮食1周后，将链霉素以1g/l的浓度处理加入饮用水中，用于肠道内粪便瘤胃球菌的定居，并饮用水1周。此后5周，同时给小鼠喂食蛋氨酸和胆碱缺乏的l-氨基酸饮食(research diet,new brunswick,nj,usa；目录编号：a02082002b)，每天口服一种悬浮的粪便瘤胃球菌，使其在200μl pbs或对照pbs(假)中含有109cfu(图1a)。给药5周后，对小鼠进行安乐死，并进行生化分析、解剖分析、确认肝纤维化发生和增殖的标志物的表达，以及胆汁酸分析。
[0107]
(2)生化分析
[0108]
用fuji dri-chem 3500i生化分析仪(fujifilm,tokyo,japan)测量血清丙氨酸转氨酶(alt)和天冬氨酸转氨酶(ast)水平。alt和ast的测量结果见图1b。
[0109]
(3)解剖分析
[0110]
安乐死后，肝脏样本被切除并固定在10％的福尔马林溶液中(sigma-aldrich，st.louis,mo,usa)。在logone生物趋同性研究基金会(seoul,republic of korea)进行了苏木精和曙红(h&e)以及天狼星红染色。使用pannoramic观察仪(3dhistech,budapest,hungary)分析了染色后的全切片图像。为了计算胶原蛋白的成比例区域，每组随机选择8张图像，使用imagej软件(nih,bethesda,md,usa；http://imagej.nih.gov/ij)进行分析。
[0111]
此外，对于肝脏与体重的比率，测量施用粪便瘤胃球菌5周的小鼠的体重和肝脏的重量，然后计算肝脏重量与体重的比率。测量小鼠体重的结果如图1f所示，肝脏重量与体重的比率如图1g所示。
[0112]
(4)确认肝纤维化发生和增殖的标志物的表达
[0113]
使用easy-spin
tm
总rna提取试剂盒(intron biotechnology,gyeonggi-do,republic of korea)提取肝脏样本的总rna，并使用高容量rna-到-cdna试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)逆转录成cdna。使用sybr
tm green qpcr master mix
(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)和applied biosystems
tm quantstudio
tm 6flex qpcr系统(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)进行定量pcr。所用引物的序列如下。
[0114]
表1
[0115][0116]
(5)胆汁酸分析
[0117]
提取小鼠盲肠后，加入体积比为10倍的80％甲醇并混合。为了提取胆汁酸，用超声机将样品粉碎3分钟，然后在4℃条件下保存24小时。然后，在离心得到的上清液中加入100％甲醇1ml，用打珠机在频率15和30分钟的条件下进行二次提取。溶解胆汁酸的甲醇在30℃和24小时的条件下通过真空干燥蒸发所有液体物质，剩余的固体物质用55％的甲醇溶解。将提取的胆汁酸置于专用管中，然后用q-tof质谱仪(waters technologies,milford,ma,usa)进行测定。
[0118]
(6)实验结果
[0119]
当施用(mcd 粪便瘤胃球菌)粪便瘤胃球菌时，与对照组施用小鼠(mcd)相比，alt和ast的水平下降(图1b)。
[0120]
由于解剖学和组织学分析，mcd饮食诱发的nafld的组织学严重程度在用粪便瘤胃球菌喂养的小鼠中得到明显改善(图1c至图1e)。如先前文献所述，mcd饮食导致体重急剧下降，施用粪便瘤胃球菌并不影响体重(图1f)。然而，当施用粪便瘤胃球菌(mcd 粪便瘤胃球菌)时，与对照施用小鼠(mcd)相比，体重中的肝脏比减少(图1g)。
[0121]
由于确认肝纤维化发生和增殖的标志物的表达，肝纤维化发生和增殖的标志物在喂食粪便瘤胃球菌的小鼠中得到明显缓解(timp1,p＝0.0018；α-sma,p＝0.0330)(图1h)。
[0122]
在生化和组织学肝损伤标志物变化的同时，次级胆汁酸(dca和lca)的局部水平也因mcd饮食而减少，并因粪便瘤胃球菌的治疗而增加(图1i)。
[0123]
这样的结果表明，在粪便瘤胃球菌mcd饮食小鼠模型中，对肝纤维化有保护作用。
[0124]
实施例2：使用动物模型的肝损伤治疗测试
[0125]
为了证实粪便瘤胃球菌对非酒精性脂肪肝的肝损伤的缓解作用，采用了防止体重下降且不显示胰岛素抗性的胆碱-缺乏、l-氨基酸定义的高脂肪饮食(cdahfd)饮食小鼠模型。
[0126]
胆碱在肝细胞中以vldl的形式积累和释放甘油三酯方面起作用，但cdahfd饮食中缺乏胆碱，因此它是饮食模型，其中高脂肪饮食中的甘油三酯在肝细胞中积累，诱发脂肪
肝，与mcd模型不同，体重不会下降，肝纤维化的诱发程度更严重。然而，已知cdahfd模型并不诱发胰岛素抗性。
[0127]
具体来说，如图2a所示，在c57bl/6n小鼠适应标准食物饮食一周后，将链霉素(1g/l)溶解在饮用水中，喂养一周，用于肠道内粪便瘤胃球菌的定居。此后8周，喂食缺乏胆碱、含有60％的脂肪的cdahfd饮食(胆碱-缺乏、l-氨基酸定义的高脂肪饮食)，并且每天口服施用200μl的粪便瘤胃球菌悬浮液，使其在200μl的pbs或对照pbs(假手术组)中加入109个cfu。给药8周后，小鼠执行安乐死，进行血清生化分析和解剖分析。作为生化分析，alt和ast分析方式与实施例1相同，且肝脏与体重的比率的测量方式与实施例1相同。
[0128]
如图2b至图2d所示，根据粪便瘤胃球菌的施用，alt和ast水平降低(图2b和图2c)，但通过施用粪便瘤胃球菌，肝脏与体重的比率没有明显差异(图2d)。这意味着粪便瘤胃球菌对cdahfd喂食诱发的非酒精性脂肪肝损伤有治疗作用，但肝脏与体重的比率没有明显差异，意味着肝脏中积累的脂肪没有明显减少。
[0129]
实施例3：利用遗传性瘦素缺陷模型进行肝损伤治疗测试
[0130]
为了证实在有胰岛素抗性的情况下，粪便瘤胃球菌对非酒精性脂肪肝是否有治疗作用，用引起的自发性糖尿病伴有胰岛素抗性和脂肪肝的遗传性瘦素缺陷(db/db)模型来证实粪便瘤胃球菌对非酒精性脂肪肝病的治疗作用。作为db/db模型的对照组，使用db/m，其相当于db等位基因的杂合子。
[0131]
db/db模型是一个瘦素受体发生突变的模型，肥胖和胰岛素抗性被诱发，导致高血糖，并经常被用作2型糖尿病的模型。已知db/db模型是脂肪变性时被迅速诱导，但其是脂肪性肝炎(nash)和肝纤维化时不容易被诱导。
[0132]
具体来说，如图3a所示，在db/db模型小鼠适应标准食物饮食一周后，将链霉素(1g/l)溶解在饮用水中，喂养一周，用于粪便瘤胃球菌的肠道定居。此后5周，喂食普通饮食，每天口服200μl的粪便瘤胃球菌悬浮液，以便在200μl的pbs或对照pbs(假手术组)中加入109个cfu。给药5周后，小鼠被行安乐死，进行生化分析和解剖分析。作为生化分析，alt和ast的分析方法与实施例1基本相同，且肝脏重量与体重的比率的测量方法也与实施例1基本相同。
[0133]
使用超敏小鼠胰岛素elisa试剂盒(crystal chem,elk grove village,il,usa)测量db/db小鼠通过ipgtt测量的空腹血清胰岛素水平。腹腔内葡萄糖耐量测试确认胰岛素抗性是在服用粪便瘤胃球菌的第3周进行的，在除水以外的饮食限制16小时后，腹腔内注射葡萄糖溶液，使每1kg体重施用1g的葡萄糖。此后，在预定时间用performa血糖仪(roche diagnostics,risch-rotkreuz,switzerland)测量血糖。
[0134]
如图3b至图3d所示，根据粪便瘤胃球菌的施用，alt和ast水平降低(图3b和图3c)，特别是肝脏与体重的比率也明显降低(图3d)。然而，如图3e所示，通过ipgtt测量db/db小鼠的空腹血清胰岛素水平和胰岛素抗性并没有受到粪便瘤胃球菌治疗的影响。
[0135]
在具有胰岛素抗性的db/db模型中，粪便瘤胃球菌也显示出对非酒精性脂肪肝病的治疗作用，这一结果意味着粪便瘤胃球菌以独立于胰岛素的方式对非酒精性脂肪肝病有治疗作用，也意味着它可以有效地用于治疗伴有2型糖尿病的非酒精性脂肪肝病患者。
[0136]
特别是，为了确认根据胰岛素抗性的不同而产生的治疗响应敏感性，选择了db/db模型和cdahfd模型作为比较模型。在cdahfd模型的情况下，非酒精性脂肪肝病是在没有胰
岛素抗性的情况下诱发的，因此与诱发胰岛素抗性的db/db模型相比，它适合于比较根据胰岛素抗性的治疗效果。在mcd模型的情况下，它不适合作为对照来确认根据胰岛素抗性的差异而产生的治疗响应的敏感性，因为它引起身体机能的下降，包括体重的快速下降。
[0137]
如图3b所示，根据施用粪便瘤胃球菌，alt水平降低了约42.98％；如图3c所示，ast水平降低了约41.00％；如图3d所示，肝脏重量与体重的比率降低了约9.43％。考虑到与图2b的cdahfd模型中alt水平降低约16.40％相比，alt水平降低比率约为2.6倍或更多；与图2c的cdahfd模型中ast水平降低约18.18％相比，ast水平降低比率约为2.2倍或更多；在具有胰岛素抗性的动物模型中，肝脏重量与体重的比率明显降低，而在图2d的cdahfd模型中肝脏重量与体重的比率没有明显降低。粪便瘤胃球菌在胰岛素抗性方面有差异，或根据2型糖尿病发生与否的差异，与肝损伤的改善或治疗有关的敏感性有差异，并且在2型糖尿病受试者中表现出明显的优异治疗效果。
[0138]
实施例4：布氏瘤胃球菌的纤维化治疗效果
[0139]
(1)非酒精性脂肪肝组的布氏瘤胃球菌明显减少
[0140]
包括经活组织检查检证实具有非酒精性脂肪肝病的171名受试者和不具有非酒精性脂肪肝病的31名受试者，并对非酒精性脂肪肝病进行了组织学分类。使用qiaamp dna粪便微型试剂盒(qiagen,hilden,germany)提取粪便样本的dna。使用miseq系统(illumina,san diego,ca,usa)进行针对16s rrna基因v4区的测序，并使用qiime
tm
管道(v 1.8.0；http://qiime.org/)对测序数据进行额外分析。如图4a所示，表明在肝纤维化组中，布氏瘤胃球菌明显减少。
[0141]
(2)布氏瘤胃球菌对非酒精性脂肪肝治疗效果的验证
[0142]
接下来，确认在非酒精性脂肪肝病组中显示为明显减少的布氏瘤胃球菌是否对非酒精性脂肪肝有治疗作用。
[0143]
具体来说，布氏瘤胃球菌(atcc编号27255)由atcc(美国典型培养物保藏中心,manassas,va,usa)分发，在改良的pyg培养基中厌氧培养，并在24小时后收集，且用pbs( 0.5％半胱氨酸)清洗两次，然后口服。
[0144]
c57bl/6n小鼠在标准食物饮食中适应环境1周后，将链霉素(1g/l)溶解在饮用水中，喂食1周，以使布氏瘤胃球菌在肠道内定居。此后5周，同时给小鼠喂食蛋氨酸和胆碱缺乏的l-氨基酸饮食(mcd)(research diet,new brunswick,nj,usa；目录编号a02082002b)，每天口服一个悬浮在200μl pbs或对照pbs(假手术组)中的布氏瘤胃球菌悬浮液，使其在200μl pbs或对照pbs(假手术组)中含有109cfu。给药5周后，小鼠执行安乐死，并进行生化分析、解剖分析、确认肝纤维化发生和增殖的标志物的表达，以及进行胆汁酸分析。
[0145]
然而，如图4b至图4c所示，与对照组给药的小鼠(mcd)相比，当施用布氏瘤胃球菌(mcd 布氏瘤胃球菌)时，体重中的肝脏比率和alt水平没有明显变化。
[0146]
布氏瘤胃球菌没有显示出对非酒精性脂肪肝的治疗作用，由此可见，并不是所有在非酒精性脂肪肝病组中显示减少的物种都对非酒精性脂肪肝有治疗作用，特别是，即使与粪便瘤胃球菌属于同一属，也不是所有的物种都对非酒精性脂肪肝有治疗作用。因此，可以看出，非酒精性治疗作用是粪便瘤胃球菌的独特作用。此外，虽然在非酒精性脂肪肝病组中，布氏瘤胃球菌明显减少，但在给药时并没有显示出对非酒精性脂肪肝的任何治疗作用，所以很难预测在非酒精性脂肪肝中施用减少的菌株会导致缓解疾病的严重程度。
[0147]
实施例5：粪便瘤胃球菌的培养和生产
[0148]
(1)最佳培养基探索
[0149]
为了探索粪便瘤胃球菌的最佳培养基(登录号kctc号5757)，确认了在ybhi培养基中的可培养性，ybhi培养基包括市场上的bacto
tm
脑心浸液(bhi)培养基(bd,franklin lakes,nj,usa)、difco
tm
强化梭菌培养基(rcm培养基)(bd,franklin lakes,nj,usa)、mb细胞bl肉汤(bl培养基)(kisan bio,seoul,republic of korea)、difco
tm
乳酸杆菌mrs肉汤(mrs培养基)(bd,franklin lakes,nj,usa)、市场上的mb细胞岐阜厌氧培养基(gam培养基)(kisan bio,seoul,republic of korea)，以及本发明制备的fmk1028培养基。根据培养后的吸光度增加和ph值下降，以及通过显微镜确认的细胞均匀性，对最佳培养基选择的可培养性进行评估。ybhi培养基和fmk1028培养基的组成分别如下表2和表3所示。
[0150]
表2
[0151]
ybhi培养基
[0152]
成分g/lbacto
tm
脑心浸液37酵母提取物5纤维二糖1麦芽糖1l-半胱氨酸0.5
[0153]
表3
[0154]
fmk1028培养基
[0155]
成分g/l葡萄糖10酵母提取物45大豆蛋白胨10乙酸钠3氯化钠5l-半胱氨酸0.5
[0156]
在所有用于最佳培养基探索的介质中，在灭菌前都被调整为ph 6.8。将在ybhi培养基中培养14小时的预培养的粪便瘤胃球菌接种使其在ybhi培养基、rcm培养基、bl培养基、mrs培养基、gam培养基或fmk1028培养基中的最终体积比分别为1％。接种后，在37℃的厌氧条件下，进行静止培养，14小时后，测量培养液的600nm下吸光度和ph值，观察细胞形态。吸光度用orion aquamate 8000光谱仪(thermo scientific,waltham,ma,usa)测量，ph值用sevencompact ph/ion计(mettler toledo,columbus,oh,usa)测量。细胞形态是用optinity kb-320光学显微镜(korea labtech,gyeonggi-do,republic of korea)观察。
[0157]
图5a是比较粪便瘤胃球菌的培养潜力和细胞形态的结果。如图5a所示，培养14小时后的培养液的吸光度为fmk1028培养基最高，然后，高的顺序依次为ybhi培养基、gam培养基、mrs培养基、bl培养基和rcm培养基。培养后的培养液的ph值为fmk1028培养基最低，低的顺序依次为bl培养基、ybhi培养基、mrs培养基、rcm培养基和gam培养基。用显微镜观察到的结果为衍生自fmk1028和gam培养基的细胞均匀性最优异，然后，ybhi培养基中培养的细胞
也很优异。
[0158]
总的来说，在本发明制备的fmk1028培养基中，粪便瘤胃球菌的可培养性最优异。
[0159]
(2)最佳培养基的生长曲线和活细胞数
[0160]
使用具有最优异的粪便瘤胃球菌培养潜力的fmk1028培养基，测量生长曲线和活细胞数。作为对照组，使用ybhi培养基。
[0161]
接种在ybhi培养基中培养14小时的粪便瘤胃球菌的预培养液，以使其在ybhi培养基和fmk1028培养基中的体积比率分别为1％。接种后，在37℃的厌氧条件下，静止培养14小时，测量培养液在600nm处的吸光度，且用生长曲线表示。
[0162]
为测定存活细胞数，将接种在各培养基中的粪便瘤胃球菌培养14小时，然后用gam培养基按10倍连续稀释，收集0.1ml稀释液，铺在gam培养基琼脂平板上，然后在37℃厌氧条件下培养24小时。培养后，对琼脂平板上形成的约30-300个菌落进行计数，并换算成每单位体积培养液的活细胞数(cfu/ml)。测量的生长曲线和每单位体积的活细胞数如图5b所示。图5b中，粪便瘤胃球菌在ybhi培养基中作为对照组培养8小时后达到静止期，显示吸光度为2.55。在fmk1028培养基中培养8小时后，它显示出与ybhi相似的生长曲线，但在培养14小时后继续生长，显示出吸光度为6.18。培养14小时后测量单位体积的活细胞数，结果证实ybhi培养基中的活细胞数是fmk1028培养基中的600倍。
[0163]
(3)使用发酵罐大量培养和粉碎
[0164]
通过使用发酵罐对粪便瘤胃球菌进行大规模培养和粉碎，确认了培养细胞的恢复时间。在8l fmk1028培养基中接种16ml预培养的粪便瘤胃球菌溶液后，在37℃、250rpm的厌氧条件下操作发酵罐(fermentec,chungcheongbuk-do,republic of korea)并进行培养。根据培养时间测量生长曲线和活细胞数，结果显示在图5c。图5c显示通过操作发酵罐培养的粪便瘤胃球菌的生长曲线和活细胞数的结果。
[0165]
如图5c所示，粪便瘤胃球菌在培养8小时后达到静止期，吸光度为8.25，活细胞数为5.15
×
109cfu/ml。在静止期培养11小时后，吸光度降至7.25，活细胞数略有下降，显示为4.95
×
109cfu/ml。与图5b中呈现的静止期培养的结果不同，可以确认，由于使用发酵罐培养，达到静止期的时间缩短为8小时，与烧瓶分批培养14小时的结果相比，静止期的吸光度(6.18
→
8.25)和活细胞数(1.2
×
109cfu/ml
→
5.15
×
109cfu/ml)的测量结果也得到改善。
[0166]
基于上述结果，使用发酵罐对粪便瘤胃球菌进行大量培养。培养8小时后，用2236r高速离心机(labogene,denmark)回收在7,000rpm，40分钟条件下培养的细胞。将回收的细胞放在300毫升的烧杯中，用磁棒和搅拌器将其与冻干保护剂以1：1的重量比混合20分钟。所用冻干保护剂的组成见下表4。将与冻干保护剂混合的细胞在-80℃的超低温冰箱中冷冻24小时，冻干72小时，然后粉碎成粉末状。
[0167]
表4低温保护剂(cpa)
[0168]
成分g/l蔗糖200磷酸氢二钾6磷酸二氢钾4.5l-精氨酸4氯化钠0.8
[0169]
最后，在大量培养和粉碎过程中使用发酵罐测得的活细胞数如下表5所示。
[0170]
表5
[0171]