为基底提供杀生物涂层的装置和方法及所得的涂覆基底与流程

1.本发明涉及抗微生物材料领域，尤其涉及呈现出抗微生物活性的可植入医疗器械以及其他医疗器械。更具体地，本发明涉及用于为基底，例如导管或其他类型的医疗器械或植入物提供包含抗微生物涂层的装置和方法，以及由此获得的经涂覆的基底，其中所述抗微生物涂层包括表面固定化的季铵化合物。


背景技术：

2.可溶性季铵化合物是有效的抗菌化合物，已经被使用了超过70年。这类化合物含有带正电的氮原子和疏水性尾部。
3.细菌具有将自身附着至天然和合成表面的天然能力。一经附着，它们通常便会协作地形成生物膜，这是细菌菌落的薄层，可以覆盖医疗器械的表面，并且带来感染的风险。由于其产生保护性多糖层的能力，它们对免疫系统和所施用的抗生素产生抵抗力。因此，矫形植入物、导管，甚至隐形眼镜都可能成为感染的媒介。值得注意的是，据报道，大约百分之三十的感染发生在植入后不到一个月内，另外百分之三十五发生在植入后一个月至十二个月之间，其余的出现在植入后一年以后。
4.现有的防止微生物粘附的方法是植入物的经涂覆的表面释放抗生素或杀生物性化合物，如银。然而，抗生素在最初的爆发式释放后，便是后续长时间的微小释放会导致细菌耐药性，并且体液中的银离子可能是有毒的，限制了这些方法的临床实施。此外，释放系统会在短时间内耗尽。
5.季铵化合物(qac)是日常消费品中使用的有效阳离子抗菌剂。表面固定化的季铵化合物形成了接触灭杀式抗微生物涂层。当qac分子固定在表面上时，qac的抗微生物功效保持不变，并且不会污染体液。这种接触灭杀式涂层具有广泛的应用潜力，包括但不限于医院的手术器材和防护服、医疗植入物和伤口敷料、水净化、食品包装材料和工业设备。qac的使用已经很流行，因为它们可以方便地并入到涂层系统中。qac在人体内也很稳定，难以代谢，主要以未代谢形式排泄。qac在没有被固定在表面上时，可能是溶血性的，并且对环境有毒。
6.聚乙烯亚胺(pei)是用来制备聚阳离子的有吸引力的聚合物，因为它们含有高密度的伯氨基、仲氨基和叔氨基。因此，pei的季铵化将产生具有高电荷密度的聚合qac。klibanov等人的小组率先对聚(乙烯亚胺)的烷基化进行研究。在用卤代烷(r＝c
6-16
)对pei的氨基进行n-烷基化后，已经获得了一定的杀菌效果。n-烷基化不仅在栓系(tethered)聚合物基团上产生一些正电荷，而且促进了疏水相互作用。n-烷基化的c
6-16-pei经碘甲烷的两次烷基化步骤而具有更高的电荷密度和杀生物功效。由于甲基的小尺寸和碘离子良好的离去性，季铵化程度显著增加，且从而杀生物活性也显著增加。
7.因此，锚定的pei在两步过程中通过氨基的烷基化而通常转化为抗微生物的聚季铵盐。参见例如behlau等人(biomaterials.dec 2011；32(34):8783
–
8796)公开了共价连接到波士顿人工角膜(boston keratoprosthesis)材料的n,n-己基,甲基-聚乙烯亚胺
(hmpei)的生物相容性和抗菌性。发现，与母体聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)和钛相比，hmpei衍生的材料对金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)临床分离株的生物膜形成具有抑制作用。
8.申请人名下的wo2016/043584公开了一种涂覆方法，涉及在聚脲与待涂覆表面接触之前，使形成超支化聚脲的单体“预低聚”成低分子量聚脲，而不是使单体在表面上聚合。通过预低聚反应获得的涂层是稳固、可重复且持久的，并且均匀地覆盖表面。涂层可以容易地设置抗菌剂，包括n,n-烷基化的pei。
9.park等人(biotechnol.prog.2006,22,584-589)开发了基于qac的疏水性聚阳离子体系，可以用作“杀菌涂料”。公开了类似于普通涂漆的单步通用步骤。将玻璃或聚乙烯载玻片很快地浸入某些疏水性n-烷基-pei(其中pei代表支化的750-kda的聚乙烯亚胺)聚阳离子的有机溶液中，然后蒸发溶剂。n-烷基-pei被物理吸附到表面。得到的聚阳离子涂覆的载玻片能够在接触时杀死所有遇到的细菌细胞，无论是革兰氏阳性人类病原体金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)，还是其革兰氏阴性兄弟大肠杆菌(escherichia coli.)。另见us2013/0110237。
10.一般认为，固定化的n-烷基化pei的抗菌作用依赖于n-烷基化引入正电荷和疏水性尾部的事实。据认为，正电荷与细菌的负电荷相互作用，而疏水性烷基尾部能够渗透到细胞质膜的疏水性磷脂层中。迄今为止，烷基化的这种双重作用被认为是不可或缺的。此外，据认为，烷基尾部应该包含至少六个c原子且最多约十六个碳原子，其杀生物活性随着ch2单元的数量增加而增加(lin et al.,biotechnol.prog.2002,18,1082-1086；zhao et al.,langmuir,2019,35(17),pp5779-5786)。
11.然而，目前基于(固定化)n-烷基化pei的可获得的涂层和涂覆方法的缺点包括烷基卤化物试剂的高成本和在碱存在下冗长的两步过程。


技术实现要素：

12.因此，本发明人着手研究是否可以通过改进传统的n-烷基化过程来避免至少一些上述缺点。与所有预期相反，令人惊讶地发现，将pei转化为杀菌材料并不需要对其进行n-烷基化。相反地，发现由于胺质子化引起的正电荷的作用对于抗菌作用至关重要。更具体地说，固定化pei的表面电荷密度可以通过仅添加含可极化阴离子的盐(例如碘化物)来增加到足以杀死细菌的值。
13.可以理解的是，相距太近的相邻氮原子因排斥力而不能全部质子化，因此pei在水性环境中无法实现完全质子化。不希望受理论束缚，阴离子发挥“屏蔽”作用，其中带正电的氮原子之间的排斥力降低，使得胺质子化的程度提高到足以具有杀菌活性的水平。
14.因此，本发明首次表明非烷基化(即非季铵化)的固定化多胺具有抗微生物性，并且对于基于qac的涂层而言质子化比烷基化更重要。相对于上文所述的一贯教导了与pei烷基化相关的两种现象，即正电荷和疏水性烷基尾部无疑对于杀菌作用是必不可少的现有技术，这一发现是非常令人惊讶。此外，pei类抗菌季铵化合物的首创者，klibanov团队报告了，当不进行烷基化步骤时，水中的季氨基密度为零1。在所有klibanov的研究中，烷基化是用己基溴和甲基碘在用于清除hbr和hi的碱的存在下进行的。甲基碘是一种较强的烷基化剂，并且能进一步提高电荷密度。
15.因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种为基底提供抗微生物涂层的方法，包括：提供涂覆有共价连接的多胺官能化聚合物的基底，其中多胺是非季铵化的(非烷基化的)；以及，在水性环境中通过使所述多胺官能化聚合物与“屏蔽组合物”接触来提高多胺官能化聚合物的电荷密度/质子化程度，其中所述屏蔽组合物为具有高极化率的至少一种盐的水性溶液形式。
16.如本文所用，术语“非季铵化的(多胺)”或“非烷基化的”是指不含任何季铵基团的(多胺)化合物，与本领域已知的qac或“聚季铵盐”不同。季铵基团由中心带正电的氮原子与四个取代基，特别是有机(烷基和/或芳基)基团组成。
17.本领域中还没有公开或暗示根据本发明的涂覆方法或经涂覆的基底。
18.gibney等人(macromol.biosc.vol.12,no.9,p 1279-1289)涉及非烷基化的直链和支链pei对溶液中细菌的影响。仅测量了mic(最低抑菌浓度值)。mic是指细菌在其下不能生长的杀菌剂浓度。它不是杀菌(杀灭)效果的指标。此外，在由可溶性细菌测量了溶液的mic值，这与根据本发明的聚合物固定化的pei是非常不同的。因此，溶液中的杀灭机制与共价包覆表面上的杀灭机制是完全不同的。
19.us2014/0112994涉及在医疗器械上形成抗微生物含金属lbl涂层的方法。该方法包括将至少一层具有-cooag基团的带负电荷的聚离子材料和至少一层带正电的聚离子材料以不特定的顺序交替地施加到医疗器械上。示例的聚阳离子聚合物可以包含伯氨基或仲氨基或者其盐，包括聚乙烯亚胺(pei)。然而，与本发明相反，lbl涂层不是共价连接到医疗器械上。
20.asri等人(adv.funct.mater.2014,24,346-355)描述了通过将双重n-烷基化pei(qac)栓系在超支化聚脲涂层上来制备形状自适应性的、接触式杀灭涂层。
21.yodovin-farber等人(j.of nanomaterials,vol.2010,p.1-11)描述了基于季铵聚乙烯亚胺(qa-pei)的纳米粒子的制备及其抗菌活性。qa-pei要么是单n-烷基化的，要么是双重n-烷基化的。
22.zaltsman等人(j.appl.biomater.funct mater 2016:14(2):e205-e211)涉及类似类型的qa-pei纳米粒子的制备，均涉及pei的n-烷基化。值得注意的是，其中指出高含量的大碳酸根离子可能掩盖季铵阳离子，导致抗菌性能降低。这与本发明形成了明显的对比，并且与本发明背道而驰，在本发明中，使用可极化的阴离子来增加基于pei的涂层的杀菌活性。
23.wong等人(biomaterials 31(2010)；4079-4087)涉及通过逐层自组装技由n-烷基化pei和聚阴离子得到的杀菌和杀病毒超薄膜。其中根本没有提及使用一种或多种具有高离子极化率的盐会赋予非季铵化pei杀菌活性。
24.wo2008/156636涉及能够杀死或灭活细菌孢子的抗微生物表面聚合物涂层，其包含：(1)超支化聚合物，具有(a)至少一个杂环n-卤胺端基，或(b)至少一个季铵端基，或(c)包含季铵和杂环n-卤胺端基中至少一个的混合物；或者(2)具有至少一个杂环n-卤胺端基的聚酰胺-胺型树状高聚物(polyamidoamine dendrimers)，或者(3)在每个重复单元具有乙内酰脲和n-烷基季铵基团的线性pei。根据wo2008/156636，pei的每个重复单元带有乙内酰脲和n-烷基季铵基团，这与涉及包含非烷基化(非季铵化)pei的抗微生物涂层的本发明相反。
25.在本发明的一个实施方式中，为基底提供抗微生物涂层的方法包括：提供共价涂覆有多胺官能化聚合物的基底；以及，使所述多胺官能化聚合物与水性盐溶液接触，所述水性盐溶液包含至少一种在37℃下测定的极化率α
37
为至少的盐。
26.离子极化率被定义为离子的诱导偶极矩与局部电场的比值。本领域中已经公布了在水性溶液中计算或预测离子极化率的多种方法。例如，参照li等人的研究(j.phys.chem.b,2017,121,6416-6424)，其测定了32种强电解质盐在水性溶液中的极化率。提出了通过测量折射率和体积的新的外推方法，并且发现该方法产生的结果与早期研究获得的理论结果更一致。由此得到的在37℃下的盐极化率值示出在li等人的表1(最后一栏)中以α
37
来表示。
27.因此，在一个实施方式中，用于本发明方法的屏蔽组合物是至少一种盐的水性溶液，其中该至少一种盐具有根据li等人(2017)的方法在37℃下测定的为至少的极化率α
37
。优选地，该水性溶液包含至少一种极化率α
37
为至少更优选为至少的盐。
28.如本领域所知(j.phys.chem.b 2017,121,6416-6424)，极化率与溶剂和的反射率和溶液有关，根据：
[0029][0030]
其中r是摩尔折射率，n是阿伏伽德罗常数，α
盐
表示以cgs为单位的溶剂化离子的极化率之和，或者可书写成另一种方式：
[0031][0032]
α
盐
可以通过测量摩尔折射率r来计算。根据clausius-mossotti方程，r与盐加入前后液体的折射率和体积有关：
[0033][0034]
在此，c
盐
是摩尔盐浓度，单位为mol/l；v
水
和n
水
分别是加入盐之前纯水的体积和折射率；v
溶液
和η分别是加入盐后，含水混合物溶液的体积和折射率。通过测量折射率，可以计算溶剂化离子的极化率之和，α
盐
。
[0035]
因此，在一个实施方式中，水性盐溶液包含至少一种在37℃下测定的极化率α
盐
为至少的盐，其中
[0036][0037]
其中r是摩尔折射率，n是阿伏伽德罗常数，α
盐
表示溶剂化离子的极化率之和，单位为cgs。
[0038]
一方面，本发明提供了一种为基底提供抗菌涂层的方法，包括：提供共价涂覆有多胺官能化聚合物的基底，其中所述多胺是非季铵化的(非烷基化的)；以及，使所述多胺官能化聚合物与水性盐溶液接触，所述水性盐溶液包含阴离子选自由br-、i-、clo
4-、so
42-、no
3-和
po
43
组成的组的至少一种铵盐、碱金属盐和/或碱土金属盐。
[0039]
优选的碱金属盐包括li

、na

和k

。优选的碱土金属盐包括mg
2
和ca
2
。不太优选贵金属盐，如ag-盐或au-盐。
[0040]
示例性的水性盐溶液是包含nai、ki、nabr、kbr、naclo4、kclo4、na2so4、k2so4、na3po4、k3po4、mg(no3)2、ca(no3)2、(nh4)2so4、nh4no3、zn(no3)2、nano3、nh4i、caso4和al(no3)3中的一种或多种的那些溶液。
[0041]
使用包含nai、k2so4、mg(no3)2、nh4i、nano3和/或zn(no3)2的水性盐溶液获得了良好的结果。
[0042]
提供可极化阴离子的盐的浓度并不是关键的。此外，胺官能化聚合物与屏蔽组合物接触的持续时间可以根据需要而变化。据发现，0.5至20小时的接触(屏蔽)时间是有效的，但也涵盖更短和更长的时间。尽管与屏蔽组合物的接触适宜在室温下进行，但是可以使用0℃至100℃范围内的任何温度。
[0043]
据观察，随着盐浓度的增加，屏蔽组合物的处理时间可以缩短。例如，使用1mm至100mm nai获得了高表面电荷密度和良好的杀菌活性。
[0044]
可使用本领域已知的方法测量屏蔽盐组合物增加胺的季铵化程度且进而增加电荷密度的效率。例如，荧光素法(tiller et al.,pnas,may 22,2001,vol.98,no.11,5981-5985)通过uv光谱测量带正电的氮对荧光素的吸收。该方法在水中进行，并且测量烷基化和质子化的氮原子。
[0045]
如本领域技术人员将理解的，本发明的方法适合用于将所有非季铵化的多胺官能化聚合物转化为杀生物聚合物。特别是，迄今为止，它是一种通过n-烷基化提供qac的聚合物。
[0046]
可用于本发明制备多胺官能化聚合物的示例性多胺包括以下物质：
[0047]
腐胺
[0048]
尸胺
[0049][0050]
热精胺
[0051]
嗜热性五胺
[0052]
嗜热性六胺
[0053][0054]
在优选的实施方式中，多胺官能化聚合物包含非季铵化的聚乙烯亚胺(pei)或由非季铵化的聚乙烯亚胺(pei)组成。基于pei的杀生物剂可有效抑制许多微生物的生长。如本文中所使用的，微生物包括单细胞和多细胞细菌、真菌、寄生虫、原生动物、古生菌、原生生物(protests)、变形虫、病毒、硅藻和藻类。其生长可被本发明的基于聚乙烯亚胺的涂层抑制的微生物包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、粪链球菌(streptococcus faecalis)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、氯生沙门氏菌(salmonella chloraesius)、伤寒沙门氏菌(salmonella typhosa)、大肠杆菌(escherichia coli)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、产气杆菌(aerobacter aerogenes)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(candida albicans)、黑曲霉(aspergillus niger)、闪光曲霉(aspergillus flares)、土曲霉(aspergillus terreus)、疣曲霉(aspergillus verrucaria)、出芽短梗霉(aureobasidium pullulans)、球毛壳菌(chaetomium globosum)、索状青霉(penicillum funiculosum)、叉指毛癣菌(trichophyton interdigital)、出芽短梗霉(pullularia pullulans)、木霉(trichoderm sp.madison p-42)、和cephaldascus fragans；金藻属(chrysophyta)、颤藻属(oscillatoria bometi)、圆柱形鱼腥藻属(anabaena cylindrical)、细硒藻属(selenastrum gracile)、胸膜球菌属(pleurococcus sp.)、角藻属(gonium sp.)、团藻属(volvox sp.)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、不动杆菌属(acinetobacter spp.)、假单胞菌属(pseudomonas spp.)、念珠菌属(candida spp.)、热带假丝酵母(candida tropicalis)、唾液链球菌(streptococcus salivarius)、齿突链球菌(rothia dentocariosa)、藤黄微球菌(micrococcus luteus)、藤黄八叠球菌(sarcina lutea)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)、产朊假丝酵母(candida utilis)、异常汉逊酵母(hansenula anomala)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、液化沙雷氏菌(serratia liquefasciens)、溶脱微球菌(micrococcus lysodeikticus)、酸土脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus acidoterrestris)、mrsa、巨大芽胞杆菌(bacillus megaterium)、脱硫弧菌(desulfovibrio sulfuricans)、变形链球菌
(streptococcus mutans)、科贝蒂亚码头(cobetia marina)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)、普通变形杆菌(proteus vulgaris)、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)、胚牙乳杆菌(lactobacillus plantarum)、太平洋盐单胞菌(halomonas pacifica)、缘管浒苔(ulva linza)和艰难梭菌(clostridium difficile)。
[0055]
优选地，本发明提供了一种为基底提供抗微生物(例如抗菌)涂层的方法，包括：提供涂覆有非烷基化pei的基底；以及，通过使pei涂覆的基底与如上文所限定的水性屏蔽组合物接触来提高pei的电荷密度。
[0056]
例如，使pei涂覆的基底与水性屏蔽组合物接触，其中屏蔽组合物包含nai、ki、nabr、kbr、naclo4、kclo4、na2so4、k2so4、na3po4、k3po4、mg(no3)2、ca(no3)2、(nh4)2so4、nh4no3、nh4i、mgso4、caso4、zn(no3)2、nano3和al(no3)3中的一种或多种。
[0057]
本发明的一个主要目的是开发一种对基底的表面进行涂覆以使表面具有抗微生物性的改进方法。这样的表面可以以生理相容的方式基本且持久地保持没有包括细菌(例如，球菌cocci)在内的微生物，而不会因此改变经处理的材料的机械性能。因此，本发明还提供了一种对基底的表面进行涂覆以使表面具有抗微生物性的方法，包括：提供涂覆有pei官能化聚合物的基底；以及，通过使所述pei官能化聚合物与能够降低pei胺的带正电氮原子之间排斥力的屏蔽组合物接触来提高pei官能化聚合物的电荷密度/质子化程度。
[0058]
待涂覆的基底可以是任何类型的基底、制品、物体或材料。在现代医学中，外源性制品的频繁使用使得它们与组织或体液发生中期或长期接触。实例是植入物，如起搏器、支架和假体；以及缝合材料、引流软管和导管。这类制品可尤其由金属、陶瓷和/或聚合物组成。
[0059]
在一个实施方式中，基底是医用级的材料，优选选自由医用级聚乙烯、聚二甲基硅氧烷弹性体(pdms)、聚氨酯或聚氯乙烯(pvc)组成的组。
[0060]
在另一个实施方式中，基底是与哺乳动物身体能够生物相容的金属，优选选自由不锈钢合金、钛、钛合金、钽或钽合金组成的组。
[0061]
pei官能化聚合物涂层以共价(固定)方式与基底的至少一部分外表面结合。由于杀生物性化合物的浸出通常是不希望的，所以聚合物涂层与基底的至少一部分表面共价结合。
[0062]
超支化聚合物(hbp)特别适用于特殊涂层。由于端基众多，它们允许引入各种各样的(生物活性)功能，例如杀生物性。涂层在表面上的锚定可以通过物理吸附或共价结合来实现。虽然物理吸附是常见的应用技术，但涂覆层在苛刻的应用条件可能被去除。相比之下，根据本发明的共价键连接的涂覆层可以更好地耐受苛刻的条件。因此，在优选的实施方式中，共价连接的聚合物涂层包括超支化涂层。超支化聚合物可以通过链式聚合或分步聚合来制备。制备hbp最重要的途径是通过使a2和b
x
单体聚合或使用ab
x
单体。a和b代表能够相互反应的两种不同官能团，x是单体中b基团的数目。
[0063]
在一个具体方面，本发明提供了一种为基底提供抗菌涂层的方法，包括：提供涂覆有pei官能化的超支化聚脲的基底；以及，通过使经涂覆的基底与屏蔽组合物接触来提高胺官能化涂层的电荷密度，所述屏蔽组合物能够降低所述胺中带正电氮原子之间的排斥力。
[0064]
可以通过使用本领域已知的方法获得pei官能化的超支化聚脲。例如参见asri等
人的adv.funct.mater.2014,24,346-355。它可以包括使ab2单体的聚合，该ab2单体包含仲胺作为a基团和包括封端异氰酸酯作为b基团。
[0065]
例如，ab2单体具有以下通式
[0066][0067]
其中
[0068]
r1和r2是脂肪链(ch2)m和(ch2)n，其中m和n是3至15，优选3至8的整数，和
[0069]
l1和l2是封端基团，优选选自己内酰胺、苯酚、肟、三唑和丙二酸酯。
[0070]
ab2单体的聚合可以直接在(经活化的)表面上进行，例如钛或钛合金表面上进行。或者，类似于wo2016/043584中公开的内容，它可以包括：使ab2单体“预聚合”成低分子量聚脲，然后使该低分子量聚脲与表面接触。该表面优选提供有偶联剂。该表面可以在与偶联剂接触之前被活化。
[0071]
因此，在一个实施方式中，提供涂覆有胺官能化超支化聚脲的基底的步骤包括：
[0072]
a)提供一表面，所述表面可选择地包含反应性羟基；以及使偶联剂接枝到所述(羟基化的)表面上；
[0073]
b)使ab2单体缩聚以获得数均分子量为至少1500da的低分子量聚脲，其中所述ab2单体包含仲胺作为a基团和封端异氰酸酯作为b基团；和
[0074]
c)使所述低分子量聚脲与接枝有偶联剂的表面接触，以共价固定所述聚脲；以及，可选地在ab2单体的存在下，通过加热使缩聚继续进行以获得超支化的聚脲涂层。
[0075]
可以使用各种类型的偶联剂，包括先前在wo2016/043584中公开的2-氧代-n(3-三乙氧基甲硅烷基)丙基)氮杂环庚烷-1-甲酰胺。
[0076]
然而，随着如下式的新型多巴胺类偶联剂的开发，在涂层强度方面获得了非常好的结果：
[0077][0078]
这种偶联剂通过多巴胺或其盐，优选多巴胺
·
hcl与羰基双己内酰胺(cbc)反应来容易地合成。在一个实施方式中，本发明提供了用于提供n-(3,4-二羟基苯乙基)-2-氧代氮杂环庚烷-1-甲酰胺(cabida)的方法，包括：在碱的存在下，在合适的溶剂中使多巴胺或其盐与cbc反应。优选的溶剂是沸点为80℃或更高，优选100℃或更高的极性溶剂，并且显示出良好的多巴胺盐溶解性。例如，溶剂包含至少10w％的多巴胺盐。特别优选的溶剂是dmf。优
选的碱包括三甲胺。在一个具体方面，该方法包括在氮气气氛、约80℃下，在dmf中使化学计量量的cbc、多巴胺盐酸盐和三甲胺反应。
[0079]
本发明还提供了化合物n-(3,4-二羟基苯乙基)-2-氧代氮杂环庚烷-1-甲酰胺，在本文中称为cabida。
[0080]
另一个实施方案涉及cabida作为偶联剂的用途，优选在(i)无机固体基底与(ii)有机基底之间的界面区域中作为偶联剂的用途，所述无机固体基底例如为玻璃、金属或矿物基底，所述有机基底例如为有机聚合物、涂层或粘合剂。如下文所示例的，发现，与先前在wo2016/043584中公开的2-氧代-n(3-三乙氧基甲硅烷基)丙基)氮杂环庚烷-1-甲酰胺相比，该新型偶联剂在潮湿条件下表现出增加的稳定性。
[0081]
在一个实施方式中，本发明提供了cabida在(i)固体基底与(ii)抗菌涂层之间的界面区域中作为偶联剂的用途，其中所述固体基底例如为玻璃基底、(医用级)聚合物基底、金属基底或矿物基底，所述抗菌涂层优选为如上所限定的包含非烷基化pei的抗菌涂层。
[0082]
本文还提供了一种为固体基底提供涂覆材料的方法，该涂覆材料优选为聚合物涂层，更优选为抗微生物或杀菌涂层，该方法包括：使基底的表面与cabida偶联剂接触，以调节固体表面和涂层之间的结合。
[0083]
待涂覆的基底可以是任何类型的基底、制品、物体或材料。在现代医学中，外源性制品的频繁使用使得它们与组织或体液发生中期或长期接触。实例是植入物，如起搏器、支架和假体；以及缝合材料、引流软管和导管。这种制品尤其可以由金属、陶瓷和/或聚合物组成。
[0084]
在一个实施方式中，基底是医用级的材料，优选自选自由医用级聚乙烯、聚二甲基硅氧烷弹性体(pdms)、聚氨酯和聚氯乙烯(pvc)组成的组。
[0085]
在另一个实施方式中，基底是与哺乳动物身体能提生物相容的金属，优选选自由不锈钢合金、钛、钛合金、钽和钽合金组成的组。
[0086]
在一个具体方面，本发明涉及一种为固体基底或其至少一部分表面提供抗菌涂层的方法，包括使基底与cabida偶联剂接触以获得接枝有偶联剂的表面，随后共价锚定抗菌涂层，例如超支化聚合物，其可以被多胺官能化，如非季铵化或季铵化的pei。
[0087]
偶联剂可以简单地以偶联剂溶液的形式与至少部分表面接触(例如通过浸渍)，随后升高温度以使反应继续进行。表面可能是经活化的或未经活化的。例如，将经活化的表面在偶联剂的醇(例如meoh)溶液中浸渍5分钟至15分钟，然后在约100℃至120℃下保持至少1小时，优选至少2小时，以允许偶联剂的粘附。优选地，在超声下通过洗涤，例如在乙醇中洗涤来除去未反应的偶联剂。
[0088]
在具体实施方式中，在室温下，用氧化剂如naio4处理cabida偶联剂，由此提高粘附性。通过将ph提高到8以上，可以获得额外的粘附效果。可选地，除了前面提到的方法之外，可以加入二胺，如1,6-己二胺。
[0089]
在优选实施方式中，随后，使提供有cabida的表面与聚合物反应，该聚合物通过引入各种各样的(生物活性)功能，例如杀生物性而容易被官能化为特殊涂层。特别感兴趣的是包括超支化聚脲的超支化聚合物，如上所述。例如，为了获得具有抗菌性能的涂层，将抗菌性官能团偶联到超支化涂层上。这可包括在超支化(聚脲)涂层上固定疏水性、可选的n-烷基化的多胺，例如具有抗菌性能的聚乙烯亚胺(pei)。抗菌性pei可以通过常规途径获得，
涉及用线性、环状或支链c5-c15烷基链，或者芳族化合物(如苄基)进行n-烷基化。然而，优选使用上文提及的新方法，其包括使用能够降低所述胺中带正电的氮原子之间的排斥力的水性盐溶液替代n-烷基化来提高pei质子化的程度，并进而提高杀生物活性。
[0090]
本文还提供了能够通过本发明的方法得到的涂覆有抗菌涂层的基底。该方法涉及使用屏蔽组合物、cabida偶联剂和/或与本文公开的蛋白质类物质的额外接触。
[0091]
固体基底是医疗器械或植入物，优选选自由导管、假体、矫形植入物或心血管植入物组成的组。示例性医疗器械包括：(1)手术中使用的体外器械，例如血液氧合器、血泵、血液传感器、用于输送血液的管道以及与接触血液然后使血液返回到患者体内的那些；(2)植入人体或动物体内的假体，例如血管植入物、支架、起搏器导线、心脏瓣膜以及植入在血管或心脏中的那些；(3)用于临时在血管内使用的器械，例如导管、导丝以及被放置在血管或心脏中用于监测或修复的那些。
[0092]
本技术涵盖覆盖整个基底的连续涂层，还涵盖包括不连续的局部涂层，或者局部涂层和连续顶部涂层的组合。本发明的基底的特征在于显示高机械强度的强粘附性抗菌涂层。
[0093]
基底例如是医疗器械或植入物，例如导管或假体。在一个实施方式中，植入物是矫形植入物或心血管植入物，例如选自由心脏瓣膜、异体血管壁支架和全人工心脏植入物组成的组。在另一个实施方式中，植入物选自由耳道管、气管插管、通气引流管、耳蜗植入物和骨导听力辅助器械组成的组。
[0094]
值得注意的是，与传统的n-烷基化季铵化pei涂层相比，通过用可极化盐处理非季铵化pei获得的抗菌涂层具有更亲水的特性。由于亲水性涂层的毒性低于疏水性涂层的毒性，并且还可以促进细胞生长，因此这种性质对于使用中暴露于细胞或组织中的经涂覆的植入物或任何其它基底或器械特别有利，包括体外和体内应用。
[0095]
根据本发明的抗微生物涂层可以设置有对于体外和体内应用，特别是对于涂层将暴露于(哺乳动物)细胞或组织的应用有利的一种或多种额外组分。例如，涂层可设置有降低因电荷密度对周围细胞或组织的不利影响的组分，同时不牺牲杀菌效果。
[0096]
在一个实施方式中，肽或蛋白质适用于在接触或围绕杀菌涂层或经涂覆的基底(例如生物医学植入物)的区域中促进或支持组织稳态和/或生长。因此，在本发明的一个具体方面，用水性盐溶液处理多胺官能化聚合物以获得抗微生物涂层的步骤之后，使杀菌涂层与一种或多种蛋白质物质接触，使得“保护性”蛋白类物质被涂层吸收。
[0097]
因此，在一些实施方式中，本发明提供了一种强粘附性的抗微生物涂层，其显示出高机械强度并且具有与(哺乳动物)细胞或组织良好的相容性。
[0098]
优选的蛋白类物质包括无毒的肽和蛋白质，例如天然存在于哺乳动物(优选人)中的一种或多种肽，蛋白质或其片段。还涵盖合成肽或蛋白质。优选使用一种或多种经纯化的蛋白质。
[0099]
在一个特定的方面，蛋白类物质是富含脯氨酸的蛋白质，例如由腮腺和颌下腺产生的唾液蛋白质中的富含脯氨酸的蛋白质(prp)家族中的一员，并且构成人类唾液总蛋白质的近70％。碱性和糖基化prp由四个基因prb1-prb4编码，酸性prp由两个基因prh1和prh2编码。它们前体蛋白(～150个氨基酸)的形式来合成，大部分在在分泌前被裂解以在唾液中产生20多种prp。本领域已经表明，在含有大量蛋白质的唾液存在下，用n-烷基化pei官能化
的超支化涂层的杀生物功效并没有降低(dong et al.langmuir,2019,35,43,p.14108-14116)。然而，没有提到或暗示这将如何影响细胞或组织稳态。
[0100]
在另一具体方面，使用一种或多种哺乳动物血清蛋白，包括纤连蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-巨球蛋白、铜蓝蛋白、转铁蛋白和血清白蛋白。例如，使涂层与人或牛血清白蛋白接触。如本文中所使用的，除非上下文清楚地另外指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”旨在也包括复数形式。术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。应当理解的是，术语“包括(comprises)”和/或“包括(comprising)”规定了所阐述特征的存在，但不排除一个或多个其他特征的存在或增加。
[0101]
本发明由以下非限制性实施例来示例说明。
附图说明
[0102]
图1：多巴胺类的偶联剂n-(3,4-二羟基苯乙基)-2-氧代氮杂环庚烷-1-甲酰胺(cabida)的1h nmr谱图。
具体实施方式
[0103]
实施例1：偶联剂cabida的合成。
[0104]
将化学计量量的羰基双己内酰胺(cbc；1.419g，5.631mmol)、多巴胺盐酸盐(1.068g，5.631mmol)、三甲胺(0.784ml，5.631mmol)和10ml dmf加入装配有回流冷凝器的圆底烧瓶中，并在氮气气氛、80℃下搅拌24小时。冷却溶液后，通过加入50ml cacl2水性溶液(5wt％)使偶联剂沉淀，然后溶解在10ml chcl3中。除去水性层后，用50ml cacl2水性溶液(5wt％)洗涤有机层两次，用50ml饱和食盐水溶液洗涤一次。除去水性层后，有机层用无水硫酸镁(mgso4)干燥。干燥后，滤出mgso4，减压下在旋转蒸发仪中完全除去溶剂(产率97％)。图1所示的1h nmr谱图证实了cabida的结构。
[0105]
反应过程示出在反应路线1中。
[0106][0107]
反应路线1：多巴胺类偶联剂的制备。
[0108]
实施例2：ab2分子和超支化聚脲聚合物(hbp)的合成
[0109]
将羰基双己内酰胺(cbc，5.805g，23mmol)、双(六亚甲基)三胺(2.495g，11.5mmol)和10ml二甲苯加入装配有回流冷凝器的圆底烧瓶中，并在氮气气氛、80℃下搅拌加热8小时以得到ab2单体。接着，使温度升高至145℃来反应1小时以引发预聚合，产生1500da的数均分子量。
[0110]
将溶液冷却至室温，加入5ml二甲苯，用cacl2水性溶液(5wt％)萃取三次，用饱和食盐水溶液萃取一次。除去水性层后，有机层用无水硫酸镁(mgso4)干燥。干燥后，滤出mgso4，减压下在旋转蒸发仪中完全除去溶剂，得到蜡状固体。反应过程示出在反应路线1中。
[0111][0112]
反应路线2：制备ab2单体和超支化聚合物(hbp)的示意图。
[0113]
实施例3：钛基底的预处理
[0114]
将钛样品(ti，10mm
×
10mm
×
1mm)在正己烷中于超声浴中分散10分钟，随后在40ml的10m hcl溶液中超声浸渍30分钟，随后在40ml超纯水(milli-q water)浸渍中并超声处理30分钟，由此来清洗钛样品。然后，用丙酮冲洗钛样品，并在室温下干燥。接下来，在80℃下，于25％nh4oh、30％h2o2和h2o(1:1:5v/v)的混合物中氧化ti样品20分钟。在此处理之后，用milli-q水洗涤ti样品，然后用丙酮洗涤，室温干燥。
[0115]
实施例4：偶联剂的施用
[0116]
a)将经预处理的ti基底(实施例3)浸渍在偶联剂(实施例1)在乙醇(3wt％)中的溶液中10分钟，然后在真空炉中于110℃下加热2小时。在室温下用乙醇通过超声处理样品20分钟来除去未反应的偶联剂，并干燥。
[0117]
b)可替代地，将经预处理的ti基底(实施例3)浸渍在ph为7.0的含cabida和naio4(摩尔比2:1)的pbs溶液中，并在37℃下温育过夜，然后用乙醇超声洗涤10分钟，并进行干燥。
[0118]
实施例5：超支化聚合物的固定
[0119]
将hbp的溶液(实施例2；5wt％，在乙醇中)旋涂(2000rpm，60秒)在覆盖有偶联剂的ti片上(实施例4a)。然后，在氮气气氛中于145℃下，加热样品2小时。在115℃下通过在dmf中提取2小时来除去未锚定的聚合物。接下来，在室温下于甲醇中超声处理经涂覆的ti片20分钟，并进行干燥。
[0120]
实施例6：用聚乙烯亚胺(pei)官能化
[0121]
将100μl pei溶液(20wt％，在甲醇中)滴在经涂覆的钛样品(实施例5)上并进行旋涂(2000rpm，60秒)。在氮气气氛中于125℃下进行锚定反应3小时。在室温下于甲醇中通过超声处理20分钟来除去未反应的pei，并进行干燥。
[0122]
实施例7：提高pei的电荷密度
[0123]
在室温下，将经pei涂覆的样品(实施例6)在含不同类型盐的几种水性溶液中浸渍2小时至20小时(见表1)，随后用纯水洗涤3次，并在纯水中超声10分钟。根据荧光素法(实施例8)测量所得电荷密度，并表示为相对于浸渍前电荷密度的百分比增加。此外，以表皮葡萄球菌(s.epidermidis)作为细菌菌株在petrifilm检测中，测试该多个样品的抗菌性能(实施例9)。
[0124]
表1.暴露于含不同类型和浓度的盐的水性溶液后，经pei涂覆的钛基底的电荷密度和抗菌性能。
[0125][0126]
#
li等人(j.phys.chem.b,2017,121,6416-6424)，他们在表1的最后1列中确定在37℃下以α
37
表示的盐极化率值。
[0127]
nd：未测定
[0128]
实施例8：pei的两步n-烷基化(比较例)
[0129]
在配备有回流冷凝器的圆底烧瓶中，在90℃下，通过将含栓系pei样品(实施例6)的涂层在20ml c6h
13
br中浸渍4小时来进行n-烷基化(季铵化)。接下来，加入在25ml叔戊醇中的1.07g质子海绵(1,8-双(二甲氨基)萘)。使反应持续3小时。用甲醇冲洗经涂覆的样品，随后在室温下超声处理20分钟。对获得的涂层进行干燥，并在氮气气氛下置于圆底烧瓶中进行第二次烷基化步骤。在配备有回流冷凝器的圆底烧瓶中，在42℃下，将样品在20ml ch3i浸渍24小时。用甲醇冲洗经涂覆的样品，随后在室温下超声20分钟，然后进行干燥并储存在氮气气氛中的瓶中。由于两次烷基化步骤，电荷密度增加了109％。如实施例中所记载的，用表皮葡萄球菌(s.epidermidis)细菌测定抗菌性能，细菌全部被杀死。
[0130]
实施例9：电荷密度测量
[0131]
在室温下，将样品在15ml 1wt％荧光素(二钠盐)的软化水溶液中浸渍10分钟，用50ml水洗涤四次，然后在室温下在50ml水中超声处理5分钟，以除去未与阳离子物质络合的任何染料，并用气流进行干燥以除去残余水。接下来，将样品置于10ml 0.1wt％的十六烷基三甲基氯化铵的软化水中，并在室温下超声10分钟以使络合的荧光素染料解吸。随后，加入10v/v％的ph8的100mm磷酸盐缓冲液以使总体积为11ml，并在501nm下进行uv/vis测量(spectra max m2 uv/vis分光光度计)。根据steven roest,henny c.van der mei,ton j.a.loontjens,henk j.busscher,in applied surface science 356(2015)325-332中描述的方法计算电荷密度。结果示出在表1中。
[0132]
实施例10：利用petrifilm检测的抗菌性评价
[0133]
首先，用来自冷冻存储液(7v/v％dmso)的表皮葡萄球菌(s.epidermidis)atcc 12228在血琼脂平板上划线，并在37℃下生长过夜。将一个菌落接种在10ml胰蛋白胨大豆肉汤(tsb，oxoid，basingstoke，uk)中，并在37℃下温育24小时。使用该培养物接种200ml tsb的主培养物，该主培养物在37℃下温育16小时。通过以5000g在10℃下离心5分钟收获细菌，随后用10mm ph 7.0的磷酸钾缓冲液洗涤两次。
[0134]
通过petrifilm检测来评估涂层杀死粘附的葡萄球菌(staphylococci)的能力。所采用的petrifilm检测是基于在营养丰富的条件下与涂层接触后存活下来的生物的培养。petrifilm菌落总数计数板(3m microbiology，st.paul，mn，usa)由两层膜组成：底膜，包含标准营养物、冷水胶凝剂和便于菌落计数的指示染料；顶膜，将样品封闭在系统内。将含有胶凝剂的底膜首先用1ml无菌软化水溶胀40分钟，并在使用前转移到透明的顶膜上。接下来，将不同浓度的10μl细菌悬浮液置于经涂覆的载玻片(1cm
×
1cm)上。在关闭中间存在一载玻片的petrifilm系统后，葡萄球菌悬浮液分布在样品的整个表面区域，从而能够根据样品的尺寸和悬浮液中的细菌浓度计算每平方厘米的细菌挑战(bacterial challenge)。petrifilm在37℃温育48小时后，计算cfu的数值。作为对照，将10μl细菌悬浮液接种在之间没有样品的petrifilm上。
[0135]
实施例11：共价连接在pdms上的抗菌涂层
[0136]
将pdms片(2
×
2.5cm2)置于100w的空气等离子体设备(femto system，来自diener-electronic，德国)中1分钟至2分钟(1.7
×
10-1
毫巴的空气)。在室温下，将获得的亲水性pdms片在cabida在无水乙醇中的3v/v％溶液中浸渍10分钟，然后置于真空炉中，在真空下于110℃加热2小时。在室温下在超声浴中通过用乙醇洗涤pdms片20分钟来除去未反应的偶联剂，并在真空下干燥和氮气下储存。
[0137]
将pdms载玻片浸没在超支化聚合物的溶液(5wt％乙醇)中，随后进行旋涂(2000rpm，60秒)。在145℃下加热2小时后，偶联剂被固定，在氮气气流下，使超支化聚合物在表面上进行连续聚合。在115℃下，通过在200ml dmf中提取2小时来除去未锚定的聚合物。接下来，在室温下，将pdms片在无水乙醇中超声处理20分钟，干燥并在氮气下储存。
[0138]
将聚乙烯亚胺(pei)的水中的溶液(50wt％)冷冻干燥过夜(mw＝750kda)，并将残余物以20wt％浓度溶解在甲醇中。将200μl的pei溶液滴在覆盖有超支化聚合物的样品上并进行旋涂(2000rpm，60秒)。在氮气、125℃下，在铝板上进行锚定反应3小时。在室温下通过45分钟的超声波浴用甲醇除去未反应的pei，并在氮气下干燥。
[0139]
在室温下，将经pei涂覆的pdms片在10mmol/l nai溶液中分别浸渍2小时、8小时和20小时，然后用纯水洗涤3次，并在纯水中超声10分钟。根据荧光素法测量所得电荷密度，并表示为相对于浸渍前电荷密度的百分比增加。
[0140]
浸渍20小时后，样品的电荷密度增加了30％。用表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)测试浸泡2小时和8小时后的样品的抗菌性能，如实施例10所述。没有观察到存活的细菌。
[0141]
实施例12：cabida显示出改进的粘附性
[0142]
如实施例4b所述，使用naio4途径将cabida偶联剂施加到钛基底上。将先前在wo2016/043584中公开的硅氧烷偶联剂2-氧代-n(3-三乙氧基甲硅烷基)丙基)氮杂环庚烷-1-甲酰胺(cabites)用作比较例。在室温下，将样品在水中浸渍4天。浸泡前后测得的接触角示出在表2。
[0143]
表2.覆盖有cabida或cabites的钛样品的接触角
[0144]
偶联剂浸渍前浸渍4天后cabida38.837.8cabites71.046.9
[0145]
cabida的接触角保持不变，而cabites的接触角从71.0度下降到46.9度，表明cabites在潮湿条件下的稳定性降低。
[0146]
参考文献
[0147]
1 bactericidal properties of flat surfaces and nanoparticles derivatized with alkylated polyethylenimines,jian lin,shuyi qiu,kim lewis,and alexander m.klibanov,biotechnol.prog.,2002,vol.18,no.5,1082-1086.
[0148]
2 plos,unusual salt and ph induced changes in polyethylenimine solutions,kimberly a.curtis,danielle miller,paul millard,saswati basu,ferenc horkay,preethi l chandran,september 29,2016,1-20.
[0149]
3 a shape-adaptive,antibacterial-coating of immobilized quaternary-ammonium compounds tethered on hyperbranched polyurea and its mechanism of action
[0150]
lia a.t.w.asri,mihaela crismaru,steven roest,yun chen,oleksii ivashenko,petra rudolf,joerg c.tiller,henny c.van der mei,ton j.a.loontjens,and henk j.busscher,adv.funct.mater.2014,24,346
–
355.
[0151]
4 woongmo sung,zaure avazbaeva,and doseok kim,salt promotes protonation of amine groups at air/water interface,j.phys.chem.lett.2017,8,3601-3606.
[0152]
5 antimicrobial surfaces,joerg c.tiller,advances in polymer science 2010,240(1):193-217.
[0153]
6 permanent,non-leaching antibacterial surfaces—2:how high density cationic surfaces kill bacterial cells,hironobu murata,richard r.koepsel,krzysztof matyjaszewskic,alan j.russell,biomaterials 28(2007)4870
–
4879.
[0154]
7 macromol biosci.2012；12(9):1279
–
1289,poly(ethylene imine)s as antimicrobial agents with selective activity,katherine gibney,iva sovadinova,analette i.lopez,michael urban,zachary,ridgway,gregory a.caputo,and kenichi kuroda.
[0155]
8 charge properties and bacterial contact-killing of hyperbranched polyurea-polyethyleneimine coatings with various degrees of alkylation steven roest,henny c.van der mei,ton j.a.loontjens,henk j.busscher,applied surface science 356(2015)325
–
332.